第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!" #$# # %&'& & 基础研究 缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定 贺 赛 郑见宝 孙学军 陈南征 周培华 贾蓬勃 魏光兵 王 晖 姚建锋 禄韶英 西安交通大学医学院第一附属医院普通外科 陕西西安 $ 摘要 目的 检测本课题组已构建的

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 基础研究 缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定 贺 赛 郑见宝 孙学军 陈南征 周培华 贾蓬勃 魏光兵 王 晖 姚建锋 禄韶英 西安交通大学医学院第一附属医院普通外科 陕西西安 $ 摘要 目的 检测本课题组已构建的缺氧诱导的 %&'% 基因启动子 '&%&'% 调控的基因表达载体调控元件的肿瘤特异性和对缺氧诱导的反应性 方法 %% 法检测不同浓度 ( 对 (* 细胞活力以及增殖的影响 收集前期已包装成功的缺氧反应元件 +,-#.!.####!.'& 和人端粒酶催化亚单位启动子 %&'% 联合调控 )/0 表达的慢病毒表达载体 (*0'&%&'%)/01() 病毒液 感染 %&'% (* 细胞及 %&'% 细胞 细胞免疫组化法验证该治疗载体的靶向性 复苏前期筛选的稳定表达 ) 的 (* 细胞 )(* 用缺氧模拟剂 模拟缺氧微环境 #.#-! 和 '%2)' 分别检测缺氧调控下 )/0 的表达水平 结果 结肠癌细胞株 (* 在不同浓度 环境下随缺氧时间的延长 细胞活力及增殖均受到抑制 在高浓度 ( 作用下抑制效果更加明显 ) 病毒成功感染 %&'% (* 细胞 而在 %&'% 细胞中不表达 #.#-! 和 '%2)' 证实缺氧可上调 )(* 细胞中 )/0 蛋白和 '3 的表达 且在 ( 作用 其蛋白表达量最高 结论 缺氧微环境可明显上调 %&' % 靶向性的治疗载体 ) 中抑癌基因 )/0 的表达 关键词 缺氧 %&'% 靶向性 抑癌基因 )/0 基因治疗载体 缺氧反应元件 '& 中图分类号 45 文献标志码 文章编号 $56$ $!"#$%$&#'!%%! % &7,+8&39+,!,7:3 0"#"!)&3 3,!;#!8: 2#+",92#! &",!+!3 "+9+,!#!(:7,+! /#,-#!#!#-,7"-#-#1+-.++,#.+, #+,70+,!9+,!:!+<#-.+0+,!$)+!, ## " ## (") *"#"# +,-" -,& #.%/""."" ""#) " /"#")! "& #)#.%*+,-*-,*(*0.1+#-, "# * +,-#/# ")##" " /##"&+ /#"-,.%#"-, +*# -,*## /") # &.%#/)+ +.%/)"&+ #/") " )",*, / "(") &1 ") "-,.%#/)") ### ##". && -,.% # /#" / #)#+ /-, +*#/#"&)",*, #" ( ",'1+.%# /#" / # /.& + ## 收稿日期 **5 修回日期 **$ 基金项目 国家自然科学基金资助项目 '&555$56 陕西省科学技术研究发展计划项目 '&**6 $") ''$##0"'&555$56") $#*#,# "($#'&**6 通讯作者 孙学军 教授 &-* &&"&# 作者简介 贺赛 65* 男 汉族 硕士生 主要从事消化系肿瘤的基础与临床研究 &-*&$&&"&# 网络出版时间 **$= 网络出版地址 ///&#&#"$&66&,&$&&&

2 $$ 西安交通大学学报 医学版 第 卷 (-,*## #+") *"#"# +,-"-,-,.%#& () * -,*##( # +,- 设计具有靶向性和安全性的基因转运系统 寻找肿瘤特异性转录调控元件 从而使外源基因能够持续 稳定和特异表达是目前肿瘤基因治疗的主要研究 方向之一 肿瘤特异性 %&'% 启动子能在转录水平上驱动下游基因的表达 高效 选择性地在肿瘤组织中激活其后的外源基因的转录 从而实现治疗基因在肿瘤中的选择性表达 避免损伤周围正常组 织 为了进一步提高该启动子在肿瘤组织中的表达特异性并增强其活性 根据实体瘤组织局部的缺氧微环境特点以及缺氧反应元件 '& 可使异源启动 $5 子在缺氧微环境下激活的特性 本课题组前期构建完成了 个拷贝的 '& 和 %&'% 双靶向联合调控元件 调控抑癌基因 )/0 表达的慢病毒表达载体 ) 并完成病毒包装及滴度测定 本研究利用 ) 病毒感染 %&'% (* 细胞及 %&'% 细胞 并在缺氧和常氧环境下检测 )( * 细胞中 )/0 的表达 研究缺氧环境对治疗载体 ) 表达的调控作用 为利用缺氧微环境强化肿瘤的靶向性基因治疗提供实验依据 并为下一步的细胞实验奠定了基础 + 材料与方法 ++ 材料 实验组细胞 %&'% 人结肠癌细胞株 (* 对照组细胞 %&'% 人肾小管上皮细胞株 以及慢病毒表达载体 ) 病毒液均由本课题组前期保存 胎牛血清和 /& 培养基购自 >) 公司 逆转录试剂盒及 2)' 所用试剂和酶均购自 %,,', 公司 /3,-?#- 系广州东盛科技有限公司产品 二氯化钴 相对分子质量 6 琼脂糖和四唑氮蓝 %% 购自 7+, 公司 哺乳动物细胞蛋白裂解液 '2 及 >) 蛋白定量试剂盒均购自北京中杉生物科技有限公司 )/0 多克隆抗体购自 &++. 公司 '3 提取试剂盒是 2-#, 公司产品 +,-. 法检测 - 对结肠癌细胞株 /0 生长增殖的影响 取对数生长期的 (* 细胞以 个 孔接种 块 6$ 孔板 培养过夜 每块 6$ 孔板均加入不同浓度 ( 的 溶液 各浓度设置 个副孔 作用 后分别终止反应 每孔加入 ( %% 溶液 ( 继 续培养 小心吸弃上清液 每孔内加入 ( 二甲亚砜 /7 振荡 +! 溶解沉淀 酶标仪在 6! 下读取吸光度 值 上述实验重复 次 绘制细胞在不同浓度 作用下的生长曲线 不加 的肿瘤细胞作为空白对照 +,1 免疫细胞化学法检测慢病毒载体 表达 将清洁 灭菌处理的盖玻片铺于 孔板底部 将处于对数期生长的 %&'% (* 细胞及 %&'% ( 接种于板内 待细胞长成单层后 5 %:( 及感染效率 用 ) 慢病毒液 ( 孔感染 (* 与 细胞 继续培养 5 取出盖玻片 用 ( 2>7 冲洗 遍 再以 ( 多聚甲醛固定 +!%-+!0 固定 +! 使用 1( 兔抗人一抗 = 7+,A 孵育过夜 加入 = 生物素化羊抗兔二抗 A 孵育 +! 然后滴加 7>) 试剂 A 孵育 +! 最后用 /> 显色 光镜下观察 +, *' 检测缺氧微环境调控下细胞内 - 蛋白的表达水平 复苏前期筛选的稳定表达 ) 的 (* 细胞 )(* 传代后随机分为缺氧组和常氧组 缺氧组用不同浓度 ( 的 溶液模拟缺氧环境培养 常氧组及正常 (* 细胞在普通培养基中培养 用上述实验获得的 有效浓度作用 )(* 细胞 $ 常氧组作为对照 ' 2 裂解法提取上述细胞总蛋白 >) 法测蛋白浓度 凝胶加样缓冲液混合 A +! 变性蛋白 ( 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 转 2*/1 膜 *+! 以含 ( 脱脂奶粉的 %>7% 室温封闭 加 )/0 一抗 =,+! 一抗 =A 过夜 二抗 = 室温 &)( 显影 凝胶成像系统扫描 各组实验重复 次 +,# 检测缺氧微环境调控下细胞内 - &2 的表达水平 实验分组同 缺氧组加入 溶液 使用浓度依据步骤 结果 培养 用 %-+; 按说明书要求提取细胞 '3 并逆转录为 /3 以,+! 为内参照 根据 #!,!? 中 )/0 基因片段序列 3$ 设计如下引物并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 用 2)' 方法扩增 )/0 其上游引物 B)))%)%%)

3 期 贺 赛 郑见宝 孙学军 等 缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定 $ %)%))%))%B 下游引物 B%))%)%%)% %%%))))))))%%B 扩增片段 6,+! 上游引物 B%)%))))%%) %B 下游引物 B%))))%%)B 预计扩增片段长度 反应条件均为 ( 的反应体系 6A 预变性 +!6A 变性.6A 退火.A 延伸 +! 个循环 最后 A 延伸 +! 最后至 A 终止 琼脂糖凝胶电泳观察结果 各组实验重复 次 +3 统计学处理 数据用均数 C 标准差 C 表示 采用 7277 统计软件进行分析 多组间比较采用方差分析 检验水准 D - 结 果 -,+ - 剂量依赖性抑制 /0 细胞的增殖 %% 法检测结果显示 浓度在 ( 时 其对 (* 细胞增殖活力的抑制并不明显 当浓度在 ( 范围内时 (* 细胞的增殖活力受到抑制 且在第 天后更加明显 图 图 - 免疫组化法检测 ( 4 /0 和 ( 5 #- 细胞中 6/7 的表达 1+&-#..+!1(+!%&'% (*,!%&'% #.###+"!+.#+.-@ 重组慢病毒 ) 感染的 (* 细胞 > 重组慢病毒 ) 感染的 细胞 )(* 细胞 / 细胞 境中更加明显 不同浓度 ( 作用 均可上调 )(* 细胞内 )/0 表达量 而在 ( 时表达量最高 ( 时次之 差异具有统计学意义 )(* 细胞内 )/0 表达量在 ( 作用 $ 后 均明显高于常氧组 且在作用 后表达量达到最大 图 差异具有统计学意义 因此 缺氧微环境可以明显上调 )(* 细胞内 )/0 蛋白的表达 且在 ( 作用 其上调最明显 图 + 不同浓度 - 对结肠癌细胞 /0 增殖活力的影响 1+&#.+#-#!!#!-,+!.))!-+ #-,+!(* #. -,- 重组慢病毒 感染 ( 4 /0 细胞及 ( 5 #- 细胞 重组慢病毒 ) 感染 %&'% (* 细胞及 %&'% 细胞 5 后 免疫细胞化学检测 (* 细胞和 细胞中 1( 的表达 镜下可见 (* 胞质内有棕黄色的 1( 染色颗粒 而 细胞质内无棕黄色颗粒 图 由此说明 %&'% 启动子能够调控治疗载体 ) 仅在 %&'% 阳性细胞中表达 而在 %&'% 阴性细胞中不表达 -,1 缺氧上调 /0 细胞内 - 蛋白的表达 #.#-! 结果 图 显示 )(* 细胞内 )/0 蛋白表达量高于 (* 细胞 且在缺氧环 图 1 不同浓度 - 模拟缺氧微环境下 /0 细胞内 - 蛋白表达 1+ %#)/0-#+!#-#..+!+!)(* #. "!#-+#-#!!#!-,+!.

4 $5 西安交通大学学报 医学版 第 卷 1 讨 论低氧是实体肿瘤的共同特征 它是癌细胞快速增 6 殖与血液供应相对滞后的结果 近年来微环境低氧与肿瘤的关系倍受关注 低氧通过调控多种基因表 图 -188&/ 作用不同时间后 /0 细胞内 - 蛋白表达 1+ %#)/0-#+!#-#..+!+!)(* #. -+#-#!+##-+.+#( -, 缺氧上调 /0 细胞内 -&2 的表达 '%2)' 结果 图 显示 )(* 细胞内 )/0'3 表达量高于 (* 细胞 且在 ( 作用 后更加明显 琼脂糖电泳显示为 6 大小的特异性条带 以上显示 缺氧微环境通过对 '& 增强子的作用明显上调 )/0 基因的表达水平 图 缺氧微环境对 /0 细胞内 - &2 表达的影响 1+ &#+, +-#!<+-!#!!##-#..+!)/0'3+!)(* #.?,-?#-3/(,-?#-(* 细胞 )(* 细胞 )(* 细胞 ))( 达而影响肿瘤细胞的生物学特性 缺氧因子 +,+!"+#,-1 作为缺氧诱导下最重要的转录因子 参与调控一系列缺氧诱导的靶基因 表达 '& 是位于低氧相关基因 B 或 B 端的一段 /3 序列 其核心序列可与 1 特异结合 形成转录起始复合物 从而启动靶基因的转录 近年来 为了增加目的基因在缺氧微环境下的表达水平 个拷贝的 '& 作为一种增强子 经常被应用于 治疗载体的构建 7>% 等首先构建了 '& 并研究 发现其在缺氧的微环境下可将调控的 靶基因表达水平增加 倍 3 等证明 '& 调控的 %77% 基因的表达在缺氧微环境下能够明显上调 因此 作为增强子 '& 在缺氧微环境下可以上调目的基因的表达 分子靶向性基因治疗在肿瘤治疗中具有广阔应用前景 而对于抑癌基因的应用常常因缺乏肿瘤特异性而受到限制 使用肿瘤特异性启动子调控治疗载体的表达克服了该弊端 使得抑癌基因应用于肿瘤的基因治疗成为可能 %&'% 启动子由于其在大多数 肿瘤细胞中表达 而在正常细胞中不表达 使得其在治疗载体的构建中成为一种有用的调控元件 5 83 等构建了一种 %&'% 启动子调控的表达载体 使该载体对人肺 6 腺癌细胞增殖具有特异性抑制作用 而对正常细胞无影响 有研究者构建了一种 %&'% 启动子调控的溶菌细胞腺病毒载体 可以有效特异性杀伤人肿瘤细胞 而对人正常体细胞没有 6 作用 这些表明在肿瘤的基因治疗过程中 肿瘤特异性的 %&'% 启动子提供了一种新途径 因此 本课题组前期构建了由 '& 增强子和 %&'% 启动子联合调控抑癌基因 )/0 表达的慢病毒表达载体 ) 并对其进行病毒包装 通过免疫组化法发现 %&'% 启动子在人结肠癌细胞株 (* 中为阳性表达 而在人肾小管上皮细胞株 中不表达 且筛选获得了稳定表达 ) 的 (* 细胞 )(* 本实验通过病毒液 ) 感染 %&'% (* 细胞及 %&'% 细胞 结果发现该治疗载体在 (* 细胞中表达 而在 细胞中不表达 证明了其 %&'% 靶向性 又通过 #.#-! 检测 发现不同浓度 ( 的 作用 均可以上调

5 期 贺 赛 郑见宝 孙学军 等 缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定 $6 )(* 细胞内 )/0 的表达 且在 ( 上调最为显著 ( 次之 在不同的时间点 $ 浓度 ( 作用 时 目的基因 )/0 具有最高的表达量 '%2)' 检测显示 )/0 '3 的表达量在缺氧微环境下 ( 明显增加 与其蛋白水平结果一致 证明了该治疗载体在 '& 增强子作用下 其抑癌基因 )/0 在缺氧微环境下的表达量均可明显上调 联合 %% 实验显示的不同浓度 对 (* 细胞的增殖能力的影响 提示 ( 浓度既可以明显上调目的基因的表达 且具有较小的细胞毒性 为后续分子及细胞学实验中 浓度的选择提供了理论依据 总之 本研究成功的对缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体 ) 的 %&'% 靶向性及缺氧可诱导性进行了鉴定 为后续该治疗载体 ) 在体内及体外的功能研究奠定了基础 参考文献 $+121+!-3% (!(413.3 '!3$$!1'.&,#* #" #&!55*6& +-' -5$3' 51' 2.&# *#*### #"* #&"$*& (3' 1',1' &*##,'1 40- /"# "#### )## #&6#,6*$& 7+1'0-401' +&*#* *""" +$%* "## "*### " &-#,6& 23$11,1!041,1 &""* " -, " "##&#$#5665 5*5& $ 王炜 孙学军 王伟 等 & 缺氧微环境对 $$* 诱导的抗 -1.% 细胞免疫治疗的调控 & 中国肿瘤生物治疗杂志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编辑 国 荣

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