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1 216 中南大学学报 ( 医学版 ) JCentSouthUniv(MedSci) 2008,33(3) Puerarin 逆转 K562/AO2 耐药的分子机制 陈进伟, 陶师, 骆蓉, 张广森, 徐运孝 ( 中南大学湘雅二医院血液科, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究黄酮类化合物 puerarin 对 K562/AO2( 人红白血病多药耐药细胞系 ) 细胞耐药逆转作用的分子机制 方法 : 免疫荧光染色方法检测阿霉素 (ADR) 和 puerarin 对 K562( 人红白血病细胞系 ) 和 K562/AO2 两种细胞 NF κb 活性的影响 ; 免疫细胞化学染色方法检测 ADR 和 puerarin 对 K562 和 K562/AO2 的 survivin 表达的影响 ; 流式细胞仪检测 ADR 和 puerarin 对 K562 和 K562/AO2 的 p gp 表达的影响 结果 : 经 ADR 处理后的 K562 细胞和 K562/AO2 细胞 NF κb 的活性明显高于 K562 细胞空白对照组 ; 经 puerarin 预处理后再加 ADR 处理的 K562 细胞中的 NF κb 的活性明显低于只用 ADR 处理的 K562 细胞 经 puerarin 干预后的 K562/AO2 细胞的 NF κb 的活性明显低于未经 puerarin 干预的 K562/AO2 细胞 ; 经 ADR 处理后的 K562 细胞和 K562/AO2 细胞的 p gp,survivin 表达明显高于 K562 细胞空白对照组 ; 经 puerarin 预处理后再加 ADR 处理的 K562 细胞中的 p gp,survivin 表达明显低于未经 pu erarin 预处理的 K562 细胞 ; 经 puerarin 干预后的 K562/AO2 细胞的 p gp,survivin 表达明显低于未经 puer arin 干预的 K562/AO2 细胞 p gp 和 survivin 表达呈正相关 结论 :NF κb 的活化使 p gp 和 survivin 表达增多可能是 K562 细胞多药耐药形成的机制之一 Puerarin 能预防和阻止 K562 细胞耐药形成, 并能逆转 K562/AO2 对 ADR 的耐药, 其机制与抑制 NF κb 活性及 survivin 和 p gp 的表达有关 [ 关键词 ] puerarin; K562/AO2; 多药耐药 ; 逆转 ; 分子机制 [ 中图分类号 ] R733.7 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] (2008) Molecularmechanism ofreversingmulti drugresistance ofk562/ao2bypuerarin CHENJin wei,taoshi,luorong,zhangguang sen,xuyun xiao (DepartmentofHematology,SecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410007,China) Abstract: Objective Todeterminethemolecularmechanism ofreversingmulti drugresist anceofk562/ao2 bypuerarin.methods EfectsofADR andpuerarinonnf κb activityof K562,K562/AO2weretestedbyimmunoflurescence.TheexpresionofsurvivinofK562,K562/ AO2wasexaminedbyimmunocytochemistry.Thep gpexpresionwasdetectedbyflow cytometry. Results TheNF κbactivityofk562wassignificantlyhigherthanthatofk562/ao2.thenf κb activityofk562 treatedbyadr wassignificantlyhigherthanuntreated.thenf κb activityof K562whichwaspretreatedbypuerarinandthentreatedbyADRwasmuchlowerthanthattreatedby ADRalone.TheNF κbactivityofk562/ao2intervenedbypuerarinwaslowerthanthatuninter venedbypuerarin.thep gpandsurvivinexpresionofk562/ao2wassignificantlyhigherthan K562.Thep gpandsurvivinexpresionofk562treatedbyadrwashigherthanthatuntreatedby 收稿日期 (Dateofreception) 作者简介 (Biography) 陈进伟 (1954 ), 女, 湖南长沙人, 教授, 主要从事血液病和风湿免疫性疾病的研究 通讯作者 (Correspondingauthor) 陈进伟,E mail:jinwei73104@yahoo.com.cn 基金项目 (Foundationitem) 湖南省科学技术厅科技计划资助项目 (05SSY3069) ThisworkwassupportedbytheDepartmentofScience andtechnologyofhunanprovinceofp.r.china(05ssy3069).

2 Puerarin 逆转 K562/AO2 耐药的分子机制 陈进伟, 等 217 ADR.Butthep gpandsurvivinexpresionofk562whichwaspretreatedbypuerarinandthentrea tedbyadrwasmuchlowerthanthatnotpretreatedbypuerarin.thep gpandsurvivinexpresionof K562/AO2intervenedbypuerarinwaslowerthanthatunintervenedbypuerarin.Theexpresionwas negativelycorelatedtothedurationofintervention.theinhibitionefectdemonstratedtimedepend ence.conclusion TheactivationofNF κbcanincreasetheexpresionofp gpandsurvivin,which maybepartofthemolecularmechanism ofmulti drugresistanceofk562.puerarincanpreventand stopthemulti drugresistanceink562andreversethemulti drugresistanceofk562/ao2toadr byinhibitingtheactivityofnf κbandtheexpresionofp gpandsurvivin. Keywords: puerarin; K562/AO2; multi drug resistance; reversal; molecular mechanism [JCentSouthUniv(MedSci),2008,33(3): ] 白血病细胞多药耐药 (multi drugresistance, MDR) 的发生严重制约着白血病的治疗 近年来有研究发现黄酮类化合物除具有很好的心血管 [1 2] 疾病的治疗作用外, 还具有抗肿瘤和逆转白血病细胞株的多药耐药的作用 [3] 但其作用机制尚不十分清楚, 本研究探讨了黄酮类化合物 puer arin( 普乐林 ) 对人红白血病多药耐药细胞系 K562/AO2 耐药逆转的分子机制 1 材料与方法 1.1 材料 试剂及主要仪器 Puerarin 购于美国 AlexisBiochemicals 公司 人红白血病细胞株 K562 由湘雅二医院血液病研究室提供 K562/ AO2 耐药细胞株为阿霉素 (ADR) 诱导 K562/S 建立的 MDR 细胞株, 由中国协和医科大学血液病研究所提供 小牛血清 RPMI1640 培养液为 Hy clon 公司产品 ADR 购自意大利法玛西亚普强公司 鼠抗人 p gp 单抗 (JSB 1) 为 AlexisBiochemi cals 公司产品 FITC 羊抗鼠 IgG 为 ZymedLabora tories 公司产品 NF κb 单抗 ( 鼠抗人 ) 和 survivin 单抗 ( 鼠抗人 ) 为美国 SantaCruz 公司产品 其他试剂为国产分析纯, 流式细胞仪为美国 BD 公司产品 (FACSCalibur) 1.2 方法 细胞培养白血病亲本细胞株 K562 用含 10% 小牛血清的 RPMI1640 培养液在 37, 5% CO 2 条件下培养 耐药细胞株 K562/ADR ( 对阿霉素耐药的人红白血病细胞株 ) 在含 ADR 1mg/L,10% 小牛血清的 RPMI1640 培养液中稳定生长, 试验前两周换用无 ADR 的 RPMI1640 培 养液培养 取 K562 和 K562/ADR 细胞用含 10% 灭活的新生牛血清的 RPMI1640 培养基制成单细胞悬液接种入 6 孔培养板中, 每孔 2mL, 含细胞 个, 隔天小心吸去上清进行换液 每天收取 1 孔细胞, 适当稀释, 制备细胞悬液,9 份细胞悬液加 1 份 0.4% 台盼蓝染液, 混匀, 镜下计数拒染的细胞数 ( 活细胞数 ), 从而算出相应的每孔活细胞数量, 以上记数操作重复 4 次, 取平均值 绘制细胞生长曲线 试验分组 A 组 :K562 细胞常规培养, 不用任何干预 ;B 组 :K562 细胞用 1mg/L 的 ADR 处理 24 h; C 组 : K562 细胞用 puerarin 25μmol/L 干预 24h 后,1mg/L 的 ADR 处理 72h; D 组 :K562/AO2 细胞常规培养, 不用任何干预 ; E 组 :K562/AO2 细胞用 25μmol/L 的 puerarin 处理 24h 免疫荧光检测细胞株 NF κb 的活化按实验分组分别加入相应浓度药物, 置 37, 5% CO 2 及饱和湿度培养箱中培养, 于 24h 后收集细胞 取密度为 /ml 细胞悬液 10μL 制作细胞涂片,80% 丙酮固定 30min,0.2% Tri tonx 100 特化处理 15min, 山羊血清工作液孵育 30min 后弃孵育液, 加 稀释的一抗 (NF κb 单抗 ),4 过夜, 再加 FITC 羊抗鼠 IgG(1 100) 孵育 30min, 甘油封片 荧光显微镜下观察细胞的免疫组织化学染色情况 免疫组织细胞化学染色检测细胞株中 survivin 的表达按实验分组分别加入相应浓度药物, 置 37,5% CO 2 及饱和湿度培养箱中培养, 取 10μL 细胞悬液作细胞涂片, 干燥后浸入 4% 多聚甲醛溶液中固定 30 min, 加入 3%

3 218 中南大学学报 医学版 2 8 3 3 3 H2O2 于 玻 片 上 反 应 2 m 再 加 山 羊 血 清 孵 育 干 预 组 间 的 p p表 达 表 达 A 值 比 较 采 2m 后 弃 孵 育 液 加 一 抗 抗 体 4 过 用 两 样 本 检 验 d p d mp 和 完 全 夜 再 加 相 应 的 二 抗 25m 后 加 入 的 辣 根 酶 标 随 机 设 计 资 料 的 方 差 分 析 w y ANOVA 记 链 霉 卵 白 素 工 作 液 37 孵 育 25m DAB显 S 表 达 A 值 与 p p表 达 关 系 的 研 色 苏 木 素 复 染 中 性 树 胶 封 片 光 学 显 微 镜 下 观 c 究 采 用 直 线 相 关 分 析 阳 性 用 彩 色 病 察 细胞染 成 棕 黄 色 为 表 达 的 灰 度 理图文分析系统测定细胞株 2 结 果 值 表 达 越 强 细 胞 染 色 越 深 灰 度 值 越小 2 1 细 胞 株 NF κb的 活 化 1 2 5 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 株 p p表 达 细 胞 株 NF κb的 活 化 结 果 荧 光 显 微 镜 下 显 示 按 实 验 分 组 分 别 加 入 相 应 浓 度 药 物 置 3 7 5 A组 的 2细 胞 荧 光 强 度 弱 说 明 未 经 任 何 干 免疫荧光法检测 CO2 及 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 培 养 收 集 2 1 个 细 预 的 2细 胞 NF κb活 化 少 且 主 要 在 胞 浆 中 胞 用 1 ml 7 乙 醇 4 固 定 细 胞 m 用 表 达 细 胞 核 内 表 达 很 少 图 1A B组 经 ADR 1mL含 1 T X1和 5 血 清 的 PBS重 悬 处 理 后 的 2细 胞 核 内 荧 光 强 度 明 显 增 强 可 细 胞 样 本 组 加 入 饱 和 剂 量 p p抗 体 J S B 1 见 NF κb已 被 活 化 而 核 内 移 图 1B 经 p 1 2 阴 性 对 照 组 加 入 鼠 I G1 4 冰 箱 干 预 后 再 用 ADR 处 理 的 2细 胞 C组 细 胞 TC 标 记 的 二 抗 过 夜 14 1h 加 入 荧 光 FI 核 内 荧 光 强 度 比 2细 胞 A组 稍 强 但 明 显 1 5 再 加 入 PBS1mL重 悬 细 胞 用 尼 龙 膜 弱 于 单 独 用 ADR 处 理 组 B 组 图 1A 1B 过 滤 流 式 细 胞 仪 检 测 荧 光 值 每 个 样 品 分 析 1C AO2细 胞 D 组 细 胞 核 内 荧 光 染 色 1 个 细 胞 强 阳 性 图 1D 经 p 干 预 的 AO2细 1 3 统计学处理 数据采用 S PS S13 f w d w软 件 包 进 行 处 理 P 1认 为 差 异 有 统 胞 E组 细 胞 核 内 荧 光 强 度 较 AO2细 胞 D组 明 显 减弱 图 1D 1E 计 学 意 义 2组 AO2组 及 其 各 药 物 图 1 各组细胞 NF 2细胞组 B 2细胞用 ADR处理 2 4h组 C 2细胞用 p κb免疫荧光强度与分布 A 干预 2 4h后 ADR处理 7 2h组 D AO2细胞组 E AO2细胞用 p 处理 2 4h组 F 1S h dd b f mm f c c NF f h5 p A B yadr2 4 κb h C 2 4h ADR7 2h D AO E AO 2 4h

4 P 逆转 AO2耐药的分子机制 219 陈进伟 等 2 2 细 胞 株 中 的 表 达 在光学显微 随机选取多 个 细 胞 视 野 用 彩 色 病 理 图 文 报 告 分 镜下观察各实验组细胞的 的 表 达 结 果 显 析系统进行 表 达 的 平 均 灰 度 A 值 定 量 示 2细 胞 空 白 对 照 组 A 组 细 胞 浆 不 着 色 分 析 结 果 显 示 经 ADR处 理 后 的 2细 胞 B 图 2A 经 ADR处 理 的 2细 胞 B组 着 色 组 和 AO2 细 胞 D 组 表 达 较 表 和 AO2细 胞 D 组 比 较 明 显 2细 胞 A组 显 著 增 强 经 p 干 预 后 再 达 很 强 图 2B 2D 经 p 干 预 后 再 用 ADR 用 ADR处 理 的 A52细 胞 C组 的 表 达 处 理 的 2细 胞 C组 着 色 明 显 较 未 经 p 较 只 用 ADR处 理 的 A52细 胞 B组 明 显 降 低 干 预 单 独 用 ADR 处 理 的 2细 胞 B组 浅 经 p 干 预 后 的 AO2细 胞 E 组 的 图 2B 2C 经 p 干 预 24 h的 表 达 较 未 经 p 干 预 的 AO2细 干 预 的 AO2细 胞 E 组 着 色 较 未 经 p 胞 D组 明 显 降 低 表 1 灰 度 值 越 高 AO2细 胞 D组 浅 图 2D 2E 各 组 均 的表达越低 图 2 免疫组织化学染色检测各组细胞 表达 A 2细胞组 B 2细胞用 ADR处理 2 4h组 C 2细胞用 p 预处理 2 4h后 ADR处理 7 2h组 D AO2细胞组 E AO2细胞用 p 处理 2 4h组 F 2I mm h c h m y h w h x p f f h5 p A B yadr 2 4h C 2 4h ADR7 2h D AO E AO 2 4h 表 1 ADR和 p 对 各 组 细 胞 表 达 的 影 响 T b 1 Ex p f h 2 AO yadr dp x± 5 细胞 表达的 A值 A组 2空白对照 28 9 4 5±3 8 4 B组 2 ADR 15 2 8 8±1 5 1 1 C组 2 PU ADR 22 8 4±3 4 2 3 D组 AO2 E组 AO2 PU 9 5±1 1 12 3 8 1±2 1 8 2 与 A组比较 P 1 与 B组比较 P 1 与 D 组比较 P 1 PU表示 p 流式细胞仪检测各 实 验 组 细 胞 p p表 达 结 果 显 示 AO2空 x± 5 组别 2 3 细 胞 株 p p表 达 白 对 照 组 细 胞 D 组 和 经 ADR 处 理 的 2细 胞 B组 p p表 达 明 显 高 于 2空 白 对 照 组 细 胞 A组 经 p 预 处 理 后 再 用 ADR处 理 的 2细 胞 C组 p p表 达 显 著 低 于 未 经 p 预 处 理 单 用 ADR 处 理 的 2 细 胞 B 组 经 p 干 预 24h后 AO2细 胞 E 组 p p表 达 低 于 未 经 p 干 预 的 AO2 细 胞 D组 p p的 表 达 表 2 说 明 p 能 有 效 地 抑 制 ADR诱 导 2细 胞 的 p p表 达 同 时 也 能 使 AO2细 胞 的 p p表 达 下 降

5 220 中南大学学报 ( 医学版 ),2008,33(3) 表 2 各组 p gp 的表达 (x±s,n=3) Tab.2 Expresionofp gpofthe5groups(x±s,n=3) 组别细胞 p gp 阳性率 (%) A 组 (K562 空白对照 ) 3.73±0.51 B 组 (K562 +ADR) C 组 (K562 +PU+ADR) D 组 (K562/AO2 空白对照 ) E 组 (K562/AO2+PU) 87.44± ± ± ±4.09 ## 与 A 组比较, P<0.01; 与 B 组比较, P<0.01; 与 D 组比较,##P<0.01 PU 表示 puerarin 2.4 各组细胞 survivin 表达和 p gp 表达的相关性分析对每组 survivin 表达灰度值及 p gp 表达阳性率进行相关性分析, 结果显示 p gp 表达高低与 survivin 表达灰度值负相关 (r= , P<0.01), 即 p gp 表达与 survivin 表达呈正相关 3 讨论 临床上白血病化疗时剂量不足或化疗不能耐受须反复用药, 常引起白血病细胞耐药 如同在实验室中用 ADR 诱导 K562 成 K562/AO2 一样, 化疗药物在诱导细胞凋亡的同时也诱导耐药细胞的形成 本实验用 ADR 刺激 K562 细胞 24h 后,NF κb 明显活化并核内移 受 NF κb 调控的下游基因 p gp 和 survivin 在 ADR 处理的 K562, K562/AO2 细胞中表达都明显增强 K562/AO2 的 NF κb 更是高度活化,p gp 和 survivin 的表达更为明显 实验结果与目前药物所致细胞耐药 [4 5] 和凋亡受阻的研究完全相符 有学者认为 ADR 也是通过 caspase 信号瀑布诱导细胞凋亡的, 在其活化 caspase 家族的同时也可激活依赖 PI3K 的 PKB/Akt 细胞存活通路而使 NF κb 活化, 下游抗凋亡基因的表达增强, 这是 NF κb 活化的主要途径 次要途径是在 P38/MAPK 信号通路激活后使 p65 磷酸化和从前体蛋白 p105 形成 p50, p50/p65 异源聚体活化并进入核中发挥转录活性 [6] P38/MAPK 信号通路恰恰也是 ADR 诱导细胞凋亡的一个主要通路 长期一定浓度的 ADR 杀伤白血病细胞 (K562) 的同时也活化 NF κb, 上调下游耐药 抗凋亡基因 (p gp,survivin 等 ) 的表达, 是 K562/AO2 耐药形成的机制之一 且 ADR 作用的时间越长,NF κb 的活化越完 全, 下游抗凋亡和耐药基因更加高度表达, 是白血病化疗过程中形成白血病细胞高度耐药的一个重要原因 Puerarin 是从传统中药葛根的根茎中提取的纯的黄酮类化合物, 其主要成分为异黄酮 [7] 研究发现 Flavopiridol 等黄酮类化合物可以促进 TNF 阿霉素 足叶乙甙等一些因素对肿瘤细胞的毒性作用 [6] [8] Takada 等研究发现,TNF 可诱导 HL 60 细胞的 NF κb 活化, 并向核内转移, 多种蛋白表达增加, 如 Bcl 2,Mcl 1,CyclinD1,VEGF, COX 2,MMP 9,IAPs 等 而经 Flavopiridol 预处理后,NF κb 活化受到明显的影响, 核内转移的 NF κb 减少, 其下游基因的表达也明显受到抑制 笔者先前的研究显示 puerarin 能增加 K562 和 K562/AO2 细胞对 ADR 的敏感性 ( 增敏 1.42 倍 ), 并能逆转 K562/AO2 细胞的耐药 ( 逆转倍数为 9.43) 为研究其分子机制, 本研究用 puer arin 分别干预 ADR 处理的 K562 细胞和 K562/ [8] [9] AO2, 结果与 Takada 等和 Khoshnan 等的研究结果一致 Puerarin 对耐药细胞株 K562/AO2 的 NF κb 活化以及 p gp 和 survivin 的表达有明显的抑制作用, 且有高度的相关性 说明 Flavopiridol 是通过抑制 NF κb 的活性, 下调 p gp 和 survivin 基因表达, 从而逆转白血病细胞的耐药 用 puer arin 预先干预, 再用 ADR 刺激 K562 细胞株后, 其 NF κb 活化及核内移较预先未加 puerarin 干预的 K562 细胞明显受到抑制,p gp 和 survivin 的表达也明显减少, 但仍高于没有用阿霉素刺激的 K562 细胞 推测 puerarin 逆转耐药是通过抑制 NF κb 活化的主要途径即 PI3K/AKT 存活通路, 而不能抑制 P38/MAPK 信号通路这一次要途径 [8] 由此提示如果先用黄酮类化合物阻止 PI3K/AKT 这条主要存活通路, 再用 ADR 进行诱导凋亡时,ADR 就不能通过活化 NF κb 产生抗凋亡作用, 从而预防和阻止白血病细胞耐药形成, 增强 ADR 对肿瘤的杀伤作用 参考文献 : [1] Yu Z. Induction ofapoptosisbypuerarin in colon cancer HT 29cels[J].Cancerlet,2005,35(2): [2] 焦鹭. 葛根有效成分 S86019 对 HL 60 细胞的分化诱导及细胞周期移行作用的研究 [J]. 中华血液学杂志,1990,11(2):83 85.

6 Puerarin 逆转 K562/AO2 耐药的分子机制 陈进伟, 等 221 JIAO Lu.Studyonthediferentiationandmigrationofcel cycleofhl 60cellineinducedbytheefectofS86019of puerarin[j].chinjhematol,1990,11(2): [3] 陈进伟, 骆蓉, 张广森, 等. K562/AO2 耐药细胞 NF B 活性测定及葛根素部分逆转耐药效应的初步研究 [J]. 中华血液学杂志,2006,27(7): CHEN Jin wei, LUO Rong, ZHANG Guang sen, etal. DetectionofNF κb activityonk562/ao2celsandefect ofpuerarininreversingthemultidrugresistanceofk562/ AO2 cel[j].chin JHematol,2006,27(7): [4] YiH,KoreyR J,JamesSN,etal.Nuclearfactor κb/ IκBsignalingpathwaymaycontributetothemediationofpa clitaxel inducedapoptosisinsolidtumorcels[j].cancer Res,2000,60(1): [5] JonesD R,BroadR M,MadridLV,etal.Inhibitionof NF κb sensitizesnon smalcellungcancercelstochemo therapy inducedapoptosis[j].ann ThoracSurg,2000, 70(3): [6] LeeE G,BooneD L,ChaiS,etal.Failuretoregulate TNF αinducednf κbanddeathresponsesina20deficient mice[j].science,2000,289(10): [7] PrasainJK,JonesK,KirkM,etal.Profilingandquanti fication ofisoflavo noids in kudzu dietary supplements by high performanceliquidchromatographyandelectrosprayioni zation tandem masspectrometry[j]. Agric Food Chem, 2003,51(15): [8] TakadaY,AggarwalB B.FlavopiridolinhibitsNF κbacti vationinducedbyvariouscarcinogensandinflamatoryagents throughinhibithion ofikbakinaseand P65 phosphorylation [J].BiolChem,2004,279(6): [9] KhoshnanA,TindelC,LauxI,etal.TheNF kappab cascadeisimportantinbcl xl expresionandfortheanti apoptoticefects ofthe CD28 receptorin primary human CD4 + lymphocytes[j]. Immunology,2000,165(4): ( 本文编辑郭征 )

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