2 和 p53 再生化合物 (reactivatorofp53andinductionof tumorapoptosis,rita), 三环噻吩衍生物, 是一种潜在的抗癌先导化合物研究表明,RITA 与 p53 结合, 激活野生型 p53, 促进 p53 的累积 ; 同时在体内外抑制 p53 与

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闲米杨
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1 1 检测肿瘤凋亡和 p53 再生化合物对不同 p53 状态人脑胶质瘤细胞的生长抑制作用论著冯小丽 1, 何小艳 2#, 曾焕超 1, 宋鑫培 1, 肖维威 1 1, 吴清华 1. 南方医科大学公共卫生学院三级生物安全实验室, 广东广州 51515; 2. 南方医科大学南方医院神经外科, 广东广州摘要 : 目的探讨 p53 靶向小分子 RITA 对不同 p53 状态人脑胶质瘤细胞的生长抑制作用方法基因测序确定实验所用 U251 和 U87 细胞中 p53 基因状态 ;MTS 法检测 μmol/l 1μmol/L 4μmol/L 1μmol/LRITA 作用于 U251 和 U87 细胞 h 24h 72h 12h 168h 的增殖情况 ;qrt-pcr 法和 Westernblot 法分别检测抑癌基因 p53 p21 的 mrna 和蛋白质表达水平 ; 计算抑制率和 IC 5 结果基因测序结果表明实验所用 U251 细胞表达突变型 p53 基因而 U87 表达野生型 ;RITA 对 2 种细胞的增殖均有显著抑制作用, 且对 U251 的抑制作用更强 ;5μmol/LRITA 作用下,U251 中 p53 p21 表达均显著增加,U87 中 p21 表达增加,p53mRNA 表达变化不明显, 但 P53 蛋白累积显著增加 ;RITA 作用于 U251 U87 细胞 24h 和 12h 的 IC 5 分别为 μmol/L μmol/L 和 2.817μmol/L 7.147μmol/L 结论 RITA 能有效促进人脑胶质瘤细胞 U251 和 U87 中 p53 和 p21 基因表达, 发挥高效生长抑制作用, 且含突变型 p53 的 U251 比含野生型 p53 的 U87 效果显著关键词 : 肿瘤凋亡和 p53 再生化合物 ;p53; 人脑胶质瘤细胞中图分类号 : 文献标识码 :A 文章编号 : (216)13--5 Growthinhibitionofp53andRITAdetectiononthehuman glioblastomacelindiferentp53functionstatus FENGXiao-li,HEXiao-yan,ZENGHuan-chao,SONGXin-pei,XIAOWei-wei,WUQing-hua BiosafetyLevel-3Laboratory,SchoolofPublicHealthandTropicalMedicine,SouthernMedical University,Guangzhou,Guangdong51515,China Abstract:Objective ToinvestigatethegrowthinhibitionofRITA-smalmoleculethattargetsp53tothehumanglioblastoma celindiferentp53functionstatus.methods Definethestatusofp53geneinU251andU87celsadoptedforourstudyby genesequencing;theu251/u87celsweretreatedwithμmol/l,1μmol/l,4μmol/l,1μmol/lofrita,andmtsasay wereusedtodetectproliferationof,24,72,12,168h;theexpresingofmrnaandproteinoftumorsuppresorgenep53, p21weredetectedbyqrt-pcrandwesternblot.tocalculatetheinhibitoryrateandic 5.Results Genesequencingresults showedthattheu251celsadoptedforourstudyexpresedmutant(mu)p53whiletheu87celsexpresedwild-type(wt) p53.theinhibitoryefectritaongliomacelswerevisible,andtheinhibitoryefectonu251wasstrongerthanonu87.the expresionofp53andp21geneinu251andp21geneinu87increasedobviously.themrnaofp53genechangedslightlybut theproteinaccumulatedgreatly.theic 5 ofu251,u87treatedwithrita24hand12hwere123.87μmol/l, μmol/land2.817μmol/l,7.147μmol/lrespectively.conclusion RITAcanincreasetheexpresionofp53andp21gene inhumangliomacelsu251andu87,showingvisibleinhibitoryaction,andu251celsexpresingmup53ismoresensibleto RITAthanU87celsexpresingwtp53. KeyWords:p53andRITA;p53;Humanglioblastomacels 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 高等学校博士学科点专项科研基金 ( ) 作者简介 : 冯小丽 (1993-), 女, 本科, 主要从事预防医学专业研究何小艳 (1978-), 女, 本科, 主管护师, 主要从事神经外科的护理工作通讯作者 : 吴清华, wuqh@smu.edu.cn # 为并列第一作者脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤, 恶性程度高, 侵袭性强, 患者病死率仍居高不下,5 年总生存率不超过 9.8% [1], 脑肿瘤的治疗成为国际公认的医学难题当前研究中在脑胶质瘤细胞治疗中寻找和确定新的分子靶标和途径 ( 参与细胞增殖和 / 或凋亡 ) 靶向促细胞凋亡抗凋亡因子和多种细胞周期调节, 探究选择性杀死胶质瘤细胞或剥夺它们的肿瘤启动潜力的新疗法, 具有重要前景肿瘤凋亡

2 2 和 p53 再生化合物 (reactivatorofp53andinductionof tumorapoptosis,rita), 三环噻吩衍生物, 是一种潜在的抗癌先导化合物研究表明,RITA 与 p53 结合, 激活野生型 p53, 促进 p53 的累积 ; 同时在体内外抑制 p53 与 MDM2 的相互作用, 并影响 p53 下游的负性调控作用, 恢复肿瘤细胞里 p53 的凋亡诱导功能 [2-4] 另有报道 [5-6], 在一些含 p53 热点突变的肿瘤治疗中,RITA 重新激活 p53, 抑制细胞生长并触发细胞凋亡相关报道在食管癌骨髓癌肝癌等细胞中有报道, 但在人脑胶质瘤细胞中尚未有实验报道 [7-8] 本研究对 RITA 在人脑胶质瘤细胞不同 p53 基因状态的 U251 和 U87 细胞中肿瘤抑制作用进行初步探索, 为进一步研究 RITA 的临床前药物治疗脑胶质瘤提供实验参考 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂生物安全柜 (ESCOLA2-3AI); 低速离心机 ( 中佳,SC3614); 细胞恒温培养箱 [ 美国 Thermo(Forma)311]; 基因扩增仪 (Biometra,trio); 荧光定量 PCR 仪 (SmartCyclerⅡ); 电泳仪 (Biorad,Pro teanⅡ XL); 酶标仪 ( 美国 BioTexELX88IU) 人脑胶质瘤细胞 U251 和 U87( 本室保种 );DMSO( 批号 : D265-5X5ML);RITA( 批号 :16426); 胎牛血清 ( 批号 :SH387.1);DMEM - 高糖培养基 ( 批号 : SH322.1B);PBS 磷酸钾缓冲液 ( 批号 :SH B); 青链霉素 ( 批号 :SH31); 扩增引物 ( 苏州金唯智公司合成 );RT-PCR 试剂盒 ( 批号 :A35);T4 DNAN 连接酶 ( 批号 :211A);T 载体试剂盒 ( 批号 : 613);DNA 凝胶回收试剂盒 ( 批号 :N171);MTS 试剂盒 ( 批号 :G3582);96 孔板细胞培养板 ( 批号 :PPP -1-3);BCA 法蛋白含量检测试剂盒 ( 批号 : KGPBCA); 一抗稀释液 ( 批号 :P13) 1.2 方法细胞培养 U251 U87 细胞用含 1% 胎牛血清和 1% 青链霉素的 DMEM - 高糖培养基, 于 5% CO 2 37 的培养箱中传代培养基因测序采用逆转录 PCR 法 (RT-PCR) 获取目的片段 :1Trizol 法分离提取 U87 U251 细胞总 RNA 用作扩增模版 2 各取 1μl 总 RNA 样品 5 倍稀释紫外分光光度检测纯度,1μl 总 RNA 样品 1% 琼脂凝胶电泳检测完整性 3p53DNA 基因编码序列克隆 : 根据 NCBIGenBank 中 p53cdna 序列设计引物, 由苏州金唯智基因公司合成 U87 细胞上游引物序列 F1:5 -GTGACACGCTTCCCTGGATT-3 ; 下游引物序列 R1:5 -GCACCACCACACTATGTCGAA-3 U251 细胞上游引物序列 F2:5 -TGGCCATCTA CAAGCAGTCA - 3 ; 下游引物序列 R2:5 - GCAAGCAAGGGTTCAAAGACC-3 用 1% 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 扩增结果, 紫外灯下观察结果并拍照, 用 DNA 凝胶回收试剂盒回收目的片段, 转入质粒中, 并把质粒送到苏州金唯智基因公司测序测序结果进行 NCBIBLAST 比对药物处理取对数增长期 U251 U87 细胞进行药物处理分为 2 组 :1DMSO( 对照组, 浓度为.5%); 2RITA 组, 设置 3 种浓度 :1μmol/L 4μmol/L 1μmol/L, 以 DMSO 为溶剂配制 MTS 法进行细胞药敏检测取各药物处理组处理后的细胞, 制成浓度为个 /ml 的细胞悬液, 分到 96 孔板中,1μl/ 孔, 每种浓度药物组各设 3 个复孔收集各个时间点的细胞 (h 24h 72h 12h 168h) 加入 celtiter96aq 单溶液细胞增殖检测试剂 (MTS), 比例为 1/1( 即 1μl 培养液加入 1μl 检测液 ) 在 5% CO 2 37 培养箱中孵育 4h 后, 酶标仪检测波长 49nm 处吸光度值 (A 值 ) 肿瘤细胞抑制率 (IR)=(1- 实验组 A 值均值对照组 A 值均值 ) 1%( 同一时间 ) 荧光定量 PCR 法 (qrt-pcr) 定量检测细胞中 p53 和 p21mrna 的表达水平 1 分别取对数增长期 U251 和 U87 细胞, 调成每孔 8 个细胞悬液接种于 6 孔板, 置于 37,5% CO 2 培养箱中培养 24h 后分别加入 1μmol/L 5μmol/LRITA, 同时设 DMSO 对照组, 每组 3 个复孔, 培养 168h 2 收集处理过的 U87 U251 细胞,Trizol 法分离提取总 RNA, 使用 RNase-free 的 DNaseⅠ(Promega) 去基因组 ; 紫外分光光度仪检测所提取 RNA 的纯度 ;1% 琼脂糖凝胶电泳仪检测完整度 ;Promega 逆转录试剂盒反转录合成 cdna 链 3 根据 NCBI 数据库所公布的 p53 和 p21 序列信息设计引物 :P53 -F:5 -TTCTACAGTT GGGCAGCT-3,R:5 -GCAGTAAGCCAAGATCAC- 3 ;P21-F:5 -TGGTGGCAGTAGAGGCTATG-3,R: 5 -AGTCCAGGCCAGTATGTTAC-3 定量 PCR 仪扩增目的基因, 获得并且分析扩增曲线和熔解曲线 Westernblot 法检测 p53 和 p21 蛋白表达取处理过的细胞, 用 PBS 冲洗, 在冰上充分裂解后, 置于 4 下 14r/min 离心 5min, 取上清液, 加入上样缓冲液沸水中煮沸 1min, 进行 SDS-PAGE 电泳, 低温条件下,1V 恒压转膜 6min~12min, 取出膜封闭 1h, 加一抗稀释液 4 过夜, 次日加入相应二抗稀释液 37 孵育 1h, 放至暗盒, 显影 1.3 统计学处理基因测序结果进行 NCBIBLAST 比对 qrt-pcr 法检测 mrna 表达量结果以相对表达量表示 : 相对表达量 =(2 -ΔΔCt ) 的平均值 ± 标准偏差,ΔCt=( 目的基因 Ct- 内参 Ct) 的平均值 ± 标准偏差 ;ΔΔCt=( 待测样品中目的基因 ΔCt- 参照样品中目的基因 ΔCt) 的平均值 ± 标准偏差, 选择 U87 为参照进行计算 ) 采用 SPSS2. 统计学软件对 MTS 结果进行统计学处理计算 IC 5, 显著性比较用重复测量数据方差分析和单变量方差分析, 以 P<.5 为

3 3 差异有统计学意义 2 结果 2.1 基因测序结果扩增得到的目的片段经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析得到的结果如图 1, 扩增基因片段为 75bp M 1 2 增殖率 (%) 时间 (h) DMSO 1 mol/l RITA 4 mol/l RITA 1 mol/l RITA 2bp 1bp 75bp 5bp 25bp 1bp 注 :M:DL2DNAMarker;1:p53-U251PCR 扩增产物 ;2:p53-U87PCR 扩增产物图 1 PCR 扩增结果测序结果显示, 扩增的 U87 目的基因序列与人类 p53 蛋白 mrna 序列相似度为 1%, 确认 U87 细胞中 p53 基因为野生型 U251 目的基因序列与人类 p53 蛋白 mrna 序列相似度为 99%, 有 2 个突变位点分别发生了 A-T 突变和 A-G 突变, 如图 2 所示, 表明 U251 细胞中 p53 基因为突变型图 2 U251 细胞中 p53 基因突变位点 2.2 RITA 人脑胶质瘤细胞 U251 和 U87 增殖的抑制作用 MTS 结果显示,1μmol/L 4μmol/L 及 1μmol/L 的 RITA 对 U251 和 U87 细胞株的增殖均有较显著的抑制作用, 且随浓度增加抑制率也增加增值率随时间和浓度变化情况如图 3 和图 4 所示 RITA 对人脑胶质瘤细胞的增值抑制作用随浓度增加而增强同时发现, 经相同浓度 RITA 作用后的 U251 和 U87 细胞增殖情况差异有统计学意义 (P<.5) 计算 RI TA 作用于 U251 U87 细胞 24h 和 12h 的 IC 5 分别为 μmol/L μmol/L 和 2.817μmol/L 7.147μmol/L 结果表明, 同等浓度的 RITA 对表达突变型 p53 基因的 U251 细胞的抑制作用强于对表达野生型 p53 基因的 U87 细胞的抑制作用增殖率 (%) 图 3 RITA-U251 增殖率变化时间 (h) 图 4 RITA-U87 增殖率变化 DMSO 1 mol/l RITA 4 mol/l RITA 1 mol/l RITA 根据公式抑制率 (IR)=(1- 实验组 A 值均值对照组 A 值均值 ) 1%( 同一时间 ) 计算, 得 2 组细胞各浓度的抑制率变化如表 1, 对比结果可知各个时间点各浓度 RITA 对 U251 细胞的抑制率均大于对 U87 细胞的抑制率表 1 不同浓度 RITA 作用后 U251/U87 的抑制率 (%) 24h 72h 12h 168h 不同浓度 RITA U251/U87 U251/U87 U251/U87 U251/U87 DMSO./../../../. 1μmol/LRITA 2.93/ / / / μmol/LRITA 7.58/ / / / μmol/LRITA13.84/ / / / RITA 对人脑胶质瘤细胞 U251 和 U87 中 p53 和 p21 基因表达的影响与 DMSO 组对比,U251 细胞 1μmol/LRITA 组 p53 基因 mrna 相对表达量稍有下降, 而 5μmol/LRITA 组显著增加 ( 图 5 图 6);RITA 组 p21 基因 mrna 相对表达量增加, 与 RITA 浓度显正相关 (r=.994,p<.5) U87 细胞在 1μmol/L 5μmol/LRITA 作用下 p53 基因 mrna 相对表达量增加不明显, 而 p21 基因 mrna 相对表达量显著增加且与 RITA 浓度显正相关 (r=.999,p<.5) 与 DM SO 组对比,1μmol/LRITA 组 U251 细胞和 U87 细胞

4 中的 p53 蛋白表达稍减少, 而 5μmol/LRITA 组表达均显著增加 1μmol/L 5μmol/LRITA 组 U251 和 U87 细胞中 p21 蛋白表达均增加且随 RITA 浓度增加而增加 ( 图 7) 相对表达量 14 12 1 8 6 4 2 U251 DMSO U251 1 mol/l U251 5 mol/l 组别 U87 DMSO U87 1 mol/l U87 5

4 4 中的 p53 蛋白表达稍减少, 而 5μmol/LRITA 组表达均显著增加 1μmol/L 5μmol/LRITA 组 U251 和 U87 细胞中 p21 蛋白表达均增加且随 RITA 浓度增加而增加 ( 图 7) 相对表达量 U251 DMSO U251 1 mol/l U251 5 mol/l 组别 U87 DMSO U87 1 mol/l U87 5 mol/l 图 5 qrt-pcru251 和 U87 细胞中 p53 的表达水平相对表达量上有着重要作用肿瘤凋亡和 p53 再生化合物 RITA 是新近发展起来的小分子抑癌药物, 具有高效促凋亡作用到目前为止已有报道 RITA 参与野生型 p53 突变型 p53 的肿瘤治疗中 ( 重新 ) 激活 p53, 恢复 p53 的凋亡诱导功能, 目前已作为 MDM2 的拮抗剂进入了临床前实验研究 [8-13] 本实验结果表明, 在浓度 1μmol/L 时,RITA 对人脑胶质瘤细胞有显著的抑制作用, 且表达突变型 p53 基因的 U251 比表达野生型 p53 基因的 U87 对其更敏感 RITA 作用下,U251 细胞中 p53 和 p21 基因 mrna 和蛋白质表达均显著增加,U87 细胞中 p53 蛋白大量累积同时 p21 基因 mrna 和蛋白质表达均显著增加, 印证了 RITA 可能具有激活 p53 基因或者调节 p53 通路相关蛋白的功能化疗和放疗是目前脑胶质瘤术后的常规治疗手段, 但是相关研究表明, 脑胶质瘤对化疗存在耐药性而对放疗存在放射抵抗 [14-16], 特别对于 p53 基因突变型脑胶质瘤因此迫切需要开发安全高效的新型抗癌药物本次实验表明,p53 靶向小分子 RITA 具有高效抑制人脑胶质瘤细胞增值的作用, 提示 RITA 在药物领域深度研究和前沿医疗应用上具有重要意义, 可能解决 p53 基因突变型脑胶质瘤耐药性等问题该结果可为今后研究 RITA 治疗脑胶质瘤提供参考 U251 DMSO U251 1 mol/l U251 5 mol/l 组别 U87 DMSO U87 1 mol/l U87 5 mol/l 图 6 qrt-pcru251 和 U87 细胞中 p21 的表达水平 3 讨论 U251p53 U87p53 U251p21 U87p 注 :1:DMSO;2:1μmol/LRITA;3:5μmol/LRITA 图 7 Westernblot 法结果 p53 基因是一种肿瘤抑制基因, 已成为肿瘤治疗研究方面的热点 p21 是位于 p53 基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子, 可与 p53 共同构成细胞周期 G1 检查站 p53 基因在肿瘤的发生发展以及治疗参考文献 [1] MatsudaK,SatoA,OkadaM,etal.TargetingJNKfortherapeutic depletionofstem-likeglioblastomacels[j].scirep,212,2 (1):516. [2] IsaevaN,BozkoP,EngeM,etal.SmalmoleculeRITAbindsto p53,blocksp53-hdm-2interactionandactivatesp53function intumors[j].naturemedicine,24,1(12): [3] SahaMN,JiangH,MukaiA,etal.RITAinhibitsmultiplemyelo macelgrowththroughinductionofp53-mediatedcaspase-de pendentapoptosisandsynergisticalyenhancesnutlin-inducedcy totoxicresponses[j].molcancerther,21,9(11): [4] SahaMN,JiangH,YangY,etal.Targetingp53viaJNKpath way:anovelroleofritaforapoptoticsignalinginmultiplemyelo ma[j].plosone,212,7(1):e3215. [5] ZhaoCY,SzekelyL,BaoWJ,etal.Rescueofp53Functionby Smal-MoleculeRITA incervicalcarcinomabyblockinge6- MediatedDegradation[J].CancerResearch,21,7(8): [6] GirardiniJE,DelSalG.Improvingpharmacologicalrescueofp53 function:ritatargetsmutantp53[j].celcycle,214,9(11): [7] RohJL,KoJH,MoonSJ,etal.Thep53-reactivatingsmal- moleculeritaenhancescisplatin-inducedcytotoxicityandapop tosisinheadandneckcancer[j].cancerlet,212,325(1): [8] SurgetS,DescampsG,BroseauC,etal.RITA(Reactivatingp53 andinducingtumorapoptosis)iseficientagainsttp53abnormal myelomacelsindependentlyofthep53pathway[j].bmccancer, 214,14(1):

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:TGF-β bfgf 23 KEY WORDS:transforminggrowthfactor-β ;basicfibroblastgrowthfactor; bonemarrow mesenchymalstemcels;eukaryoticexpressionvector; liposomet

:TGF-β bfgf 23 KEY WORDS:transforminggrowthfactor-β ;basicfibroblastgrowthfactor; bonemarrow mesenchymalstemcels;eukaryoticexpressionvector; liposomet 2 ( )208 58 JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)208,Vol.58No. TGF-β bfgf,, 2 (., 330006; 2., 5040) : -β (TGF-β ) (bfgf) (BMSCs), SD BMSCs Percol PCR TGF-β bfgf, pcdna3.(+), 3 BMSCs RT-PCR Westernblot

2 和 p53 再生化合物 (reactivatorofp53andinductionof tumorapoptosis,rita), 三环噻吩衍生物, 是一种潜在的抗癌先导化合物 研究表明,RITA 与 p53 结合, 激活野生型 p53, 促进 p53 的累积 ; 同时在体内外抑制 p53 与

2 和 p53 再生化合物 (reactivatorofp53andinductionof tumorapoptosis,rita), 三环噻吩衍生物, 是一种潜在的抗癌先导化合物研究表明,RITA 与 p53 结合, 激活野生型 p53, 促进 p53 的累积 ; 同时在体内外抑制 p53 与