# 西安交通大学学报 医学版 第 卷 活性氧 5"/ ;""7" "7$& 是指一类化学活性分子家族 其包括羟自由基 超氧阴离子. 单线态氧 及过氧化氢 5 0" "5" 等 参与调控生物细胞功能 细胞信. 号转导和稳态 有研究发现 在肿瘤细胞中可见 # 内源性 $& 水平升高 $& 水平的升高与许

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!" #$# # &'& & 基础研究 抗氧化剂对过氧化氢的急性单核细胞白血病细胞增殖的影响 路晨阳 白改改 申秋菊 蒙 珊 惠凌云 苏 丹 张王刚 周芙玲 西安交通大学 第二附属医院血液内科 陕西西安 # 第一附属医院检验科 陕西西安 摘要 目的 通过建立急性单核细胞白血病活性氧 $& 细胞模型 观察抗氧化剂对其增殖的影响 方法 选用人单核细胞白血病 ' 细胞株 用不同浓度过氧化氢 成功建立 $& 细胞模型后给予不同浓度抗氧化剂超氧化物歧化酶 & 检测细胞增殖 细胞内 $& 含量 线粒体膜电位的变化 结果 低浓度 ) 刺激 ' 细胞增殖 高浓度 ) 对 ' 细胞产生毒性作用 以 ) ' 细胞 #* 建立实验模型 正常 ' 细胞内存在少量 $& 少量凋亡细胞 ) 后细胞内 $& 增多 线粒体膜电位升高 凋亡率下降 细胞增殖旺盛 新合成的 +, 增多 加入不同浓度抗氧化剂 & 随着 & 浓度升高 $& 含量减少 线粒体膜电位下降 凋亡率增加 细胞增殖减慢 新合成的 +, 减少 表现出剂量依赖性 结论 抗氧化剂对急性单核细胞白血病细胞增殖有抑制作用 且表现剂量依赖性 关键词 急性单核细胞白血病 活性氧自由基 $& 抗氧化剂 细胞增殖 线粒体膜电位 超氧化物歧化酶 & 中图分类号 $ 文献标志码,! "# $!"#! & $ ' )' -". /0 1,/.0/ &+!.! + &/ ' ) 0.! &' / 2,+ 3/0.0/0 2 '!. 0 "/5 " 6 " /0 "&",6/" 7 / 6 8 9/ : / 0' ;"578 9/ # -/)/ 5/ 5 " 57,6/" 7 / 68 9/ : / 0' ;"578 9/ - / " # #### # # )*$# "& #" + " ## "",*+" )*$# "& #+ "+ ## """ $*-&." # "# ##)*$" # "#&/+##,*/" # + ##,* / "#" ## #&#+"+ /,*#* "&##" )*$" ## /,* ##)*$ # "#"+ 0"-'1 + #" "# "&1 + ## """ $*-##)*$ # " " + 0" -'1 "#"" # +" "+ + + #"+#+"" " "& 1" ## ### " " "& ) * # ## # " # )*$" # # " "" $*- 收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目 '&* 年中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 '& *## $ " '' $# # " '&*" ")#" '& *## 通讯作者 周芙玲 &0 &# 优先出版 +++&# & # "&&)& *& &#&*

2 # 西安交通大学学报 医学版 第 卷 活性氧 5"/ ;""7" "7$& 是指一类化学活性分子家族 其包括羟自由基 超氧阴离子. 单线态氧 及过氧化氢 5 0" "5" 等 参与调控生物细胞功能 细胞信. 号转导和稳态 有研究发现 在肿瘤细胞中可见 # 内源性 $& 水平升高 $& 水平的升高与许多肿瘤细胞发展相关 可促进其恶性转化 上调存活途径和 +, 损伤诱导的突变 $& 还可调节磷酸激酶 磷酸酶 氧化还原敏感的转录因子和相关基因的. 表达 促进恶变 研究组前期及 &,))$ 等的研究发现 $& 参与急性白血病的发生发展 本研究选用人急性单核细胞白血病 ' 细胞株 通过模拟急性单核细胞白血病复发时的高增殖状态 研究抗氧化剂对其增殖的作用 从而为防治白血病复发的抗氧化剂药物提供实验依据 + 材料与方法 + + 试剂 二甲基亚砜 " 7!" &.#. 二甲基噻唑... 二苯基四氮唑溴盐.#. ".. /.."..."5/! 5" 超氧化物歧化酶 & 均购自美国 & 0 / 公司 ' +, 细胞增殖检测试剂盒购自锐博生物科技有限公司 $& 检测试剂盒购自普利莱基因技术有限公司 :-. 线粒体膜电位检测试剂盒 购自碧云天生物技术研究所 $..# 培养基 胎牛血清均购自美国 " +, 细胞培养方法 用含 )) 胎牛血清 双抗 青 链霉素各 ' ) 的 # 培养基 在 ))- 条件下生长传代 实验时取对数生长期的细胞 +-. 不同浓度 /,, 对 01. 细胞的影响 法检测不同浓度 对 ' 细胞增殖的影响 收集对数生长期的 ' 细胞 调至密度为 ) 接种于 孔板培养 # 加入终浓度为 # *) 的 作为实验组 不加药物组为阴性对照 不加细胞的 # 培养液为空白组 每组设定 个复孔 重复 次 分别培养 ##* 加入 ) 继续培养 # 吸弃上清 加 & 每孔 ) 震荡 用酶标仪检测各孔, 值 <# 计算细胞存活率 绘制 ' 细胞生存曲线 细胞存活率 < 药物组, 值 > 空白组, 值 对照组, 值 > 空白组, 值 并用倒置显微镜观察 ' 细胞形态 +., 对 ' 细胞内 $& 的影响 严格按照 $& 检测试剂盒产品手册 检测浓度为 ) ' 细胞 细胞内 $& 含量 +.. 透射电镜观察 作用 ' 细胞的超微结构变化 浓度为 ) ' 细胞 #* 用 )) 戊二醛固定液 # 固定细胞 ) 磷酸缓冲液浸洗 0) 四氧化锇固定液固定 ) 磷酸缓冲液浸洗 乙醇梯度脱水 环氧树脂 * 浸透 包埋 聚合后作半超薄切片 美兰染色后光学显微镜下定位 超薄切片机制作 超薄切片 醋酸铀 柠檬酸铅染色后 透射式电子显微镜下观察 拍照 +- 不同浓度抗氧化剂对 /,, 作用 01. 细胞后的影响 + + 实验分组 依据上述实验结果 建立低浓度 刺激细胞增殖模型 ) ' 细胞 #* 为模型组 即 组 将 组细胞密度调至 ) 每孔 ) 接种于 孔细胞培养板上 加入不同浓度抗氧化剂 & ') #* 为实验组 并设正常 ' 细胞为对照组 +, 细胞内 $& 的变化 严格按照活性氧检测试剂盒检测各组细胞内 $& 含量 +. 线粒体膜电位的影响 分别于 前后 不同浓度抗氧化剂前后 用线粒体膜电位检测试剂盒 :-. 检测各组 ' 细胞线粒体膜电位变化 并用流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况 +' 检测细胞增殖变化 分别于 前后 不同浓度抗氧化剂前后 严格按照 ' +, 细胞增殖检测试剂盒检测各组细胞增殖情况 + 统计学 采用 & &&* 软件进行统计分析 所有实验结果用均数 标准差 表示 组间比较采用单因素方差分析和 )&. 检验 为差异有统计学意义, 结 果,-+ 不同浓度 /,, 对 01. 细胞存活率的影响 结果显示 对 ' 细胞同一时间时 呈现出低浓度促进 高浓度抑制的双向调节作用 同一 浓度作用时 随着时间延长 细胞存活率下降 ) ' 细胞 #* 细胞生长状态良好 稳定 图,-, 倒置显微镜观察不同浓度 /,, 作用后 01. 细胞的形态变化 低浓度 ) 作用 ' 细胞后 细胞增殖活跃 数量增多 体积变大 外形规则 边缘光滑 折光性好 死亡细胞很少 活细

3 期 路晨阳 白改改 申秋菊 等 抗氧化剂对过氧化氢的急性单核细胞白血病细胞增殖的影响 # 胞数明显较正常 ' 细胞组多 随着 浓度增加 细胞增殖逐渐减慢 数量减少 细胞变形并出现细胞碎片 图,-. 不同浓度 /,, 作用 01. 细胞内活性氧变化 不同浓度 ' 细胞 随时间延长 细胞内 $& 含量增加 ) ' 细胞后 时 $& 含量迅速增加 之后随时间延长细胞内 $& 缓慢增加 而 ) ' 细胞 时细胞内 $& 含量迅速增加 后随时间延长细胞内 $& 含量缓慢增加 比 ) 产生的 $& 含量高 图 图 + 不同时间及不同浓度 /,, 对 01. 细胞存活率的影响 06"7 66"5""/"5/ 6 ' "7!5; ;/5/" 图, 不同浓度 /,, 作用 01. 细胞后的形态变化 0 50 //0"7 6' "75"/" 6"5" "5/7 6#, 正常 ' 细胞 1 ) -) ) 观规则 细胞表面突起 核质比例高 核染色质丰富 分布均匀 细胞质内有较多细胞器 线粒体形态规则 结构完整 ) ' 细胞后细胞数量多 大小均匀 呈圆形 线粒体肿胀 嵴排列紊乱 部分可见嵴溶解 染色质轻度凝集 图 # 图. 不同浓度 /,, 01. 细胞后不同时间点 荧光强度 0-6! 5"7"" "7 6' "75"/" 6"5" "5/7 6,- 透射电镜观察不同浓度 /,, 作用 01. 细胞的线粒体超微结构变化 正常 ' 细胞呈圆形 外,- 荧光显微镜观察不同浓度抗氧化剂对细胞内 活性的影响 细胞内 $& 特异性荧光探针 - 发绿色荧光 正常 ' 细胞内存在少量 $& 绿色荧光较弱 图, ) ' 细胞后细胞数量增多 绿色荧光增强且明显高于正常 ' 细胞 图 1 ) ' 细胞 #* 后再加入不同浓度抗氧化剂 随抗氧化剂浓度的升高 绿色荧光强度降低 表现出剂量依赖性 图 的 - 图 01. 细胞线粒体超微结构变化 0 # " 5 /!5/75!!5//0"7 6' "7,1 正常 ' 细胞 -) 后 ' 细胞,- 1

4 # 西安交通大学学报 医学版 第 卷 图 01. 细胞内 活性 0$&/ ;"7 6' "7 #, 对照组 1 ) - ) ')& ) ')& ) ')&,- 流式细胞术检测不同浓度 作用后 01. 细胞线粒体膜电位的变化 线粒体膜电位较高时 :-. 在线粒体内形成多聚体 其发射光为红色荧光 细胞凋亡时 线粒体膜电位下降 :-. 以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光 正常 ' 细胞绿色荧光较弱 红色荧光较强 即正常 ' 细胞存在少量凋亡细胞 ) ' 细胞后绿色荧光减弱 红色荧光增强 即 作用 ' 细胞后细 胞增殖旺盛 线粒体膜电位升高 不同抗氧化剂作用细胞后细胞内线粒体膜电位下降 随着 & 浓度增大 红色荧光减弱 绿色荧光增强 图 流式细胞术检测细胞凋亡显示 ) 组与对照组比较 差异具有统计学意义 图 不同浓度 & 作用后 可诱导细胞凋亡 与 ) 组比较 差异具有统计学意义 图 图 不同浓度 作用后 01. 细胞线粒体膜电位变化 0 5 / " 5/" " //0"7 6' "75"/" 6"5" "5/7 6&, 对照组 1 ) - ) ')& ) ')& ) ')&,-0 检测不同浓度 作用后 01. 细胞增殖变化 ' 检测细胞增殖中 红色荧光代表新合成的 +, 蓝色荧光代表 "7 染色后的细胞核 与正常 ' 细胞增殖相比较 ) 作用于 ' 细胞后细胞增殖旺盛 红色荧光较多 即新合成的 +, 多 给予不同浓度抗氧化剂后细胞增殖减慢 红色荧光减弱 新合成的 +, 减少 随 着 & 浓度增大 红色荧光减弱 表明 & 抑制 ) 后 ' 细胞 +, 合成 图 * ) 组的 ' 标记 ' 细胞增殖与对照组比较 差异具有统计学意义 图 与 ) 比较 不同浓度 & 作用后细胞增殖差异有统计学意义 图

5 #期 路晨阳&白改改&申秋菊&等 +抗氧化剂对过氧化氢的急性单核细胞白血病细胞增殖的影响 5! F" 讨 "" 论 有研究表明细胞 的 存 亡 取 决 于 氧 化 还 原 微 环 境 中的 678 水平'低水平的 678 能促进细胞增殖&亚 致死水平的 678 导致正 常 或 癌 前 细 胞 <CD 损 伤 从 而促进恶变&而过 高 的 678 水 平 可 促 进 氧 化 应 激 导 致细胞死亡 *#F##+' 本 实 验 通 过 不 同 浓 度 ;$7$ 作 用 于急性单 核 细 胞 白 血 病 9:!" 细 胞 株&经 O\\ 法 图 J" 不同浓度 <"! 作用后 HIFJ 细胞的早期凋亡率 R "M U U T9:!"1 U -* ' T T F H+.)) U T87< 与对照组! $A ;$7$ 组比较& 1 2 "比较& "$+ 与!> "$ 光学显微镜观察发现低 浓 度! $A";$7$ 刺 激!> $A 9:!" 细 胞 增 殖&活 细 胞 数 量 增 多&而 $!> ;$7$ 诱导 9:!" 细 胞 凋 亡&随 着 ;$7$ 浓 度 增 大 至 大于!> $A 时&表现出细胞毒性作用&细胞变形 并出现细胞碎片&死亡细胞明显增多'进一步证实了 ;$7$ 对细 胞的 增殖呈 现出低浓 度促进 高 浓 度 抑 制 + ' 图 O"$.H 检测 HIFJ 细胞增殖荧光图 R B9:!"1 ) T 2T 3 U 1 21 H >0.M-9 H+ 对照组 $A;$7$ $A;$7$d$ $A;$7$d# $A;$7$d! D# I#!> E#!> 9$A87< <#!> 9$A87< M#!> 9$A87<' $$***+ $$.//0+ ' -./0+ 12' / )#, )#,

6 ## 西安交通大学学报 医学版 第 卷 到损害时 开放 造成线粒体 下降和细 图 1 0 标记 01. 细胞增殖变化 0' "56"5/ /0"7 ' /5A"5 与对照组比较 与 ) 组比较. 的双向调节作用 通过给予 ' 细胞不同浓度 作用不同时间 检测 ' 细胞内 $& 含量的变化发现 随 浓度增大 时间延长 细胞内 $& 含量不断增加 同时电镜观察发现正常 ' 细胞呈圆形 外观规则 细胞表面突起 核浆比例高 核染色质丰富 分布均匀 细胞质内有较多细胞器 线粒体形态规则 结构完整 ) ' 细胞后细胞数量多 大小均匀 呈圆形 线粒体肿胀 嵴排列紊乱 部分可见嵴溶解 染色质轻度凝集 这与前期研究中 透射电镜观察初发 复发 患者外周血单个核细胞线粒体结构变化一致 因此 我们用低浓度 刺激 ' 细胞增殖模拟急性单核细胞白血病 复发时的高增殖状态 我们的前期研究发现 急性单核细胞白血病患者细胞内产生大量 $& 随着细胞内 $& 含量的升高 氧化能力增强 细胞内抗氧化物酶清除过量 $& 消耗了抗氧化物酶 机体的抗氧化防御能力减弱 而化疗缓解患者体内抗氧化物酶活性相比原发组 复发组升高 但仍低于正常对照组 表明血浆中抗 氧化物酶的活性与病情有关 且有研究表明给予抗氧化剂消除过多 $& 可逆转过多 $& 引起的细 胞衰老和细胞功能下降 本实验选用抗氧化剂 & 发现其对增多的 $& 引起增殖旺盛的 ' 细胞有增殖抑制作用 & 是一种内源性抗氧化剂 能抵御. 对细胞的破坏 外源性 & 可能通过强化机体抗氧化保护系统而达到有效的保护作用 有文献报道 & 基因的低表达参与多种肿瘤的发生 维持其恶性增殖 & 可能与抑制恶性肿瘤的发生发展有关 线粒体是细胞内重要的细胞器 合成能量并参与细胞凋亡 细胞凋亡过程中 线粒体膜电位 会发生变化 可以通过线粒体 观察线粒体通 #. 透性 并能很好地评价线粒体的功能 当细胞受 胞内生物合成破坏 细胞能量代谢障碍 并通过 $& 产生 氧化磷酸化及钙稳态失调等多种途径进一步引起细胞损伤 可见检测线粒体膜电位的变化具有重 要意义 :-. 是近年来发现的一种高度特异性的线粒体荧光染料 对 具有更高的敏感性 特异 性更强 结果更可靠. 乙炔基. 脱氧尿嘧啶核苷 ' 是一种胸腺嘧啶核苷类似物 在细胞增殖时取代脱氧胸腺嘧啶核苷插入到新合成的 +, 之中 可以高效 快速 准确地检测新合成的 +, 有效 *. 地检测 & 期细胞的百分比 本实验发现 正常的 ' 细胞内存在少量的 $& 线粒体膜电位低 即正常 ' 细胞存在少量凋亡细胞 ) ' 细胞后细胞内 $& 含量增加 细胞增殖旺盛 线粒体膜电位升高 凋亡率减少 新合成的 +, 增多 加入不同浓度 & 作用 结果显示随着 & 浓度的升高 $& 含量减少 表现出剂量依赖性 细胞内线粒体膜电位下降 细胞凋亡率增加 细胞增殖减慢 新合成的 +, 减少 由此推断 ) 刺激细胞内 $& 增多 增多的 $& 刺激细胞增殖 给予抗氧化剂后 细胞内 $& 含量减少 细胞增殖减慢 凋亡增加 综上所述 低浓度 刺激 ' 细胞增殖 考虑与细胞内 $& 含量增加有关 抗氧化剂 & 对抗 对 ' 细胞的增殖作用 其机制与减轻细胞内 $& 水平 调节细胞内氧化还原水平有关 这提示当白血病细胞内活性氧产生过量时 补充外源性的抗氧化剂可以弥补细胞内源性抗氧化能力的不足并清除活性氧 抑制细胞增殖 因此 抗氧化剂有望成为治疗白血病的有效药 参考文献 '/ &*" ""& * 2##& 3,1' 5-5/. &)" # "" "#&1")" $ **& - 1) 1 2 */ -1'*!2&)*$ # # ## )*$ &' )! 2 ** *#& # -'$*'2,1' & " # #&' 2 * #& 白改改 路晨阳 申秋菊 等 & 氧自由基在急性单核细胞白血病发病中的作用 & 西安交通大学学报 医学版 # #& 下转第 页

7 期 侯 妮 刘 娜 韩 佳 等., 通过抑制自噬反应提高结肠癌.' 的化疗效果 被药物破坏的蛋白或细胞器 而保护细胞并对抗化疗 * 药物 降低化疗药物疗效., 是一种经典的自噬抑制剂 近来有许多研究发现., 能够有效地联合化疗药物促进肿瘤细 胞发生凋亡 如 $,+.,+ &3-2 等 的研究发现 在人前列腺癌细胞中., 可以通过促进细胞色素 - 在细胞质中的释放而促进 7!6 5/. /" 导致的 -. 细胞凋亡 而在乳腺癌 -. 细胞中., 同样可以增加 0) 喜树碱所导致 的细胞死亡 本实验也同样发现 在.' 作用下 人结肠癌细胞中自噬反应增加 通过., 抑制后 细胞凋亡增加 倍以上 自噬对细胞的作用具有两面性 既可以作为细胞生长的 朋友 也可能成为 敌人 这取决于疾病进展的不同阶段 细胞周围环境的变化和治疗干预措施的不同 因此 更深入地研究.' 导致细胞内自噬反应发生的机制及自噬与凋亡间的联系 自噬与肿瘤之间的联系等 并将对自噬的干预用于肿瘤治疗中 将是今后的研究重点并成为肿瘤治疗的新亮点 参考文献!1/12)15 ')!! & ## #& 1 # & 2) '' ), /**)!6* 6& # ##& /# #*# & **'' //!&*#"7 ###&*# * *#& # /1) 1&1 &1 ' 5 1#" $# & 2), 11,/8$/*, )1 &1 "&!*# # &! 3 $,!1!&!" & 2 # 2 ## & $,1)!'!*. )$-)1/&! "#&!"!2 & *,*)2 )'1,1!! -, $ 1 $*'-/&1 "## &!6##* * **&, )!1' 1' *$.3 1*,'$*' - $ ', $& $# # # #"###& #) *** & 12 - '!.1' -! -*'' //!1 &1 " ##" ###+ -'1"& -- # & 编辑 国 荣 上接第 ## 页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编辑 国 荣

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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