364 检验医学 2014 年 4 月第 29 卷第 4 期 LaboratoryMedicine,April2014,Vol29.No4. 菌体制剂, 其发挥抗肿瘤效应的成分尚未明确, 我们前期研究证实, 对人肝癌 Bel 7402 细胞具有明显的增殖抑制作用 [3] 但是, 有关链球菌对人脑胶质

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詹纯铨张
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1 检验医学 2014 年 4 月第 29 卷第 4 期 LaboratoryMedicine,April2014,Vol29.No 文章编号 : (2014) 中图分类号 :R 文献标志码 :A DOI: /j.isn 诱导胶质母细胞瘤 BT325 细胞周期阻滞及凋亡的机制研究王艳 1, 张力平 2, 陈辉 2, 曹宁 2, 朱俊萍 2, 平国玲 2 3, 李卫红 (1. 北京积水潭医院检验科, 北京 ;2. 首都医科大学病原生物学系, 北京 ; 摘要 : 目的 3. 首都医科大学细胞生物学系, 北京 ) 探讨诱导人脑多形性胶质母细胞瘤 BT325 细胞周期阻滞及凋亡的相关作用机制方法体外培养人脑多形性胶质母细胞瘤 BT325 细胞, 噻唑蓝 (MTT) 法检测细胞增殖活性, 倒置显微镜下观察细胞形态变化, 原位染色后荧光显微镜下观察凋亡细胞, 流式细胞术检测细胞周期细胞凋亡率及线粒体膜电位 (MMP), 蛋白质印迹法 (Westernblot) 检测细胞凋亡相关蛋白的表达结果 (10~100mg/L) 可显著抑制细胞增殖, 使细胞周期阻滞于 G2/M 期, 呈时间和剂量依赖性 ; 作用细胞 24h 后,MMP 显著下降 (P<0.01), 凋亡细胞逐渐增多,48h 时各实验组凋亡率明显高于对照组 (P<0.01); (50mg/L) 呈时间依赖性增强细胞 P53 蛋白表达, 抑制 B 淋巴细胞瘤 2(Bcl 2) 蛋白表达, 促使细胞色素 C(CytC) 从线粒体进入胞质, 从而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3 前体 (Procaspase 3) 结论可显著抑制人脑多形性胶质母细胞瘤 BT325 细胞增殖, 影响细胞周期分布, 通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡, 由此发挥其抗肿瘤活性作用关键词 : 链球菌 ; 人脑多形性胶质母细胞瘤 BT325 细胞 ; 细胞周期 ; 细胞凋亡 ; 线粒体膜电位 Researchonthemechanismsofstreptococcalproteininducingcyclearrestandapoptosisinglioblastoma BT325cel WANGYan 1,ZHANGLiping 2,CHENHui 2,CAONing 2,ZHUJunping 2,PINGGuoling 2,LIWeihong 3. (1. DepartmentofClinicalLaboratory, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing100035,China;2. Departmentof PathogenicBiology,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;3.DepartmentofCelBiology,CapitalMedical University,Beijing100069,China) Abstract:Objective Toinvestigatethemechanismsofstreptococcalproteininducingcyclearestandapoptosisin humancerebralglioblastomabt325cel.methods HumancerebralglioblastomaBT325celswereculturedinvitro,and methlcyclopentadienylmanganesetricarbonyl(mtt)asaywasusedtodeterminetheproliferationactivityofbt325cels. ThemorphologicalchangesofBT325celswereobservedbythephase contrastmicroscopy.theapoptoticcelswere observedafterfluorescencestaining.flowcytometrywasusedtodeterminethecelcycle,therateofcelapoptosisandthe changeofmitochondrialmembranepotential(mmp).theexpresionofapoptosis relatedproteinswasdeterminedby Westernblot.Results Streptococcalprotein(10 100mg/L)inhibitedtheproliferationofBT325celssignificantlyand inducedg2/m phasearestintime anddose dependentmanners.mmpdeclined(p<0.01),andapoptoticcels gradualyincreasedafterbt325celsweretreatedwithstreptococcalproteinfor24h.therateofcelapoptosisin determinationgroupwassignificantlyhigherthanthatincontrolgroupat48h(p<0.01).inatime dependentmanner, streptococcalprotein(50mg/l)up regulatedtheexpresionofcelp53protein,down regulatedtheexpresionofb cel lymphoma 2(Bcl 2),ledtothereleaseofmitochondrialcytochromeC(CytC)frommitochondriaintocytoplasm,andthen causedtheactivationoftheprecursorofcysteinylaspartatespecificproteinase3(procaspase 3).Conclusions Streptococcalproteinmayexertitsanticanceractivitythroughinhibitingtheproliferationofhumancerebralglioblastoma BT325cels,efectingthedistributionofcelcycleandinducingcelapoptosisbymitochondrial dependentpathway. Keywords:Streptococus;HumancerebralglioblastomaBT325cel;Celcycle;Celapoptosis;Mitochondrial membranepotential 链球菌具有抗肿瘤作用, 由低毒链球菌 Su 株经青霉素处理并真空冷冻干燥后制成的链球菌制剂 (OK 432) 在日本已广泛应用于肿瘤治疗临床观察表明,OK 432 对多种进展期肿瘤, 如胃癌肺癌宫颈癌口腔鳞状细胞癌和头颈部肿瘤等均有显著抗肿瘤作用 [1 2] OK 432 是一种链球菌全基金项目 : 北京市教育委员会科技发展计划项目 (KM ) 作者简介 : 王艳, 女,1981 年生, 硕士, 医师, 主要从事临床微生物学及免疫学检验工作通讯作者 : 张力平, 联系电话 :

2 364 检验医学 2014 年 4 月第 29 卷第 4 期 LaboratoryMedicine,April2014,Vol29.No4. 菌体制剂, 其发挥抗肿瘤效应的成分尚未明确, 我们前期研究证实, 对人肝癌 Bel 7402 细胞具有明显的增殖抑制作用 [3] 但是, 有关链球菌对人脑胶质母细胞瘤的直接作用及其相关机制尚未见报道因此, 本研究通过观察对体外培养的人脑多形性胶质母细胞瘤 BT325 细胞的增殖细胞周期分布及细胞凋亡的影响, 进一步阐明链球菌抗肿瘤作用的分子机制, 为以链球菌为原料进行抗肿瘤生物制剂的开发和利用提供理论和实验依据材料和方法一材料人脑多形性胶质母细胞瘤细胞株 (BT325, 北京天坛医院神经外科研究所 ), 胰酶大豆肉汤培养基 (TSBY,Difico 公司 ),DMEM 高糖培养基 (Hyclone 公司 ), 磷酸盐缓冲液 (phosphatebuferedsaline, PBS,Gibco 公司 ), 噻唑蓝 (methylcyclopentadienyl manganesetricarbonyl,mtt,sigma 公司 ), 胎牛血清 (fetalbovineserum,fbs, 杭州四季青公司 ),DNA 荧光探针碘化丙啶 (propidiumiodide,pi,fluka 公司 ), 钙依赖性磷脂结合蛋白 Ⅴ 和 PI(Annexin V/ PI) 细胞凋亡试剂盒 ( 北京宝赛生物技术有限公司 ), 线粒体荧光探针罗丹明 (Rho123,Merck 公司 ), 内参 β actin B 淋巴细胞瘤 2(β cel lymphoma 2,Bcl 2) 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3 前体 (precursorofcysteinylaspartatespecificproteinase 3, Procaspase 3) 细胞色素 C(mitochondrial cytochromec,cytc) 单克隆抗体 (SantaCruz 公司 ),P53 单克隆抗体 (Calbiochem 公司 ), 辣根过氧化物酶 (horseradishperoxidase,hrp) 标记的羊抗鼠羊抗兔 IgG( 武汉博士德生物技术有限公司 ), 电化学发光 (electrochemiluminescence,ecl) 试剂 (Milipore 公司 ) 二方法 1. 细菌蛋白的提取 A 群溶血性链球菌株 ( 中国医学细菌保藏中心 ), 本室前期体外实验证实此菌株同制备 OK 432 的 Su 株类似, 具有较强的抗肿瘤功能链球菌在 TSBY 培养基中 37 培养, 取对数生长末期细菌, 参照 Winters [4] 的方法提取 2. 细胞增殖抑制实验及细胞形态学观察细胞用含 10% PBS 的 DMEM 高糖培养基常规培养传代将处于对数生长期的 BT325 细胞 ( /L) 接种于 96 孔板中, 每孔 100μL 37 5% CO 2 条件下培养 4h 后, 实验组分别加入含有 ( 终浓度为和 100mg/L) 的培养基 100μL, 同时设只含培养基 (100μL/ 孔 ) 的对照组, 分别继续作用细胞和 72h, 终止前 4h 每孔加入浓度为 5g/L 的 MTT20μL 终止时每孔加入 150 μl 二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide,dmso), 震荡混匀 10min, 酶标仪上测定 570nm 吸光度 (A) 值同时,BT325 细胞以 / 孔接种于 6 孔板中,50mg/L 的作用细胞和 72h 后, 倒置显微镜下直接观察细胞形态变化 3.DNA 倍体分析检测细胞周期 (10~100mg/L) 作用 BT325 细胞和 72h 后, 每组收集个细胞,PBS 洗涤 2 次,70% 的冷乙醇 4 固定过夜用 PBS 洗涤 2 次后, 核糖核酸 (RNase) 酶 ( 终浓度 100mg/L)37 孵育 30min, 加入 PI( 终浓度为 100mg/L),4 避光反应 30min 后, 采用流式细胞仪分析细胞周期各时相细胞比率的变化 4. Rho123 染色法检测线粒体膜电位 (mitochondrialmembranepotential,mmp) (10~100mg/L) 作用于 BT325 细胞 24h 后, 每组收集个细胞,PBS 洗涤 2 次, 用新鲜培养基 1mL 悬浮细胞, 加入终浓度为 5mg/L 的 Rho123,37 避光孵育 30min 经 PBS 洗涤细胞 2 次后, 再用 1mLPBS 重悬细胞, 在流式细胞仪上检测 MMP 5. 原位染色法观察凋亡细胞 BT325 细胞以 / 孔接种于 24 孔板中, (10~100mg/L) 作用细胞 24h 后,PBS 洗涤细胞 2 次, 加入 Annexin V 异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)/PI 双染色, 避光作用 10min, 于倒置荧光显微镜下观察凋亡细胞 6.Annexin V/PI 检测细胞凋亡率 (10~100mg/L) 作用 BT325 细胞 48h 后, 每组收集个细胞,PBS 洗涤 1 次后, 参照 Annexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明处理细胞, 采用流式细胞仪检测细胞的凋亡率 7. 蛋白质印迹法 (Westernblot) 检测细胞凋亡相关蛋白的表达 (50mg/L) 作用于 BT325 细胞和 72h 后, 每组收集个细胞,PBS 洗涤 1 次后, 参照文献 [5] 方法提取细胞总蛋白蛋白样本煮沸变性, 经电泳转膜封闭后, 分别加入 P53 抗体 (1 200) Bcl 2 抗体 (1 500) Procaspase 3 抗体 (1 200) CytC 抗体 (1 1000) 和 β actin 抗体 (1 1000)4 结合过夜,HRP 标记的 IgG(1 5000) 室温孵育 1h, 洗膜

年月第卷第期检验医学ｂｙｍｄＡｌＶｌＮ后与底物ＥＣ试剂反应Ｘ线片曝光显示结果三统计学方法采用ＳＰＳＳ软件进行统计分析数据以表示组间比较采用单因素方差分析以Ｐ珋± 为差异有统计学意义结有剂量依赖关系随着作用时间的延长凋亡细胞增多ｈ后细胞周期最终阻滞于ＧＭ期Ｐ见图表果一对ＢＴ细胞增殖及形态的影响链球菌蛋白ｍｇ

3 年月第卷第期检验医学ｂｙｍｄＡｌＶｌＮ后与底物ＥＣ试剂反应Ｘ线片曝光显示结果三统计学方法采用ＳＰＳＳ软件进行统计分析数据以表示组间比较采用单因素方差分析以Ｐ珋± 为差异有统计学意义结有剂量依赖关系随着作用时间的延长凋亡细胞增多ｈ后细胞周期最终阻滞于ＧＭ期Ｐ见图表果一对ＢＴ细胞增殖及形态的影响链球菌蛋白ｍｇ能明显抑制ＢＴ细胞增殖Ｐ或Ｐ其中以ｍｇ作用ｈ效果最为显著见表倒置显微镜下显示正常对照组细胞生长状态良好折光性强呈梭形贴壁生长ｍｇ作用ｈ后细胞折光率下降胞内可见颗粒样物质作用ｈ后细胞形态变得不太规则作用ｈ后大多数细胞圆缩离壁且细胞生长密度降低见图注ｈｂｈｈｄｈ图ｍｇ对ＢＴ细胞形态学的影响表对ＢＴ细胞的增殖抑制作用珋± Ａ值ｍｇｈｈｈ ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 注与ｍｇ比较ＰＰ二对ＢＴ细胞周期的阻滞对数生长期ＢＴ细胞大多数处于ＧＧ期和ＧＭ期Ｓ期最少ＢＴ细胞经链球菌ｍｇ作用ｈ后细胞周期蛋白发生明显改变表现为Ｓ期细胞百分率显著增加ＰＧＭ期显著降低Ｐ或Ｐ注ｈｂｈｈｄｈＡ为凋亡图ｍｇ对ＢＴ细胞周期的影响表对ＢＴ细胞周期的影响时间ｈｍｇ珋± 细胞周期ＧＧ ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 注与同时间ｍｇ比较ＰＰＳ ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ＧＭ ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

年月第卷第期检验医学ｂｙｍｄＡｌＶｌＮ三对ＢＴ细胞ＭＭＰ的影响Ｃ表达增多Ｐ表达放到胞质中的Ｃｙｍｇ作用ＢＴ细下调激活细胞凋亡过程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶胞ｈ后随蛋白浓度升高弱荧光部分Ｄ区ｙｙｌｆＣ家族细胞百分率逐渐增高强荧光部分Ｃ区比率减的级联反应从而导致细胞凋亡的发生见图少阳性峰左移与对

4 年月第卷第期检验医学ｂｙｍｄＡｌＶｌＮ三对ＢＴ细胞ＭＭＰ的影响Ｃ表达增多Ｐ表达放到胞质中的Ｃｙｍｇ作用ＢＴ细下调激活细胞凋亡过程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶胞ｈ后随蛋白浓度升高弱荧光部分Ｄ区ｙｙｌｆＣ家族细胞百分率逐渐增高强荧光部分Ｃ区比率减的级联反应从而导致细胞凋亡的发生见图少阳性峰左移与对照组相比中高浓度组ｍｇ细胞ＭＭＰ下降显著Ｐ见表图表作用ｈ后对ＢＴ细胞ＭＭＰ的影响珋± 细胞百分率ｍｇ弱荧光部分Ｄ区强荧光部分Ｃ区 ± ± ± ± ± ± ± ± 注与ｍｇ比较Ｐ注ｍｇｂｍｇｍｇ四对ＢＴ细胞凋亡的影响ｄｍｇｍｇ作用ＢＴ细图作用ｈ后对ＢＴ细胞ＭＭＰ的影响ＶＦＩＴＣＰＩ双染后早期凋亡胞ｈ经Ａ细胞的胞膜结合ＡＶ显示绿色晚期凋亡细胞的胞核被ＰＩ红染胞膜被ＡＶ绿染坏死细胞则全染成红色随细菌蛋白浓度的增加凋亡细胞逐渐增多见图采用流式细胞仪检测作用细胞ｈ的细胞凋亡百分率结果显示早晚期细胞凋亡百分率随蛋白浓度的升高而明显增加Ｐ见图表五对ＢＴ细胞凋亡相关蛋白的影响Ｗｂｌ结果显示ｍｇ的链球菌蛋细胞随作用时间的延长抑癌白作用于ＢＴ基因表达明显上调凋亡抑制蛋白Ｂｌ表达逐渐降低且在ｈ时表达缺失细胞线粒体释注ｍｇｂｍｇｍｇｍｇｄ图作用ｈ后ＢＴ细胞的凋亡注ｍｇｂｍｇｍｇｄｍｇ图作用ｈ后对ＢＴ细胞凋亡率的影响

检验医学 2014 年 4 月第 29 卷第 4 期 LaboratoryMedicine,April2014,Vol29.No4. 367 表 4 作用 48h 后对 BT325 细胞凋亡率的影响 (%, 珋 x±s) (mg/l) 细胞百分率活细胞早期凋亡细胞晚期凋亡细胞死细胞 0 96.83±1.80 1.03±0.51 0.43±0.23 1.67±1.45 10 34.30±2.

5 检验医学 2014 年 4 月第 29 卷第 4 期 LaboratoryMedicine,April2014,Vol29.No 表 4 作用 48h 后对 BT325 细胞凋亡率的影响 (%, 珋 x±s) (mg/l) 细胞百分率活细胞早期凋亡细胞晚期凋亡细胞死细胞 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±2.26 注 : 与 0mg/L 比较, P<0.01 图 6 (50mg/L) 对 BT325 细胞凋亡相关蛋白表达的影响讨细胞周期调控是机体维持细胞有序增殖及稳定基因组的关键, 它的失控是肿瘤发生的重要原因之一, 抗肿瘤药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用常通过对细胞分裂产生周期阻滞而实现, 且不同影响因素有不同的周期特异性 [6] 本研究结果显示, 较低作用浓度 (10mg/L) 的就可以抑制 BT325 细胞增殖, 且在 10~100mg/L 浓度范围内对细胞株的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性同时, 肿瘤细胞形态学亦出现相应改变, 推断其机制与可能直接损伤细胞 DNA 有关本研究显示, 随着蛋白作用时间的延长, 凋亡细胞增加,72h 后 S 期细胞明显减少, 细 [7 8] 胞周期最终阻滞于 G2/M 期, 这与 Lin 等的研究结果类似干扰细胞周期过程可引起细胞凋亡, 而细胞凋亡与肿瘤的发生发展及其治疗都有密切关系, 因此探讨各种诱导肿瘤细胞凋亡的途径成为研究肿瘤治疗的一个新方向 [9] 目前认为, 细胞凋亡过程受到来自细胞内外诸多信号的调控, 线粒体通路是最普遍的凋亡信号通路之一 [10 11] 检测 MMP 中, 以线粒体跨膜电位的高低作为鉴定细胞论凋亡指标之一, 结果表明作用细胞 24h 后,10mg/L 细菌蛋白作用细胞的弱荧光细胞数开始增多,50 和 100mg/L 细菌蛋白处理细胞的弱荧光细胞比率分别达到 (28.57±1.82)% 和 (46.00±2.54)%, 提示线粒体膜的通透性转换孔复合体开放, 使内膜离子通道改变,MMP 下降或丧失, 线粒体功能受损, 导致线粒体内凋亡相关蛋白的释放来诱导细胞进入凋亡程序除直接促进下游促凋亡因子的转录来诱导细胞凋亡外, p53 抑癌基因的另一主要促凋亡途径就是内源性线粒体途径活化的 P53 向线粒体快速转位, 并与位于线粒体膜上的 Bcl 家族成员相互作用, 改变线粒体外膜通透性, 使线粒体内促凋亡蛋白 CytC Smac(Diablo) 和凋亡诱导因子 (AIF) HtrA2(Omi) 和 EndoG 等释放到胞质, 激活 Caspase 等效应分子, 从而诱导细胞凋亡 [11 12] Caspase 3 是细胞凋亡中起最终执行作用的重要剪切酶, 它以低活性酶原 Procaspase 3 的形式合成出来只有当 Procaspase 3 被活化后才能发挥功能, 病变细胞中该转化机制有可能会被破坏, 所以在大部分癌细胞中发现 Procaspase 3 水平高于正常细胞 [13] 本研究表明, 随作用时间的延长,P53 蛋白表达水平逐渐增强, 维持细胞线粒体膜稳定性的抗凋亡蛋白 Bcl 2 表达明显下调, 细胞线粒体内促凋亡蛋白 CytC 表达有明显增加趋势, 通过下调 Procaspase 3 的表达激活细胞凋亡的下游事件, 最终使 BT325 细胞发生凋亡综上所述, 对人脑多形性胶质母细胞瘤 BT325 细胞具有明显的增殖抑制作用, 将细胞周期阻滞于 G2/M 期, 降低 MMP, 影响 P53 Procaspase 3 Bcl 2 和 CytC 等重要凋亡相关蛋白

6 368 检验医学 2014 年 4 月第 29 卷第 4 期 LaboratoryMedicine,April2014,Vol29.No4. 的表达, 初步揭示了线粒体途径可能是诱导 BT325 细胞发生凋亡的作用机制之一, 为用链球菌治疗人脑胶质母细胞瘤提供了新的重要实验依据, 具有潜在应用前景但是, 对细胞周期蛋白细胞线粒体功能异常的相关作用位点及其他促凋亡途径的作用等还有待进一步深入研究参考文献 [1] TanoT,OkamotoM,KanS,etal.Growthinhibition andapoptosisbyanactivecomponentofok 432,a streptococcalagent,viatol likereceptor4inhuman headandneckcancercellines[j].oraloncol, 2012,48(8): [2] 李彦芹, 王艳, 曹宁, 等. 对人肝癌 Bel 7402 细胞及人正常肝细胞生长的影响 [J]. 首都医科大学学报,2008,29(5): [3] 李彦芹, 郑群, 王艳, 等. 对人肝癌 Bel 7402 细胞的增殖抑制作用及其分子机制 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2007,11(43): [4] WintersBD,RamasubbuN,StinsonMW.Isolation and characterization ofa Streptococcus pyogenes proteinthatbindstobasallaminaeofhumancardiac muscle[j].infectimmun,1993,61(8): [5] BenzinaS,DebomyF,BergeratJP,etal.The cytotoxicityofhigh linearenergytransferradiationis reinforcedbyoxaliplatininhumanglioblastomacels [J].CancerLet,2007,254(1): [6] LiT,KonN,JiangL,etal.Tumorsuppresionin the absence of p53 mediated cel cycle arest, apoptosis,andsenescence[j].cel,2012,149(6): [7] LinJP,YangJS,LiJH,etal.Berberineinduces celcyclearestandapoptosisincarcinomasnu 5 celline[j].worldjgastroenterol,2006,12(1): [8] LiJ,ChenW,ZhangP,etal.TopoisomeraseⅡ trappingagentteniposideinducesapoptosisandg2/ M orsphasearestoforalsquamouscelcarcinoma [J].WorldJSurgOncol,2006,4:41. [9] SrivastavaJK,GuptaS.Tocotrienol richfractionof palm oilinducescelcycle arestand apoptosis selectivelyin human prostate cancercels[j]. Biochem BiophysResCommun,2006,346(2): [10] 王艳, 平国玲, 李卫红, 等. 对 5 氟尿嘧啶引起的小鼠脾细胞增殖抑制及凋亡的拮抗作用 [J]. 免疫学杂志,2008,24(2): [11] UrenRT,DewsonG,BonzonC,etal.Mitochondrial release of pro apoptotic proteins: electrostatic interactionscanholdcytochromecbutnotsmac/ DIABLO tomitochondrialmembranes[j].jbiol Chem,2005,280(3): [12] QianY,ChenX.Tumorsuppresionbyp53:making celssenescent[j].histolhisopathol,2010,25 (4): [13] WestDC,QinY,PetersonQP,etal.Diferential efectsofprocaspase 3activatingcompoundsinthe inductionofcancerceldeath [J].MolPharm, 2012,9(5): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 姜敏 ) 檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿