DB11-T 豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2,4-滴、赤霉素、福美双的测定
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1 ICS B 31 备案号 : DB 北京市地方标准 DB11/T 豆芽中 4- 氯苯氧乙酸钠 6- 苄基腺嘌呤 2,4- 滴 赤霉素 福美双的测定 Determination of 4-chlorphenoxyacetic sodium, 6-benzylam inopurine, 2,4-D, gibberellic acid and thiram residues in soybean sprout and mun bean sprout 发布 实施 北京市质量技术监督局发布
2 目次 前言...II 1 范围 氯苯氧乙酸钠残留量的测定 苄基腺嘌呤残留量的测定 ,4- 滴 (2,4- 二氯苯氧乙酸 ) 残留量的测定 赤霉素残留量的测定 福美双残留量的测定...9 I
3 前 言 本标准由通州区质量技术监督局提出 本标准起草单位 : 北京市海淀区产品质量监督检验所 ( 国家食品质量安全监督检验中心 ) 本标准主要起草人 : 曹红 金瑛 刘艳琴 许华 王浩 田艳玲 林立 II
4 豆芽中 4- 氯苯氧乙酸钠 6- 苄基腺嘌呤 2,4- 滴 赤霉素 福美双的测定 1 范围本标准规定了豆芽中 4- 氯苯氧乙酸钠 6- 苄基腺嘌呤 2,4- 滴 赤霉素 福美双的测定方法 本标准适用于豆芽中 4- 氯苯氧乙酸钠 6- 苄基腺嘌呤 2,4- 滴 赤霉素 福美双的残留量分析 2 4- 氯苯氧乙酸钠残留量的测定 2.1 原理试样中的 4- 氯苯氧乙酸钠用稀碱提取后, 在酸性条件下用固相萃取柱将样品中的 4- 氯苯氧乙酸吸附, 使其与基体干扰物分离, 再用甲醇洗脱并用高效液相色谱法测定, 以保留时间定性, 外标法峰面积定量 2.2 试剂与材料 氢氧化钠 (AR) 盐酸 (AR) 磷酸 (AR) 冰醋酸 (AR) 甲醇 (HPLC) 氢氧化钠溶液 (0.01 mol/l): 称取 0.40 g 氢氧化钠, 溶于水并稀释至 1000 ml 亚铁氰化钾溶液 : 称取 10.6 g 亚铁氰化钾 [K4Fe(CN)6 3H2O] 溶于少量水中, 并用水稀释至 100 ml 乙酸锌溶液 : 称取 22.0 g 乙酸锌 [Zn(CH3COO)2] 溶于少量水中, 然后加入 3 ml 冰醋酸并加水稀释至 100 ml 磷酸盐缓冲液 (0.01 mol/l): 称取 1.56 g 的磷酸二氢钠 (NaH2PO4 2H2O) 加水溶解, 并定容至 1000 ml, 用 50 % 的磷酸溶液调节 ph 值至 氯苯氧乙酸标准溶液 : 精密称取 4- 氯苯氧乙酸 ( 含量 99%)0.1 g( 精确到 g), 用甲醇溶解并移入 100 ml 容量瓶中, 稀释至刻度 此溶液每毫升相当于 1.00 mg 4- 氯苯氧乙酸 临用时甲醇稀释浓度为每毫升相当于 0.10 mg 4- 氯苯氧乙酸 固相萃取小柱 (3 m L /500 mg):ods-c18 小柱, 用时先经 10 ml 甲醇洗脱活化, 再用 10 ml 水洗去残留甲醇, 保持萃取柱润湿状态待用 本标准所用水为经纯水制备系统制备后的水 2.3 仪器与设备 高效液相色谱仪 ( 带紫外检测器, 配 ZORBAX SB C18 色谱柱 ) 超声波仪 酸度计 组织捣碎机 Milli-Q 纯水制备系统 2.4 分析步骤 试样制备称取捣碎混匀的豆芽样品 20 g( 精确至 0.1 g) 于 100 ml 容量瓶中, 加入 40 ml 氢氧化钠溶液振摇, 然后分别加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各 5 ml, 混匀, 超声提取 30 min, 用氢氧化钠溶液稀释至 1
5 刻度, 过滤 取 50.0 ml 的滤液, 用浓磷酸调 ph 至 2.5, 然后以 3 ml/min 的流速通过活化的 ODS-C18 小柱 先用 3.0 ml 水洗去水溶性杂质后, 再用甲醇洗脱并定容至 3.0 ml, 过 0.45μm 滤膜后, 供液相色谱分析 标准曲线的制备准确吸取每毫升相当于 0.10 mg 的 4- 氯苯氧乙酸 0.20 ml 0.50 ml 1.00 ml 2.00 ml 4.00 ml 于 100 ml 容量瓶中, 加甲醇稀释至刻度 制成浓度依次为 0.20 mg/l 0.50 mg/l 1.00 mg/l 2.00 mg/l 4.00 mg/l 的标准使用液, 供液相色谱分析 色谱条件色谱柱 :ZORBAX SB C18 柱 (4.6 mm 250 mm 5 μm)( 或相当型号色谱柱 ) 检测波长 :228 nm 流动相 : 甲醇 mol/l 磷酸盐缓冲液 (50+50)(V/V) 流速 :1.0 ml/min 柱温 : 测定吸取 10.0μL 标准使用液和试样液分别注入液相色谱仪, 按照 项条件进行检测, 以保留时间定性, 标准曲线法定量 标样及试样图谱见图 1 及图 计算按式 (1) 计算 A f 1000 X = 1.12 (1) m 1000 式中 : X 试样中 4- 氯苯氧乙酸钠的含量, 单位为毫克每千克 (mg/kg); A 从标准曲线上求出的试样液中 4- 氯苯氧乙酸的质量, 单位为微克 (μg); f 试样的稀释倍数 ; m 试样的取样量, 单位为克 (g); 氯苯氧乙酸转换为 4- 氯苯氧乙酸钠的系数 计算结果保留两位有效数字 2.6 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 % 2.7 检测限在本试验条件下, 豆芽中 4- 氯苯氧乙酸钠的定量检测限为 0.10 mg/kg 图 1 4- 氯苯氧乙酸标样色谱图 2
6 图 2 豆芽样品中 4- 氯苯氧乙酸色谱图 3 6- 苄基腺嘌呤残留量的测定 3.1 原理豆芽中残留的 6- 苄基腺嘌呤经酸化甲醇提取后, 高效液相色谱法测定, 以保留时间定性, 外标法峰面积定量 3.2 试剂与材料 乙酸 (AR) % 乙酸溶液 乙腈 (HPLC) 甲醇 (HPLC) 酸化甲醇溶液 : 每 100 ml 甲醇 + 水 (60+40)(V/V) 中加入乙酸 50μL, 混匀 苄基腺嘌呤标准溶液 : 精密称取 6- 苄基腺嘌呤 0.1 g( 精确到 g)( 含量 99.0%) 于 100 ml 容量瓶, 用甲醇溶解并定容至刻度 此溶液每毫升相当于 1.00 mg 6- 苄基腺嘌呤 临用时用甲醇稀释浓度为每毫升相当于 mg 6- 苄基腺嘌呤 固相萃取小柱 (3 ml/500 mg):ods-c18 小柱, 用时先经 10 ml 甲醇洗脱活化, 再用 10 ml 水洗去残留甲醇, 保持萃取柱润湿状态待用 本标准所用水为经纯水制备系统制备后的水 3.3 仪器与设备 高效液相色谱仪 ( 带紫外检测器, 配 ZORBAX SB C18 色谱柱 ) Ultra-Turrax 搅拌器 离心机 (4500 r/min) 旋转蒸发仪 组织捣碎机 Milli-Q 纯水制备系统 3.4 分析步骤 试样制备称取捣碎混匀的豆芽样品 10 g( 精确至 0.1 g) 于 50 ml 聚丙烯离心管中, 加入 15 ml 酸化甲醇溶液, 用 Ultra-Turrax 搅拌器混匀 3 min, 然后以 4500 r/min 离心 10 min, 上清液转入 100 ml 梨形瓶中, 样品再用 15 ml 酸化甲醇溶液提取, 再次离心, 合并上清液 上清液用旋转蒸发仪蒸发, 以去除甲醇, 剩余水相以 3 ml/min 的流速通过活化的 ODS-C18 小柱, 先用 3.0 ml 水洗去水溶性杂质后, 再用甲醇洗脱并定容至 5.0 ml, 过 0.2μm 有机膜滤过后, 供液相色谱分析 标准溶液系列的配制准确吸取每毫升相当于 mg 的 6- 苄基腺嘌呤 0 ml 0.20 ml 0.40 ml 0.80 ml 1.0 ml 3
7 2.0 ml 5.0 ml 于 25mL 容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度 配制成浓度依次为 0 mg/l 0.08 mg/l 0.16 mg/l 0.32 mg/l 0.40 mg/l 0.80 mg/l 2.00 mg/l 的标准溶液系列, 供液相色谱分析 色谱条件色谱柱 :ZORBAX SB C 18 柱 (4.6 mm 250 mm 5 μm)( 或相当型号色谱柱 ) 检测波长 :267 nm 流动相 : 甲醇 + 乙腈 +1% 乙酸溶液 ( )(V/V) 流速 :1.0 ml/min 柱温 : 测定准确吸取 10.0 μl 标准系列溶液和试样溶液分别注入液相色谱仪中, 按照 条件进行检测, 以保留时间定性, 峰面积外标法定量 标样及试样图谱见图 3 及图 计算按式 (2) 计算 A f 1000 X = (2) m 1000 式中 : X 试样中 6- 苄基腺嘌呤的含量, 单位为毫克每千克 (mg/kg); A 从标准曲线上求出的试样溶液中 6- 苄基腺嘌呤的质量, 单位为微克 (μg); f 试样的稀释倍数 ; m 试样的取样量, 单位为克 (g); 计算结果保留两位有效数字 3.6 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 3.7 检测限在本试验条件下, 豆芽中 6- 苄基腺嘌呤的定量检测限为 0.02 mg/kg mau benzylaminopurine mi 图 3 6- 苄基腺嘌呤标样色谱图 4
8 mau benzylaminopurine mi 图 4 豆芽样品中 6- 苄基腺嘌呤色谱图 4 2,4- 滴 (2,4- 二氯苯氧乙酸 ) 残留量的测定 4.1 原理试样中 2,4- 滴用有机溶剂提取, 用三氟化硼甲醇溶液将 2,4- 滴衍生成 2,4- 滴甲酯, 液 - 液萃取, 凝胶渗透色谱净化除去干扰物质, 以气相色谱电子捕获检测器测定 根据色谱峰保留时间定性, 外标法峰面积定量 4.2 试剂与材料 乙腈 (AR) 甲醇 (AR) 正己烷 (AR) 环己烷 (AR) 乙酸乙酯 (AR) ph 2 的酸性水溶液 : 用 50% 稀硫酸调节水的 ph 为 氯化钠 (AR) g/l 氯化钠溶液 无水硫酸钠 :650 灼烧 4 h 后, 保存于干燥器中 三氟化硼乙醚溶液 :47 %(V/V) 衍生剂 (14 % 三氟化硼甲醇溶液 ): 量取 29.5 ml 三氟化硼乙醚溶液, 用甲醇定容至 100 ml ,4- 滴标准使用液 : 精密吸取 1 ml 2,4- 滴的甲醇标准溶液 ( 浓度 100μg/L), 用甲醇溶解并定容至 100 ml 此溶液浓度为每毫升相当于 1.00μg 2,4- 滴 本标准所用水除另有规定外, 均为蒸馏水 4.3 仪器与设备 气相色谱仪 : 配有电子捕获检测器 凝胶渗透色谱净化系统 组织捣碎机 恒温水浴锅 旋转蒸发器 电动振荡器 顶空分析用 20 ml 玻璃瓶, 配套的铝盖和密封垫 ( 或密封紧密的密封瓶 ) 4.4 分析步骤 提取称取捣碎混匀的豆芽样品 50.0 g( 精确到 0.1 g) 于具塞锥形瓶内, 加入 20 ml 酸性水溶液和 50 5
9 ml 乙腈, 振荡提取 30 min, 过滤, 滤渣用 20 ml 乙腈洗涤两次, 合并滤液于 250 ml 分液漏斗中, 于上述分液漏斗中加入 15 g 氯化钠, 振荡混匀, 静置 40 min, 分层, 提取乙腈层, 用旋转蒸发器除去乙腈, 用 5mL 甲醇分次转移至 20 ml 顶空分析玻璃瓶中 衍生化加 5 ml 衍生剂于上述顶空分析玻璃瓶中, 将玻璃瓶加盖密封, 在 65 水浴中保持 45 min 后, 取出玻璃瓶迅速置于冰浴中冷却, 将衍生反应液转移至盛有 10 ml 50g/L 氯化钠溶液的 50 ml 具塞比色管中, 用正己烷提取二次, 每次 5 ml, 合并有机相, 经无水硫酸钠脱水, 旋转蒸发器挥至近干, 用乙酸乙酯 : 环己烷 (1:1,V/V) 定容至 10mL ,4- 滴甲酯标准工作液的制备取 5mL 2,4- 滴标准使用液, 依 方法制备 2,4- 滴甲酯标准工作液, 经无水硫酸钠脱水, 旋转蒸发器挥至近干后, 用正己烷准确定容至 5mL 此溶液浓度为每毫升相当于 1.00μg 2,4- 滴 凝胶渗透色谱净化选择凝胶渗透色谱柱规格 (200 mm 22 mm i.d.), 柱填料为 Bio Beads S-X 目, 流动相乙酸乙酯 : 环己烷 (1:1,V:V), 流速为 4.7 ml/min, 进样量 5 ml, 样品收集时间 11 min~15 min 衍生化后样品按照上述条件净化, 将约 20 ml 收集液旋转蒸发至近干, 用正己烷准确定容至 5 ml 气相色谱条件气相色谱仪 : 附电子捕获检测器 (ECD,Ni 63 ) 色谱柱 :HP-1MS 石英毛细管色谱柱,φ30 m 250 μm 0.25 mm 载气 : 高纯氮, 纯度 >99.99% 载气流速 :1.0 ml/min 进样方式 : 不分流 程序升温 : 柱初始温度 50, 保持 1 min, 以 25 /min 速率升温至 220, 保持 20 min 进样口温度 : 250 检测器温度 : 测定分别吸取 2,4- 滴经衍生化的标准工作液 试液各 1.0μL 注入气相色谱仪, 按照 的条件进行检测, 以保留时间定性, 色谱峰面积外标法定量 标样及试样图谱见图 5 和图 计算按式 (3) 计算 X = A C V (3) A m 式中 : X 2,4- 滴残留量, 单位为毫克每千克 (mg/kg); A 样液中 2,4- 滴 ( 衍生物 ) 峰面积 ; A0 标准工作溶液中 2,4- 滴 ( 衍生物 ) 峰面积 ; C 标准工作溶液中相当于 2,4- 滴 ( 衍生物 ) 浓度, 单位为微克每毫升 (μg/ml); m 取样量, 单位为克 (g); V 样液的定容体积, 单位为毫升 (ml) 4.6 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 4.7 检测限 6
10 在本试验条件下, 豆芽中 2,4- 滴的定量检测限为 mg/kg 1 溶剂峰 2 2,4- 滴峰 3 未知峰 图 5 2,4- 滴标样色谱图 1 溶剂峰 2 2,4- 滴峰 3 未知峰 图 6 豆芽样品中 2,4- 滴色谱图 5 赤霉素残留量的测定 5.1 原理豆芽中赤霉素经提取后, 先经乙酸乙酯液液萃取初步净化, 再利用凝胶渗透色谱 (GPC) 使目标化合物与基体干扰物分离, 达到分离和净化的目的 用反相高效液相色谱法 DAD 检测器进行色谱分析, 采用标准物质的保留时间 辅助峰扫描光谱纯度对照两种方式对样品峰进行定性, 采用外标法以峰面积计算定量 5.2 试剂与材料 甲醇 (AR) 丙酮 (AR) 乙酸乙酯 (AR) % 硫酸溶液 (V/V) ph 2.5 的酸性水溶液 : 用 50% 稀硫酸调节水的 ph 为 2.5 7
11 5.2.6 无水硫酸钠 (AR) 冰乙酸 (AR) 固相萃取小柱 :Waters SEP-PAK, 用时先经 10 ml 甲醇洗脱活化, 再用 10 ml 水洗去残留甲醇, 保持萃取柱润湿状态待用 赤霉素标准储备液 : 精密称取赤霉素 ( 含量 99.0%)0.1 g( 精确到 g), 用甲醇溶解并定容至 100 ml 此溶液浓度为每毫升相当于 1.00 mg 赤霉素 本标准所用水除另有规定外, 均为蒸馏水 5.3 仪器与设备 高效液相色谱仪 ( 配 DAD 检测器 ) 旋转蒸发仪 组织捣碎机 电动振荡器 凝胶渗透色谱仪 (GPC) 5.4 分析步骤 试样制备称取捣碎后样品 50 g( 精确到 0.1 g) 于锥形瓶中, 加 20 ml 蒸馏水和 100 ml 丙酮, 震荡提取 30 min 混合物经布氏漏斗抽滤, 残渣放回锥形瓶中, 再用 100 ml 丙酮震荡提取 15 min, 用布氏漏斗抽滤, 之后分别两次用 50 ml 丙酮洗涤锥形瓶并倒在滤渣上, 抽滤 将上述多次提取的丙酮 - 水提取液收集于 1000 ml 圆底烧瓶中, 在 30 水浴上, 用旋转蒸发器减压蒸发除去丙酮 剩下的试样水溶液用滤纸过滤, 用 50 ml 蒸馏水洗涤烧瓶并通过同一滤器过滤, 用 20 ml 蒸馏水分别两次洗涤滤纸 将滤液转入烧杯中, 用 50 % 的硫酸溶液调至滤液 ph 为 2.5±0.2 将样液转入 250 ml 分液漏斗中, 以少量蒸馏水洗涤烧杯 然后用 150 ml 乙酸乙酯分 3 次提取样液, 收集乙酸乙酯提取液, 并通过约 15 g 无水硫酸钠滤入 250 ml 圆底烧瓶中, 于 30 水浴中旋转蒸发至干 用 15 ml 环己烷 + 乙酸乙脂 (1:1)(V/V) 混合液充分溶解, 准备待分析样品溶液 10 ml, 进入渗透色谱柱分离, 作用时间 13 min, 流速 4.7 ml/min 收集 6min~13 min 的流出液 收集凝胶渗透色谱 (GPC) 流出液, 于 30 水浴中旋转蒸发至干, 再用 2 ml 甲醇溶解 ; 用 0.45 μm 有机膜过滤后, 供液相色谱分析 标准溶液系列的配制准确吸取标准储备液 0 ml 0.50 ml 1.00 ml 1.50 ml 2.00 ml 5.00 ml 于 100 ml 容量瓶中, 用甲醇稀释定容至刻度 制成浓度依次为 0 μg/ ml 50 μg/ ml 100 μg/ ml 150 μg/ ml 200 μg/ ml 500 μg/ ml 的标准溶液, 供液相色谱分析 色谱条件色谱柱 :ZORBAX SB-C 18 柱 :5 μm,4.6 mm 250 mm( 或相当型号色谱柱 ) 流动相 : 甲醇 + 水 (55+45) (V/V) ( 溶液用冰乙酸调 ph 3.6) 流速 :0.6 ml /min 柱温 :40 检测波长 :206 nm 测定分别吸取 5.0 μl 标准使用液和试样液注入高效液相色谱仪, 按照 项条件进行检测, 采用标准物质的保留时间辅助峰扫描光谱纯度对照两种方式对样品峰进行定性, 采用外标法以峰面积计算定量 标样及样品中赤霉素图谱分别见图 7 和图 计算按式 (4) 计算 8
12 X C 1000 F = m 1000 DB11/T (4) 式中 : X 样品中赤霉素的含量, 单位为毫克每千克 (mg/kg); C 样品测定液中赤霉素的含量, 单位为微克每毫升 (μg/ ml); F 稀释倍数 ; m 样品量, 单位为克 (g) 计算结果保留两位有效数字 5.6 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 % 5.7 检测限在本试验条件下, 豆芽中赤霉素的定量检测下限为 0.20 mg/kg 图 7 赤霉素标样色谱图 图 8 豆芽样品中赤霉素色谱图 6 福美双残留量的测定 6.1 原理豆芽中残留福美双与盐酸 - 氯化亚锡在密封反应瓶中共热放出二硫化碳, 用气相色谱法 (FPD) 测定, 以保留时间定性, 外标法峰面积定量 6.2 试剂与材料 9
13 6.2.1 盐酸 (AR) mol/l 盐酸溶液 : 量取 42mL 盐酸定容至 100mL 氯化亚锡 (AR) 二硫化碳 (AR) 二氯甲烷 (AR) 盐酸 - 氯化亚锡溶液 : 称取 2 g SnCl2 2H2O 溶于 100 ml 5 mol/l HCl 中 处理水 : 经纯水制备系统制备的去离子水煮沸数分钟, 冷却后待用 福美双标准溶液 : 精密称取福美双 ( 纯度 98.0%)22.4 mg, 以二氯甲烷溶解, 并移入 100 ml 容量瓶中, 稀释至刻度 此溶液浓度为每毫升相当于 224 μg 福美双 6.3 仪器与设备 气相色谱仪 : 带火焰光度检测器 (FPD) 硫滤光片 气密注射器 :100 µl 恒温水浴或烘箱 顶空瓶或具密封塞的 250 ml 玻璃反应瓶 组织捣碎机 Milli-Q 纯水制备系统 6.4 分析步骤 试样制备称取 20 g( 精确到 0.1 g) 经组织捣碎机匀浆处理的豆芽样品放入反应瓶中, 加处理水至 30 ml, 加盐酸 - 氯化亚锡溶液 40 ml, 塞紧反口胶塞, 用反应瓶架固定 将反应瓶置于 80 的烘箱中反应 2 小时, 每隔 0.5 小时摇动 1 分钟 反应完成后取出反应瓶, 冷却至室温 抽取瓶内顶空气体进行定量测定 标准曲线的制备分别准确吸取 1 µl 5 µl 10 µl 50 µl 福美双标准溶液于反应瓶中, 瓶内福美双的量分别为 µg 1.12 µg 2.24 µg 11.2 µg, 按照 的步骤进行反应, 反应后抽取瓶内顶空气体供气相色谱分析 色谱条件气相色谱仪 : 带火焰光度检测器 (FPD) 硫滤光片 色谱柱 :DB-1701 石英毛细管色谱柱,φ30 m 250 μm 0.25 mm 或相似色谱柱 程序升温 : 柱初始温度 50, 保持 1 min, 以 25 /min 速率升温至 150, 保持 2min 进样口温度 :180 检测器温度 :200 载气 : 高纯氮, 纯度 >99.99% 载气流速 : 1.0mL/min 氢气流速 :40 ml/min 空气流速 :450 ml/min 进样 : 进样量 100µL, 不分流 测定分别吸取福美双标准液 试样液瓶中 100µL 气体注入顶空气相色谱仪, 按照 的条件进行检测, 以保留时间定性, 色谱峰面积外标法定量 标样及豆芽样品中福美双图谱见图 9 和图 计算按式 (5) 计算 A 1000 X = (5) m
14 式中 : X 福美双残留量, 单位为毫克每千克 (mg/kg); A 由工作曲线上查出的试样测定液中福美双的含量, 单位为微克 (µg); m 取样量, 单位为克 (g) 6.6 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 % 6.7 检测限本方法最低检出浓度为 0.01 mg/kg FPD1 B, ( \CS D) Norm 图 9 福美双标样色谱图 mi FPD1 B, ( \CS D) Norm 图 10 豆芽样品中福美双色谱图 min 11
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