的含量 GOD C6H12O6+O2 C6H10O6+H2O2 POD H2O2+C6H5OH+C11H13N3O C6H5NO+H2O 2.2 试剂 组合试剂盒 1 号瓶 : 内含 0.2mol/L 磷酸盐缓冲溶液 (ph=7.0)100ml, 其中 4 氨基安替比林为

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1 前言 食品中葡萄糖的测定方法, 一般采用 国际食糖分析方法统一委员会 规定的 兰 挨农法 (Lane and Eynon's Method) 和 姆松 华尔格法 (Munson and Walker's Method), 即菲林氏溶液氧化还原滴定法 此法虽沿用已久, 但测定结果只是近似值 因使用菲林氏溶液滴定葡萄糖 ( 还原糖 ) 时, 其他具有还原能力的单糖会干扰测定结果 本标准采用的酶 比色法和酶 电极法是在检索了近 20 年 107 篇国外文献的基础上, 经过反复实验 验证而制定的 酶 比色法和酶 电极法使用的葡萄糖氧化酶 (GOD) 具有专一性, 只能催化葡萄糖水溶液中的 β D 葡萄糖起反应 ( 被氧化 ), 因此测定结果是真实值 本标准的酶 比色法为仲裁法 ; 酶 电极法为快速法 本标准的附录 A 附录 B 都是标准的附录 本标准由全国食品工业标准化技术委员会提出并归口 本标准起草单位 : 中国农垦北方食品监测中心 ( 酶 比色法 ); 山东省科学院生物研究所 ( 酶 电极法 ) 本标准经全国食品工业标准化技术委员会秘书处审校 本标准主要起草人 : 张宗城, 刘宁, 冯德荣, 孙士青, 宋家华, 郝煜 目 次 前言 1 范围 x 2 酶 比色法 x 3 酶 电极法 x 附录 A( 标准的附录 ) x 附录 B( 标准的附录 ) x 中华人民共和国国家标准 食品中葡萄糖的测定方法 GB/T 酶 - 比色法酶 - 电极法 Method for determination of glucose in food Enzyme-Colorimetric method Enzyme-Electrode method 1 范围本标准规定了用酶 比色法和酶 电极法测定食品中葡萄糖的方法, 适用于各类食品中葡萄糖的测定 ; 亦适用于食品中其他组分转化为葡萄糖的测定 本标准酶 比色法的最低检出限量为 0.01μg( 葡萄糖 )/ml( 试液 ); 酶 电极法的最低检出限量为 1.0mg/100mL 2 酶 比色法 2.1 原理葡萄糖氧化酶 (GOD) 在有氧条件下, 催化 β D 葡萄糖 ( 葡萄糖水溶液状态 ) 氧化, 生成 D 葡萄糖酸 δ 内酯和过氧化氢 受过氧化物酶 (POD) 催化, 过氧化氢与 4 氨基安替比林和苯酚生成红色醌亚胺 在波长 505nm 处测定醌亚胺的吸光度, 计算食品中葡萄糖

2 的含量 GOD C6H12O6+O2 C6H10O6+H2O2 POD H2O2+C6H5OH+C11H13N3O C6H5NO+H2O 2.2 试剂 组合试剂盒 1 号瓶 : 内含 0.2mol/L 磷酸盐缓冲溶液 (ph=7.0)100ml, 其中 4 氨基安替比林为 mol/L; 2 号瓶 : 内含 0.022mol/L 苯酚溶液 100mL; 3 号瓶 : 内含葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase)400u( 活力单位 ) 过氧化物酶( 辣根, peroxidase)1000u( 活力单位 ) 号瓶须在 4 左右保存 酶试剂溶液 : 将 1 号瓶和 2 号瓶的物质充分混合均匀, 再将 3 号瓶的物质溶解其中, 轻轻摇动 ( 勿剧烈摇动 ), 使葡萄糖氧化酶和过氧化物酶完全溶解 此溶液须在 4 左右保存, 有效期 1 个月 mol/L 亚铁氰化钾溶液 : 称取 3.7g 亚铁氰化钾 [K4Fe(CN)6 3H2O,GB1273, 分析纯 ] 溶于 100mL 重蒸馏水中, 摇匀 mol/L 硫酸锌溶液 : 称取 7.7g 硫酸锌 ( ZnSO4 7H2O,GB666, 分析纯 ), 溶于 100mL 重蒸馏水中, 摇匀 mol/L 氢氧化钠溶液 : 称取 4g 氢氧化钠 (GB629, 分析纯 ), 溶于 1000mL 重蒸馏水中, 摇匀 葡萄糖标准溶液 : 称取经 100±2 烘烤 2h 的葡萄糖 (HG , 分析纯 ) g, 溶于重蒸馏水中, 定容至 100mL, 摇匀 将此溶液用重蒸馏水稀释 V2.00 V100, 即为 200μg/ ml 葡萄糖标准溶液 2.3 仪器和设备实验室常规仪器及下列各项 : 研钵或粉碎机 分析筛 组织捣碎机 恒温水浴锅 可见光分光光度计 微量移液管 :1.00mL, 精度 0.01mL 2.4 试样的制备 固体样品粉末状样品 : 取有代表性的样品至少 200g, 充分混匀, 置于密闭的玻璃容器内 颗粒状样品 : 取有代表性的样品至少 200g, 用粉碎机粉碎, 或用研钵研细, 通过 100 目分析筛, 置于密闭的玻璃容器内 新鲜水果 蔬菜等固体样品 : 取有代表性的可食部分至少 200g, 用组织捣碎机捣碎, 置于密闭的玻璃容器内 糊状样品取有代表性的样品至少 200g, 充分混匀, 置于密闭的玻璃容器内

3 2.4.3 固液体样品取有代表性的样品至少 200g, 用组织捣碎机捣碎, 置于密闭的玻璃容器内 液体样品取有代表性的样品至少 200mL, 充分混匀, 置于密闭的玻璃容器内 如样品中含二氧化碳, 须用三角瓶取 200mL, 旋摇至基本无气泡, 安装冷凝管, 置沸水浴中加热 10min, 取出冷却至室温 2.5 试液的制备 不含蛋白质的试样 : 用 100mL 烧杯称取试样 (2.4)1~10g( 精确至 g), 加少量重蒸馏水, 转移到 250mL 容量瓶中, 稀释至刻度 摇匀后用快速滤纸过滤 弃去最初滤液 30mL, 即为试液 试液中萄萄糖含量大于 300μg/mL 时, 应适当增加定容体积 含蛋白质的试样 : 用 100mL 烧杯称取试样 (2.4)1~10g( 精确至 g), 加少量重蒸馏水, 转移到 250mL 容量瓶中, 加入 0.085mol/L 亚铁氰化钾溶液 (2.2.3)5mL 0.25mol /L 硫酸锌溶液 (2.2.4)5mL 和 0.1mol/L 氢氧化钠溶液 (2.2.5)10mL, 用重蒸馏水定容至刻度 摇匀后用快速滤纸过滤 弃去最初滤液 30mL, 即为试液 试液中葡萄糖含量大于 300μg/mL 时, 应适当增加定容体积 2.6 分析步骤 标准曲线的绘制用微量移液管取 mL 葡萄糖标准溶液 (2.2. 6), 分别置于 10mL 比色管中, 各加入 3mL 酶试剂溶液 (2.2.2), 摇匀, 在 36±1 水浴锅中恒温 40min 冷却至室温, 用重蒸馏水定容至 10mL, 摇匀 用 1cm 比色皿, 以葡萄糖标准溶液含量为 0.00 的试剂溶液调整分光光度计的零点, 在波长 505nm 处, 测定各比色管中溶液的吸光度 以葡萄糖含量为纵坐标, 吸光度为横坐标, 绘制标准曲线 试液吸光度的测定用微量移液管取 0.50~5.00mL 试液 (2.5)( 依试液中葡萄糖的含量而定 ), 置于 10mL 比色管中 以下按 步骤操作 ; 但须用等量试液 (2.5) 调整分光光度计的零点 测出试液吸光度后, 在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量 2.7 分析结果的表述样品中葡萄糖的含量以质量百分率表示, 按式 (1) 计算 : C 1 X1 = 100 V m V1 C = (1) V2

4 m V1 式中 :X1 样品中葡萄糖的含量, 质量百分率,%; C 标准曲线上查出的试液中葡萄糖含量,μg; m 试样的质量,g; V1 试液的定容体积,mL; V2 测定时吸取试液的体积,mL 计算结果精确至小数点后第二位 2.8 允许差同一样品的两次测定值之差, 不得超过两次测定平均值的 5.0% 3 酶 电极法 3.1 原理葡萄糖氧化酶 (GOD) 在有氧条件下催化 β D 葡萄糖 ( 葡萄糖水溶液状态 ) 氧化, 生成 D 葡萄糖酸 δ 内酯和过氧化氢 过氧化氢与过氧化氢型电极接触产生电流 该电流值与 β D 葡萄糖的浓度呈线性比例, 在酶电极葡萄糖分析仪上直接显示葡萄糖含量 GOD C6H12O6 + O2 C6H10O6 + H2O2 3.2 试剂 组合试剂盒 a 葡萄糖氧化酶酶膜圈 : 含葡萄糖氧化酶 (GOD)15U( 活力单位 ); 须在 0~4 左右保存, 有效期 12 个月 b 复合试剂 : 含磷酸二氢钾 磷酸氢二钠 乙二胺四乙酸二钠 氯化钠 苯甲酸钠 庆大霉素硫酸盐 ; 常温保存, 有效期 24 个月 c β D 葡萄糖标准溶液 : 浓度 100.0mg/100mL; 密封保存, 有效期 12 个月 缓冲溶液将一袋复合试剂 (3.2.1b) 溶解在 1000mL 蒸馏水中, 摇匀 ph=7.2± 仪器和设备实验室常规仪器及下列各项 : 研钵或粉碎机 分析筛 组织捣碎机 酶电极葡萄糖分析仪 : 直接读数式 ; 测量范围 0~100.0mg/100mL (β D 葡萄糖 ); 测量精度 ±1.0mg/100mL(β D 葡萄糖 ) 微量进样器 : 容量 50μL, 精度 1μL 3.4 试样的制备 固体样品粉末状样品 : 取有代表性的样品至少 200g, 充分混匀, 置于密闭的玻璃容器内 颗粒状样品 : 取有代表性的样品至少 200g, 用粉碎机粉碎, 或用研钵研细, 通过 100 目分析筛, 置于密闭的玻璃容器内 新鲜水果 蔬菜等固体样品 : 取有代表性的可食部分至少 200g, 置于密闭的玻璃容器内 糊状样品取有代表性的样品至少 200g, 充分混匀, 置于密闭的玻璃容器内 固液体样品

5 取有代表性的样品至少 200g, 用组织捣碎机捣碎, 置于密闭的玻璃容器内 液体样品取有代表性的样品至少 200mL, 充分混匀, 置于密闭的玻璃容器内 如样品中含有二氧化碳, 须用三角瓶取 200mL, 摇至基本无气泡, 安装冷凝管, 置沸水浴中加热 10min, 取出冷却至室温 3.5 试液的制备 固体试样和固液体试样一般固体试样和固液体试样 : 称取试样 (3.4) 1~10g( 使之定容后葡萄糖含量为 1~200 mg/ml) 于 100mL 烧杯内, 精确至 g, 用蒸馏水移入 100mL 容量瓶中, 稀释至刻度, 摇匀, 放置 30min( 摇动 2~3 次 ) 用快速滤纸或脱脂棉过滤 弃去最初滤液, 收集 1~2mL 滤液于带盖小试管中 水果 蔬菜试样 : 称取试样 (3.4) 1~10g 于 100mL 烧杯内 ( 使之定容后葡萄糖含量为 1~ 200mg/mL), 精确至 g 加入煮沸的蒸馏水 30~50mL 和 5mL 缓冲溶液 (3.2.2), 继续煮沸 3~5min, 冷却至室温后用研钵研细或用组织捣碎机捣碎 用蒸馏水移入 100mL 容量瓶中, 稀释至刻度, 摇匀 用快速滤纸或脱脂棉过滤 弃去最初滤液, 收集 1~2mL 滤液于带盖小试管中 食用葡萄糖试样 : 称取试样 (3.4) 1~10g 于 100mL 烧杯内, 精确至 g 加入约 50mL 蒸馏水, 溶解后煮沸 2min 冷却后用蒸馏水移入 1000mL 容量瓶中, 稀释至刻度, 摇匀 糊状和液体试样称取试样 (3.4) 1~10g( 使定容后葡萄糖含量为 1~200mg/mL) 于 100mL 烧杯内, 精确至 g 用蒸馏水移入 100mL 容量瓶中, 稀释至刻度, 摇匀 用快速滤纸或脱脂棉过滤 ( 如溶液呈透明状, 可免除过滤 ) 弃去最初滤液, 收集 1~2mL 滤液于带盖小试管中 3.6 分析步骤 校正仪器从组合试剂盒中取出电极, 将其表面清理干净, 吸取缓冲溶液 (3.2.2) 滴在电极表面 用小镊子取一片酶膜圈, 安装在电极表面, 使酶膜圈中心和电极中心的白金完全贴紧, 形成无气泡的薄层液体, 然后将电极安装在反应池内 仪器开机后, 缓冲溶液即自动进入反应池, 并自行冲洗 当仪器出现进样指令后, 用微量进样器准确吸取 25μL 标准溶液 (3.2.1C), 用滤纸擦净针尖外部, 将标准溶液注入进样口内 20~40s 后仪器自动显示标准溶液的指示值 再等 30~60s, 仪器自行完成冲洗过程, 即可重复注入标准溶液 (3.2.1C) 数次, 直至仪器显示允许开始测定样品 当连续两次标准溶液显示值的相对误差小于 2.0% 时, 即完成校正步骤 测定样品用试液 (3.5) 冲洗微量进样器, 至少两次 准确吸取 25μL 试液 (3.5), 用滤纸擦干针尖外部, 注入进样口 20~40s 后读取显示值 3.7 分析结果的表述样品中葡萄糖的含量以质量百分率表示, 按式 (2) 计算 : R V 3

6 1000 m 1 R V 3 X2 = 100 = (2) m 1 式中 :X2 样品中葡萄糖的含量, 质量百分率,%; R 仪器测定值,mg/100mL; V3 试液的定容体积,mL; m1 试样的质量,g 计算结果精确至小数点后第 1 位 3.8 允许差同一样品的两次测定值之差 : 样品中葡萄糖含量小于 1.0% 时, 不得超过两次测定平均值的 5.0%; 样品中葡萄糖含量大于或等于 1.0% 时, 不得超过两次测定平均值的 2.0% 附录 A ( 标准的附录 ) 葡萄糖氧化酶 过氧化物酶的技术要求 试验方法及判定规则 A1 技术要求 A1.1 酶活力葡萄糖氧化酶活力 (U/mg) 20; 过氧化物酶活力 (U/mg) 50 A1.2 干扰酶葡萄糖氧化酶 过氧化物酶中都不得含有纤维素酶 淀粉葡萄糖苷酶 β 果糖苷酶 半乳糖苷酶和过氧化氢酶 A2 试验方法用移液管吸取 0.50mL 葡萄糖标准溶液 (2.2.6), 置于 10mL 比色管中, 加入 100μg 可溶性淀粉 (HGB3095, 分析纯 ) 100μg 纤维二糖 ( 生化试剂 ) 100μg 乳糖 (HG , 分析纯 ) 和 100μg 蔗糖 (HG3 1001, 分析纯 ), 再加入 3mL 酶试剂溶液 (2.2.2) 以下按 步骤操作 测定吸光度后, 在标准曲线 ( 按 2.6.1) 上查出对应的葡萄糖含量, 按下式计算葡萄糖的回收率 : C F = 式中 : F 葡萄糖的回收率,%; C 葡萄糖的实测值,μg A3 判定规则测得葡萄糖的回收率, 如在 95% ~ 105% 范围内, 则判定葡萄糖氧化酶和过氧化物酶符合要求 附录 B ( 标准的附录 )

7 葡萄糖氧化酶酶膜圈性能判定方法 B1 酶膜活性的判定校正仪器时, 注入 25μL 标准溶液 (3.2.1C), 仪器显示标准溶液的指示值后, 按下酶膜响应键, 则显示出酶膜活性相对值 如相对值大于 10.0, 则表示酶膜活性符合要求 ; 相对值小于 10.0 时, 应更换新酶膜 B2 酶膜线性的判定校正仪器操作步骤完成后, 仪器显示酶膜线性检查指令 用微量进样器注入 50μL 标准溶液 (3.2.1C), 如显示值大于 184.0, 表示酶膜线性良好 ; 小于 时, 应按下仪器线性校正键, 进行线性校正, 或更换新酶膜 B3 酶膜抗干扰性的判定校正仪器操作步骤完成后, 用微量进样器吸取 25μL 新配制的 1% 亚铁氰化钾溶液, 注入反应池进样口 当仪器显示值为 -2.0~+6.0 时, 表示酶膜抗干扰符合要求 ; 否则应更换新酶膜 1% 亚铁氰化钾溶液的配制 : 用 100mL 烧杯准确称取 1.15g 亚铁氰化钾 [K4Fe(CN)6 3H2O, GB1273, 分析纯 ], 加入少量蒸馏水使之溶解, 转移至 100mL 容量瓶中, 稀释至刻度, 摇匀 国家技术监督局 批准 实施

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