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1 中华人民共和国国家标准 GB 食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定发布实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布

2 前言本标准代替 GB/T 食品中环己基氨基磺酸钠的测定本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 标准名称修改为食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定 ; 气相色谱法改为使用毛细管柱进行分析 ; 优化了样品处理衍生化和测定的条件 ; 增加液相色谱法 ; 增加液相色谱 - 质谱 / 质谱法 ; 删除 GB/T 食品中环己基氨基磺酸钠的测定中的第二法比色法和第三法薄层色谱法 Ⅰ

3 食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定 1 范围本标准规定了食品中环己基氨基磺酸钠 ( 甜蜜素 ) 的三种测定方法气相色谱法液相色谱法和液相色谱 - 质谱 / 质谱法本标准气相色谱法适用于饮料类蜜饯凉果果丹类话化类带壳及脱壳熟制坚果与籽类水果罐头果酱糕点面包饼干冷冻饮品果冻复合调味料腌渍的蔬菜腐乳食品中环己基氨基磺酸钠的测定本标准气相色谱法不适用于白酒中该化合物的测定本标准液相色谱法适用于饮料类蜜饯凉果果丹类话化类带壳及脱壳熟制坚果与籽类配制酒水果罐头果酱糕点面包饼干冷冻饮品果冻复合调味料腌渍的蔬菜腐乳食品中环己基氨基磺酸钠的测定本标准液相色谱 - 质谱 / 质谱法适用于白酒葡萄酒黄酒料酒中环己基氨基磺酸钠的测定第一法气相色谱法 2 原理食品中的环己基氨基磺酸钠用水提取, 在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应, 生成环己醇亚硝酸酯, 利用气相色谱氢火焰离子化检测器进行分离及分析, 保留时间定性, 外标法定量 3 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB/T6682 规定的二级水 3.1 试剂正庚烷 [CH3(CH2) 5CH3] 氯化钠 (NaCl) 石油醚 : 沸程为 30 ~ 氢氧化钠 (NaOH) 硫酸 (H2SO4) 亚铁氰化钾 {K4[Fe(CN) 6 ] 3H2O} 硫酸锌 (ZnSO4 7H2O) 亚硝酸钠 (NaNO2) 3.2 试剂配制氢氧化钠溶液 (40g/L): 称取 20g 氢氧化钠, 溶于水并稀释至 500mL, 混匀 1

4 3.2.2 硫酸溶液 (200g/L): 量取 54mL 硫酸小心缓缓加入 400mL 水中, 后加水至 500mL, 混匀亚铁氰化钾溶液 (150g/L): 称取折合 15g 亚铁氰化钾 (3.1.6), 溶于水稀释至 100mL, 混匀硫酸锌溶液 (300g/L): 称取折合 30g 硫酸锌的试剂 (3.1.7), 溶于水并稀释至 100mL, 混匀亚硝酸钠溶液 (50g/L): 称取 25g 亚硝酸钠, 溶于水并稀释至 500mL, 混匀 3.3 标准品环己基氨基磺酸钠标准品 (C6H12NSO3Na): 纯度 99% 3.4 标准溶液的配制环己基氨基磺酸标准储备液 (5.00mg/mL): 精确称取 g 环己基氨基磺酸钠标准品, 用水溶解并定容至 100mL, 混匀, 此溶液 1.00mL 相当于环己基氨基磺酸 5.00mg( 环己基氨基磺酸钠与环己基氨基磺酸的换算系数为 ) 置于 1 ~4 冰箱保存, 可保存 12 个月环己基氨基磺酸标准使用液 (1.00 mg/ml): 准确移取 20.0 ml 环己基氨基磺酸标准储备液用水稀释并定容至 100mL, 混匀置于 1 ~4 冰箱保存, 可保存 6 个月 4 仪器与设备 4.1 气相色谱仪 : 配有氢火焰离子化检测器 (FID) 4.2 涡旋混合器 4.3 离心机 : 转速 4000r/min 4.4 超声波振荡器 4.5 样品粉碎机 μL 微量注射器 4.7 恒温水浴锅 4.8 天平 : 感量 1mg 0.1mg 5 分析步骤 5.1 试样溶液的制备液体试样处理普通液体试样摇匀后称取 25.0g 试样 ( 如需要可过滤 ), 用水定容至 50mL 备用含二氧化碳的试样 : 称取 25.0g 试样于烧杯中,60 水浴加热 30min 以除二氧化碳, 放冷, 用水定容至 50mL 备用含酒精的试样 : 称取 25.0g 试样于烧杯中, 用氢氧化钠溶液 (3.2.1) 调至弱碱性 ph7~8,60 水浴加热 30min 以除酒精, 放冷, 用水定容至 50mL 备用固体半固体试样处理低脂低蛋白样品 ( 果酱果冻水果罐头果丹类蜜饯凉果浓缩果汁面包糕点饼干复合调味料带壳熟制坚果和籽类腌渍的蔬菜等 ): 称取打碎混匀的样品 3.00g~5.00g 于 50 ml 离心管中, 加 30mL 水, 振摇, 超声提取 20min, 混匀, 离心 (3000r/min)10min, 过滤, 用水分次洗涤残渣, 收集滤液并定容至 50mL, 混匀备用高蛋白样品 ( 酸乳雪糕冰淇淋等奶制品及豆制品腐乳等 ): 冰棒雪糕冰淇淋等分别放置于 2

5 250mL 烧杯中, 待融化后搅匀称取 ; 称取样品 3.00g~5.00g 于 50mL 离心管中, 加 30mL 水, 超声提取 20min, 加 2mL 亚铁氰化钾溶液, 混匀, 再加入 2mL 硫酸锌溶液, 混匀, 离心 (3000r/min)10min, 过滤, 用水分次洗涤残渣, 收集滤液并定容至 50mL, 混匀备用高脂样品 ( 奶油制品海鱼罐头熟肉制品等 ): 称取打碎混匀的样品 3.00g~5.00g 于 50 ml 离心管中, 加入 25mL 石油醚, 振摇, 超声提取 3 min, 再混匀, 离心 (1000r/min 以上 )10 min, 弃石油醚, 再用 25mL 石油醚提取一次, 弃石油醚,60 水浴挥发去除石油醚, 残渣加 30mL 水, 混匀, 超声提取 20min, 加 2mL 亚铁氰化钾溶液, 混匀, 再加入 2mL 硫酸锌溶液, 混匀, 离心 (3000r/min)10min, 过滤, 用水洗涤残渣, 收集滤液并定容至 50mL, 混匀备用衍生化准确移取液体试样溶液 (5.1.1) 固体半固体试样溶液 (5.1.2)10.0 ml 于 50 ml 带盖离心管中离心管置试管架上冰浴中 5min 后, 准确加入 5.00mL 正庚烷, 加入 2.5 ml 亚硝酸钠溶液,2.5 ml 硫酸溶液, 盖紧离心管盖, 摇匀, 在冰浴中放置 30 min, 其间振摇 3 次 ~5 次 ; 加入 2.5g 氯化钠, 盖上盖后置旋涡混合器上振动 1 min( 或振摇 60 次 ~80 次 ), 低温离心 (3000r/min)10 min 分层或低温静置 20min 至澄清分层后取上清液放置 1 ~4 冰箱冷藏保存以备进样用 5.2 标准溶液系列的制备及衍生化准确移取 1.00mg/mL 环己基氨基磺酸标准溶液 0.50mL 1.00 ml 2.50 ml 5.00 ml 10.0mL 25.0mL 于 50mL 容量瓶中, 加水定容配成标准溶液系列浓度为 :0.01mg/mL 0.02mg/mL 0.05mg/mL 0.10mg/mL 0.20mg/mL 0.50mg/mL 临用时配制以备衍生化用准确移取标准系列溶液 10.0mL 同 (5.1.3) 衍生化 5.3 测定色谱条件色谱柱 : 弱极性石英毛细管柱 ( 内涂 5% 苯基甲基聚硅氧烷,30 m 0.53 mm 1.0μm) 或等效柱柱温升温程序 : 初温 55 保持 3min,10 /min 升温至 90 保持 0.5min,20 /min 升温至 200 保持 3min 进样口 : 温度 230 ; 进样量 1μL, 不分流 / 分流进样, 分流比 1 5( 分流比及方式可根据色谱仪器条件调整 ) 检测器 : 氢火焰离子化检测器 (FID), 温度载气 : 高纯氮气, 流量 12.0mL/min, 尾吹 20mL/min 氢气 :30mL/min; 空气 330mL/min( 载气氢气空气流量大小可根据仪器条件进行调整 ) 色谱分析分别吸取 1μL 经衍生化处理的标准系列各浓度溶液上清液 (5.2), 注入气相色谱仪中, 可测得不同浓度被测物的响应值峰面积, 以浓度为横坐标, 以环己醇亚硝酸酯和环己醇两峰面积之和为纵坐标, 绘制标准曲线在完全相同的条件下进样 1μL 经衍生化处理的试样待测液上清液 (5.1.3), 保留时间定性, 测得峰面积, 根据标准曲线得到样液中的组分浓度 ; 试样上清液响应值若超出线性范围, 应用正庚烷稀释后再进样分析平行测定次数不少于两次 3

6 6 分析结果的表述试样中环己基氨基磺酸含量按式 (1) 计算 : X1 = c m V (1 ) 式中 : X1 试样中环己基氨基磺酸的含量, 单位为克每千克 (g/kg); c 由标准曲线计算出定容样液中环己基氨基磺酸的浓度, 单位为毫克每毫升 (mg/ml); m 试样质量, 单位为克 (g); V 试样的最后定容体积, 单位为毫升 (ml) 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字 7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 8 其他取样量 5g 时, 本方法检出限为 0.010g/kg, 定量限 0.030g/kg 第二法高效液相色谱法 9 原理食品中的环己基氨基磺酸钠用水提取后, 在强酸性溶液中与次氯酸钠反应, 生成 N,N- 二氯环己胺, 用正庚烷萃取后, 利用高效液相色谱法检测, 保留时间定性, 外标法定量 10 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB/T6682 规定的一级水 10.1 试剂正庚烷 [CH3(CH2) 5CH3]: 色谱纯乙腈 (CH3CN): 色谱纯硫酸 (H2SO4) 次氯酸钠 (NaClO) 碳酸氢钠 (NaHCO3) 硫酸锌 (ZnSO4 7H2O) 亚铁氰化钾 {K4[Fe(CN) 6 ] 3H2O} 石油醚 : 沸程为 30 ~ 试剂配制硫酸溶液 (1+1):50mL 硫酸小心缓缓加入 50mL 水中, 混匀 4

7 次氯酸钠溶液 : 用次氯酸钠 (10.1.4) 稀释, 保存于棕色瓶中, 保持有效氯含量 50g/L 以上, 混匀, 市售产品需及时标定, 临用时配制碳酸氢钠溶液 (50g/L): 称取 5g 碳酸氢钠, 用水溶解并稀释至 100mL, 混匀硫酸锌溶液 (300g/L): 称取折合 30g 硫酸锌 (10.1.6), 溶于水并稀释至 100mL, 混匀亚铁氰化钾溶液 (150g/L): 称取折合 15g 亚铁氰化钾 (10.1.7), 溶于水并稀释至 100 ml, 混匀 10.3 标准品环己基氨基磺酸钠标准品 (C6H12NSO3Na): 纯度 99% 10.4 标准溶液配制环己基氨基磺酸标准储备液 (5.00mg/mL): 按第一法配制环己基氨基磺酸标准中间液 (1.00mg/mL): 按第一法配制环己基氨基磺酸标准曲线系列工作液 : 分别吸取标准中间液 (10.4.2)0.50mL 1.0mL 2.5mL 5.0mL 10.0mL 至 50mL 容量瓶中, 用水定容该标准系列浓度分别为 10.0μg/mL 20.0μg/mL 50.0μg/mL 100μg/mL 200μg/mL 临用现配 11 仪器和设备 11.1 液相色谱仪, 配有紫外检测器或二极管阵列检测器 11.2 超声波振荡器 11.3 离心机 : 转速 4000r/min 11.4 样品粉碎机 11.5 恒温水浴锅 11.6 天平 : 感量 1mg 0.1mg 12 分析步骤 12.1 试样溶液的制备固体类和半固体类试样处理称取均质后试样 5.00g 于 50mL 离心管中, 加入 30mL 水, 混匀, 超声提取 20min, 离心 (3000r/min) 20min, 将上清液转出, 用水洗涤残渣并定容至 50 ml 备用含高蛋白类样品可在超声提取时加入 2.0mL 硫酸锌溶液 (10.2.4) 和 2.0mL 亚铁氰化钾溶液 (10.2.5) 含高脂质类样品可在提取前先加入 25mL 石油醚 (10.1.8) 振摇后弃去石油醚层除脂液体类试样处理普通液体试样摇匀后可直接称取样品 25.0g, 用水定容至 50mL 备用 ( 如需要可过滤 ) 含二氧化碳的试样 : 称取 25.0g 试样于烧杯中,60 水浴加热 30 min 以除二氧化碳, 放冷, 用水定容至 50mL 备用含酒精的试样 : 称取 25.0g 试样于烧杯中, 用氢氧化钠溶液调至弱碱性 ph7~8,60 水浴加热 30min 以除酒精, 放冷, 用水定容至 50mL 备用含乳类饮料称取试样 25.0g 于 50mL 离心管中, 加入 3.0mL 硫酸锌溶液 (10.2.4) 和 3.0 ml 5

8 亚铁氰化钾溶液 (10.2.5), 混匀, 离心分层后, 将上清液转出, 用水洗涤残渣并定容至 50mL 备用衍生化准确移取 10mL 已制备好的试样溶液 ( 或 ), 加入 2.0 ml 硫酸溶液 (10.2.1),5.0 ml 正庚烷 (10.1.1), 和 1.0mL 次氯酸钠溶液 (10.2.2), 剧烈振荡 1 min, 静置分层, 除去水层后在正庚烷层中加入 25mL 碳酸氢钠溶液 (10.2.3), 振荡 1 min 静置取上层有机相经 0.45μm 微孔有机相滤膜过滤, 滤液备进样用 12.2 仪器参考条件色谱柱 :C18 柱,5μm,150mm 3.9mm(i,d), 或同等性能的色谱柱流动相 : 乙腈 + 水 (70+30) 流速 :0.8mL/min 进样量 :10μL 柱温 : 检测器 : 紫外检测器或二极管阵列检测器检测波长 :314nm 12.3 标准曲线的制作移取 10mL 环己基氨基磺酸标准系列工作液 (10.4.3) 按衍生化取过 0.45μm 微孔有机相滤膜后的溶液 10μL 分别注入液相色谱仪中, 测定相应的峰面积, 以标准工作溶液的浓度为横坐标, 以环己基氨基磺酸钠衍生化产物 N,N- 二氯环己胺峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线 12.4 样品的测定将衍生后试样溶液 (12.1.3)10μL 注入液相色谱仪中, 保留时间定性, 测得峰面积, 根据标准曲线得到试样定容溶液中环己基氨基磺酸的浓度, 平行测定次数不少于两次 13 分析结果的表述试样中环己基氨基磺酸含量按式 (2) 计算 : 式中 : X2 c V m X2 = c V m 1000 (2 ) 试样中环己基氨基磺酸的含量, 单位为克每千克 (g/kg); 由标准曲线计算出试样定容溶液中环己基氨基磺酸的浓度, 单位为微克每毫升 ( μ g/ml); 试样的最后定容体积, 单位为毫升 (ml); 试样的质量, 单位为克 (g); 1000 由 μg/g 换算成 g/kg 的换算因子计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字 14 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 6

9 15 其他取样量 5g 时, 本方法检出限为 0.010g/kg, 定量限 0.030g/kg 第三法液相色谱 - 质谱 / 质谱法 16 原理酒样经水浴加热除去乙醇后以水定容, 用液相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定其中的环己基氨基磺酸钠, 外标法定量 17 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB/T6682 规定的一级水 17.1 试剂甲醇 (CH3OH): 色谱纯乙酸铵 (CH3COONH4) mmol/L 乙酸铵溶液 : 称取 0.78g 乙酸铵, 用水溶解并稀释至 1000 ml, 摇匀后经 0.22μm 水相滤膜过滤备用 17.2 标准品环己基氨基磺酸钠标准品 (C6H12NSO3Na): 纯度 99% 17.3 标准溶液配制环己基氨基磺酸标准储备液 (5.00mg/mL): 按第一法配制环己基氨基磺酸标准中间液 (1.00mg/mL): 按第一法配制环己基氨基磺酸标准工作液 (10μg/mL): 用水将 1.00mL 标准中间液 (17.3.2) 定容至 100mL 放置于 1 ~4 冰箱可保存一周环己基氨基磺酸标准曲线系列工作液 : 分别吸取适量体积的标准工作液 (17.3.3), 用水稀释, 配成浓度分别为 0.01μg/mL 0.05μg/mL 0.1μg/mL 0.5μg/mL 1.0μg/mL 2.0μg/mL 的系列标准工作溶液使用前配置 17.4 微孔滤膜 :0.22μm, 水相 18 仪器和设备 18.1 液相色谱 - 质谱 / 质谱仪, 配有电喷雾 (ESI) 离子源 18.2 分析天平, 感量 0.1mg 0.1g 18.3 恒温水浴锅 19 分析步骤 19.1 试样溶液制备称取酒样 10.0g, 置于 50mL 烧杯中, 于 60 水浴上加热 30min, 残渣全部转移至 100mL 容量瓶 7

10 中, 用水定容并摇匀, 经 0.22μm 水相微孔滤膜过滤后备用 19.2 仪器参考条件色谱柱 :C18 柱,1.7μm,100mm 2.1mm(i,d), 或同等性能的色谱柱流动相 : 甲醇 10mmol/L 乙酸铵溶液梯度洗脱 : 参见附录 A 中的表 A 流速 :0.25mL/min 进样量 :10μL 柱温 : 质谱操作条件离子源 : 电喷雾电离源 (ESI) 扫描方式 : 多反应监测 (MRM) 扫描质谱调谐参数应优化至最佳条件, 确保环己基氨基磺酸钠在正离子模式下的灵敏度达到最佳状态, 并调节正负模式下定性离子的相对丰度接近质谱调谐参数和定性定量离子参见附录 A 19.3 标准曲线的制作将配制好的标准系列溶液 (17.3.4) 按照浓度由低到高的顺序进样测定, 以环己基氨基磺酸钠定量离子的色谱峰面积对相应的浓度作图, 得到标准曲线回归方程典型的环己基氨基磺酸钠标准溶液选择反应监测质量色谱图参见附录 B 19.4 定性测定在相同的试验条件下测定试样溶液 (19.1), 若试样溶液质量色谱图中环己基氨基磺酸钠的保留时间与标准溶液一致 ( 变化范围在 ±2.5% 以内 ), 且试样定性离子的相对丰度与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度, 其偏差不超过表 1 的规定, 则可判定样品中存在环己基氨基磺酸钠表 1 定性离子相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度 /% >50 >20~50 >10~20 10 允许的相对偏差 /% ±20 ±25 ±30 ± 定量测定将试样溶液注入液相色谱 - 质谱 / 质谱仪中, 得到环己基氨基磺酸钠定量离子峰面积, 根据标准曲线计算试样溶液中环己基氨基磺酸的浓度, 平行测定次数不少于两次 20 分析结果的表述试样中环己基氨基磺酸含量按式 (3) 计算 : 式中 : X3 = c V m X3 试样中环己基氨基磺酸的含量, 单位为毫克每千克 (mg/kg); (3 ) c 由标准曲线计算出的试样溶液中环己基氨基磺酸的浓度, 单位为微克每毫升 ( μ g/ml); 8

11 V 试样的定容体积, 单位为毫升 (ml); m 试样的质量, 单位为克 (g) 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字 21 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 22 其他本方法检出限为 0.03mg/kg, 定量限为 0.1mg/kg 9

12 附录 A 液相色谱 - 质谱 / 质谱参考条件 A.1 液相色谱梯度洗脱条件见表 A.1 表 A.1 液相色谱梯度洗脱条件序号时间 /min 甲醇 /% 10mmol/L 乙酸铵溶液 /% A.2 负离子模式的质谱参考条件 : a) 毛细管电压 :2.8kV; b) 离子源温度 :110 ; c) 脱溶剂气温度 :450 ; d) 脱溶剂气 (N2) 流量 :700L/h; e) 锥孔气 (N2) 流量 :50L/h; f) 分辨率 :Q1( 单位质量分辨 )Q3( 单位质量分辨 ); g) 碰撞气及碰撞室压力 : 氩气, mpa; h) 扫描方式 : 多反应监测 (MRM); i) 环己基氨基磺酸钠参考保留时间定性定量离子对及锥孔电压碰撞能量见表 A.2 A.3 正离子模式的质谱参考条件 : a) 毛细管电压 :3.5kV; b) 离子源温度 :110 ; c) 脱溶剂气温度 :450 ; d) 脱溶剂气 (N2) 流量 :700L/h; e) 锥孔气 (N2) 流量 :50L/h; f) 分辨率 :Q1( 单位质量分辨 )Q3( 单位质量分辨 ); g) 碰撞气及碰撞室压力 : 氩气, mpa; h) 扫描方式 : 多反应监测 (MRM); i) 环己基氨基磺酸钠参考保留时间定性定量离子对及锥孔电压碰撞能量见表 A.2 10

13 表 A.2 环己基氨基磺酸钠参考保留时间定性定量离子对及锥孔电压碰撞能量名称保留时间 min 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 ev 驻留时间 ms 环己基氨基磺酸钠 >79.9(ESI - ) 202>122(ESI + ) 178>79.9(ESI - )

14 附录 B 环己基氨基磺酸钠标准溶液色谱图 B.1 环己基氨基磺酸钠标准溶液衍生后的气相色谱图环己基氨基磺酸钠标准溶液衍生后的气相色谱图见图 B.1 图 B.1 环己基氨基磺酸钠标准溶液 (0.5mg/mL) 衍生化处理后的气相色谱图 B.2 环己基氨基磺酸钠标准溶液衍生产物 N,N- 二氯环己胺液相色谱图环己基氨基磺酸钠标准溶液衍生产物 N,N- 二氯环己胺液相色谱图见图 B.2 图 B.2 环己基氨基磺酸钠标准溶液 (100μg/mL) 衍生物 N,N- 二氯环己胺液相色谱图 12

15 B.3 环己基氨基磺酸钠标准溶液的液相色谱 - 质谱 / 质谱图环己基氨基磺酸钠标准溶液的液相色谱 - 质谱 / 质谱图见图 B.3 图 B.3 环己基氨基磺酸钠标准溶液的液相色谱 - 质谱 / 质谱图 13

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中华人民共和国国家标准 GB 5009.251 2016 食品安全国家标准食品中 1,2- 丙二醇的测定 2016-08-30 发布 2017-03-01 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布前言本标准代替 GB/T23813 2009 食品中 1,2- 丙二醇的测定 NY/T1662 2008 乳与乳制品中 1, 2- 丙二醇的测定气相色谱法本标准与 GB/T23813 2009