42 卷第 6 期尤晴等 : 马铃薯 Y 病毒属三种病毒通用型单克隆抗体的鉴定 77 大豆马铃薯烟草番茄玉米等重要农作物的主要病害病毒粒子呈弯曲的线状, 长约 700~750nm, 其基因组为大约个核苷酸组成的单链正义 RNA 分子基因组只含有一个开放阅读框, 其两端含有非

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侃话华
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1 犘犾犪狀狋犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀马铃薯犢病毒属三种病毒通用型单克隆抗体的鉴定尤晴 1,2, 李小宇 2, 张春雨 2, 张淋淋 3, 宋景荣 4, 王永志 2, 李启云 2 (1. 吉林农业大学, 长春 ;2. 吉林省农业科学院植物保护研究所, 农业部东北作物有害生物综合治理重点实验室, 吉林省农业微生物重点实验室, 公主岭 ;3. 东北农业大学, 哈尔滨 ;4. 呼伦贝尔市农业科学研究所, 扎兰屯 ) 摘要构建了马铃薯 Y 病毒属的大豆花叶病毒 ( 犛狅狔犫犲犪狀犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊,SMV) 马铃薯 Y 病毒 ( 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犢, PVY) 三叶草黄脉病毒 ( 犆犾狅狏犲狉狔犲犾狅狑狏犲犻狀狏犻狉狌狊,CLYVV) 的原核表达载体 pet28 SMVCP pet28 PVYCP 和 pet28 CLYVVCP, 经 IPTG 诱导表达和纯化, 获得 SMV PVY 和 CLYVV 的 CP 蛋白采用 ELISA 方法, 用 9 株实验室制备的单克隆抗体对含 SMV PVY CLYVV 的病毒汁液和纯化的重组 CP 蛋白进行检测分析结果表明,9 株单克隆抗体均识别 SMV 病毒,2D3 4F9 4G12 和 6E7 单克隆抗体能够识别 PVY 病毒,4F9 和 4G12 能够识别 CLYVV 病毒, 但 PVY CLYVV 病毒与抗体的亲和力低于 SMV 病毒 ; 对于重组表达的衣壳蛋白 :SMV CLYVV 与抗体 2D3 4F9 4G12 和 6E7 反应强烈,PVY 与 4F9 和 4G12 抗体反应稍强综上, 本研究鉴定出能识别 SMV PVY CLYVV 的通用单克隆抗体 4F9 和 4G12 关键词大豆花叶病毒 ; 马铃薯 Y 病毒 ; 三叶草黄脉病毒 ; CP 蛋白 ; 抗体鉴定中图分类号 : S 文献标识码 : A 犇犗犐 : /j.issn 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狌狀犻狏犲狉狊犪犾犿狅狀狅犮犾狅狀犪犾犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊犪犵犪犻狀狊狋狋犺狉犲犲狏犻狉狌狊犲狊狅犳犘狅狋狔狏犻狉狌狊 1,2 犢狅狌犙犻狀犵, 犔犻犡犻犪狅狔狌 2, 犣犺犪狀犵犆犺狌狀狔狌 2, 犣犺犪狀犵犔犻狀犾犻狀 3, 4 犛狅狀犵犑犻狀犵狉狅狀犵, 犠犪狀犵犢狅狀犵狕犺犻 2, 2 犔犻犙犻狔狌狀 (1. 犑犻犾犻狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犆犺犪狀犵犮犺狌狀 , 犆犺犻狀犪 ;2. 犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犘犾犪狀狋犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀, 犑犻犾犻狀犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊, 犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犐狀狋犲犵狉犪狋犲犱犘犲狊狋犕犪狀犪犵犲犿犲狀狋狅狀犆狉狅狆狊犻狀犖狅狉狋犺犲犪狊狋, 犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲 ; 犑犻犾犻狀犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵狔, 犌狅狀犵狕犺狌犾犻狀犵 , 犆犺犻狀犪 ;3. 犖狅狉狋犺犲犪狊狋犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犎犪狉犫犻狀 , 犆犺犻狀犪 ;4. 犎狌犾狌狀犫狌犻狉犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊, 犣犺犪犾犪狀狋狌狀 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋犘狉狅犽犪狉狔狅狋犻犮犲狓狆狉犲狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狊狆犈犜 28 犛犕犞犆犘, 狆犈犜 28 犘犞犢犆犘犪狀犱狆犈犜 28 犆犔犢犞犞犆犘狅犳狋犺狉犲犲犘狅狋狔狏犻狉狌狊狏犻狉狌狊犲狊 ( 犛狅狔犫犲犪狀犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊, 犛犕犞 ; 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犢, 犘犞犢 ; 犪狀犱犆犾狅狏犲狉狔犲犾狅狑狏犲犻狀狏犻狉狌狊, 犆犔犢犞犞 ) 狑犲狉犲犮狅狀狊狋狉狌犮狋犲犱. 犜犺狉狅狌犵犺犐犘犜犌犻狀犱狌犮狋犻狅狀, 犲狓狆狉犲狊犻狅狀犪狀犱狆狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀, 狑犲狅犫狋犪犻狀犲犱狋犺犲犆犘狆狉狅狋犲犻狀狊狅犳犛犕犞, 犘犞犢犪狀犱犆犔犢犞犞. 犜犺犲犿狅狀狅犮犾狅狀犪犾犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊狅犳 9 狊狋狉犪犻狀狊狆狉犲狆犪狉犲犱犫犲犳狅狉犲狑犲狉犲狌狊犲犱狋狅犱犲狋犲犮狋犛犕犞, 犘犞犢犪狀犱犆犔犢犞犞狏犻狉犪犾狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀狊犪狀犱狆狌狉犻犳犻犲犱犆犘狆狉狅狋犲犻狀狊. 犜犺犲犈犔犐犛犃狉犲狊狌犾狋狊狊犺狅狑犲犱狋犺犪狋狋犺犲 9 犿狅狀狅犮犾狅狀犪犾犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊狉犲犮狅犵狀犻狕犲犱犛犕犞狏犻狉狌狊 ; 狋犺犲犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊 2 犇 3,4 犉 9,4 犌 12 犪狀犱 6 犈 7 狉犲犪犮狋犲犱狑犻狋犺犘犞犢 ; 犆犔犢犞犞狑犪狊狉犲犮狅犵狀犻狕犲犱犫狔狋犺犲犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊 4 犉 9 犪狀犱 4 犌 12, 犫狌狋狋犺犲犪狆狆犲狋犲狀犮狔犫犲狋狑犲犲狀犘犞犢狅狉犆犔犢犞犞犪狀犱犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊狑犪狊犾狅狑犲狉狋犺犪狀狋犺犪狋狅犳犛犕犞. 犃狊犳狅狉狋犺犲狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋犲狓狆狉犲狊犲犱犆犘狆狉狅狋犲犻狀狊, 犛犕犞犪狀犱犆犔犢犞犞犆犘狊狉犲犪犮狋犲犱狑犻狋犺 2 犇 3,4 犉 9,4 犌 12 犪狀犱 6 犈 7 狊狋狉狅狀犵犾狔 ; 犘犞犢犆犘狉犲犪犮狋犲犱狑犻狋犺 4 犉 9 犪狀犱 4 犌 12. 犐狀犵犲狀犲狉犪犾, 犿狅狀狅犮犾狅狀犪犾犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊 4 犉 9 犪狀犱 4 犌 12 犮狅狌犾犱狉犲犮狅犵狀犻狕犲犛犕犞, 犆犔犢犞犞犪狀犱犘犞犢狌狀犻狏犲狉狊犪犾狔. 犜犺犻狊狊狋狌犱狔狆狉狅狏犻犱犲犱狋狑狅狌狀犻狏犲狉狊犪犾犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊犪犵犪犻狀狊狋犘狅狋狔狏犻狉狌狊. 犓犲狔狑狅狉犱狊犛狅狔犫犲犪狀犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 ; 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犢 ; 犆犾狅狏犲狉狔犲犾狅狑狏犲犻狀狏犻狉狌狊 ; 犮狅犪狋狆狉狅狋犲犻狀 ; 犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀马铃薯 Y 病毒属 ( 犘狅狋狔狏犻狉狌狊 ) 是植物病毒中最 [1] 大的属, 包括 111 个确定种和 86 个暂定种, 占已知植物病毒的 30% 该属病毒引起的病毒病对粮食作物园艺观赏植物经济作物牧草药材果树 [2] 等造成了严重的经济损失犘狅狋狔狏犻狉狌狊寄主范围最广, 可侵染豆科茄科菊科苋科和藜科植物, 是收稿日期 : 修订日期 : 基金项目 : 吉林省自然科学基金 ( JC); 吉林省农业微生物重点实验室平台建设项目 ( ) 通信作者 E mail:yzwang@126.com;qyli1225@126.com

2 42 卷第 6 期尤晴等 : 马铃薯 Y 病毒属三种病毒通用型单克隆抗体的鉴定 77 大豆马铃薯烟草番茄玉米等重要农作物的主要病害病毒粒子呈弯曲的线状, 长约 700~750nm, 其基因组为大约个核苷酸组成的单链正义 RNA 分子基因组只含有一个开放阅读框, 其两端含有非编码区 (untranslatedregion,utr) 开放阅读框编码一个大的多聚蛋白, 多聚蛋白在翻译后自我分解为 VPg(virus encodedgenomelinkedpro tein) P1 HC Pro(aphidtransmissionhelpercom ponent protease) P3 CI(cylindricalinclusionpro tein) 6K1 6K2 NIa(nuclearinclusionproteina) NIb(nuclearinclusionproteinb) CP(coatprotein) [34] 等蛋白质大多数犘狅狋狔狏犻狉狌狊成员由蚜虫以非持久性方式传播蚜虫传播病毒需要病毒编码的两种蛋白, 一种是衣壳蛋白 (CP), 另一种是辅助成分蛋白酶 (HC Pro) [56] [7] 1982 年 Doem 等首次成功研制出烟草花叶病毒 ( 犜狅犫犪犮犮狅犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊, TMV) 的单克隆抗体以来, 因其具有灵敏度高特异性强的特点, 在多种植物病毒上得到广泛应用美 [8] 国 Hil 等曾研制出两株对 SMV 有不同抗原决定簇特异性的单克隆抗体 ; 为建立我国的 SMV 杂交 [9] 瘤细胞株, 国内郭景荣等早在 1990 年获得 3 株分泌抗 SMV 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 且与同属的豇豆蚜传花叶病毒 ( 犆狅狑狆犲犪犪狆犺犻犱犫狅狉狀犲犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊,CAMV) 和西瓜花叶病毒 2( 犠犪狋犲狉犿犲犾狅狀犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 2,WMV 2) 以及不同属的 TMV 均无交 [10] 叉反应 ; 王永志等等制备了 9 株 SMV 衣壳蛋白的单克隆抗体同样国内外已筛选并建立了分泌抗 [1114] PVY 的中和抗体犘狅狋狔狏犻狉狌狊成员复杂, 且株系分化大变异频繁, 了解各种之间亲缘关系是否存在相同的抗原表位分析抗原特异性, 对单克隆抗体的制备及今后病毒检测提供了依据因此, 研究 PVY SMV CLYVVCP 蛋白之间抗原表位的关系及其分子变异情况, 将有助于了解病毒病的流行和演化趋势, 为今后快速检测和抗病育种提供理论依据 1 材料与方法 1.1 试验材料本研究采用的 SMV( 寄主为大豆 ) 是本实验室保存的东北大豆花叶病毒 3 号株系,PVY( 寄主为马铃薯 ) 采自内蒙古扎兰屯,CLYVV( 寄主为蚕豆 ) 为本实验室保存毒株, 其 CP 基因已通过前期试验获得 9 株抗 SMV 的单克隆抗体 1C2 2A8 2C1 2D3 3B8 4F9 4G12 5D2 和 6E7 [10] 由实验室制备和保存 La 犜犪狇 DNA 聚合酶 1ststrandcDNA Syn thesiskit 反转录试剂盒和限制性内切酶购自大连宝生物公司,SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司,T4DNA 连接酶购自 Thermo 公司,Ni 2+ 离子亲和层析柱购自美国 GE 公司,HRP 标记的鼠源抗体购自 Sigma 公司 1.2 犘犞犢犛犕犞和犆犔犢犞犞衣壳蛋白基因的克隆根据 GenBank 中登录的 PVY SMV CLYVV 的基因序列设计了扩增 CP 基因的特异性引物, 上游引物的下画线处为犖犮狅 Ⅰ 酶切位点, 下游引物的下画线处为犅犪犿 HⅠ 酶切位点上游引物分别为 PVY F:5 AATAATAATCCATgggAAATgACA CAATCgATgCAg 3 SMV F:5 AATAATAAT CCATgggCAAggAgAAggAAggAgAC 3 CLYVV F: 5 AATAATAATCCATggACAAAgAgAAgTTgA ATgTTg 3 ; 下游引物分别为 PVY R:5 AATA ATAATggATCCATgTTCTTCACTCCAAgTAgAg 3 SMV R:5 AATAATAATggATCCTgCTgT gggcccatgcc 3 CLYVV R:5 AATAATAAT ggatccaatcgtgctccagcaatgtg 3 以 TRIzol 法抽提感染病毒的样品叶片总 RNA, 用 1ststrandcDNASynthesisKit 反转录试剂盒合成 cdna 体外第一条链, 以此为模板用 La 犜犪狇 DNA 聚合酶扩增 CP 基因反应程序为 :94 预变性 1min;98 变性 10s,53 退火 45s,72 延伸 1.5min, 进行 30 个循环 ;72 再延伸 10min, 反应完成后 4 保存 PCR 产物进行凝胶浓度为 1% 的琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下切胶, 按 SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒回收 PCR 产物,-20 保存备用回收后的 PCR 产物, 与 pmd18 T 载体 16 作用连接 1h, 转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 构建重组载体 pmd PVYCP pmd SMVCP pmd CLYVVCP 1.3 原核表达载体的构建利用犖犮狅 Ⅰ 和犅犪犿 HⅠ 双酶切重组 pmd PVYCP pmd SMVCP pmd CLYVV CP 和原核表达载体 pet 28a(+), 凝胶纯化回收目的片段, 将 PVYCP SMVCP CLYVVCP 基因与 pet 28a(+) 连接, 构建重组载体 pet28a PVYCP pet28a SMVCP pet28a CLYVVCP, 转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 经双酶切和 PCR 鉴定鉴定后, 送往测序公司进行测序

3 重组蛋白的表达与鉴定重组 pet28a PVY CP pet28a SMV CP pet28a CLYVVCP 转化大肠杆菌 Roseta Ⅱ, 经 IPTG 诱导,SDS PAGE 电泳分析, 考马斯亮蓝染色脱色后观察表达产物 [15] 1.5 重组蛋白的纯化将诱导表达后的菌液于 r/min 离心 10min, 收集菌体超声波 400 W,3s 工作时间,3s 间隔时间, 重复 5min 破碎菌体后收集包涵体表达的重组 PVYCP SMVCP CLYVVCP, 重组蛋白的纯化参照文献 [10], 包涵体蛋白经高浓度变形剂充分溶解, 利用镍离子亲和层析柱纯化,SDS PAGE 电泳分析纯化结果, 考马斯亮蓝染色脱色后观察纯化产物 1.6 犘犞犢犛犕犞犆犔犢犞犞的抗体特异性鉴定通过实验室制备的 9 株单克隆抗体, 分别对感染 SMV PVY CLYVV 的病毒叶片制备的病毒汁液以及纯化后的 CP 蛋白进行 ELISA 鉴定 ELISA 鉴定参照文献 [16], 并采用优化的最佳参数 : 包被原按照每孔 2μL/mL 浓度包被 96 孔板, 4 过夜,PBST 洗脱 3 遍 ;5% 脱脂奶 300μL/ 孔 37 封闭 1h,PBST 洗脱 3 遍 ; 一抗 1000 倍稀释于封闭液中,100μL/ 孔 37 作用 1h,PBST 洗脱 3 遍 ; 酶标抗体 5000 倍稀释于封闭液中,100μL/ 孔 37 作用 1h,PBST 洗脱 6 遍, 拍干 ; 室温避光条件下单组分 TMB 显色液显色 30 min 后,2 mol/l H2SO450μL/ 孔终止反应, 酶标仪测定犃 490 记录反应结果, 用 P/N 值即检测犃 490 值与阴性犃 490 值对比, 根据数值大小以分级记载, + 以上均为阳性反应 [17] 2 结果与分析 2.1 犘犞犢犆犘犛犕犞犆犘犆犔犢犞犞犆犘基因的克隆以反转录合成的 cdna 为模板进行 PCR 扩增, 琼脂糖凝胶电泳分析结果表明, 在 900bp 左右有 1 条特异性条带, 与 PVYCP SMVCP CLYVVCP 基因大小 (900bp) 相吻合, 回收后连入 pmd 18T 载体中, 经双酶切鉴定, 产生大小约为 2700bp 和 900bp 两条带测序结果表明所克隆基因为 PVY CP SMVCP CLYVVCP 基因 2.2 衣壳蛋白的表达与纯化 PVYCP SMV CP CLYVV CP 基因与 pet 28a(+) 连接, 构建重组 pet28a PVYCP pet28a 2016 SMVCP pet28a CLYVVCP, 经双酶切鉴定产生大小约为 5300bp 和 900bp 两条带, 经 PCR 鉴定产生 900bp 一条带, 表明所表达基因为 PVYCP SMV CP CLYVV CP 基因转化 pet28a PVY CP pet28a SMV CP pet28a CLYVV CP 的 Ro setai 菌株经 IPTG 诱导后,SDS PAGE 电泳发现, 在相对分子量 33kDa 处, 沉淀中有 1 条特异性条带 ( 图 1) 以融合的包涵体形式表达的 PVYCP SMV CP CLYVVCP 重组蛋白经镍离子亲和层析纯化 ( 图 1), 得到清晰的单一条带, 分子量大小与 PVY CP SMVCP CLYVVCP 重组蛋白相符, 说明经过纯化后获得了高纯度的 PVY CP SMV CP CLY VVCP 重组蛋白图 1 马铃薯犢病毒大豆花叶病毒三叶草黄脉病毒衣壳蛋白的诱导及纯化犉犻犵.1 犐狀犱狌犮狋犻狅狀犪狀犱狆狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犞犢, 犛犕犞犪狀犱犆犔犢犞犞犮狅犪狋狆狉狅狋犲犻狀狊 2.3 犘犞犢犛犕犞犆犔犢犞犞的抗体鉴定将 3 种病毒叶片粗研磨上清和纯化后的 CP 蛋白分别与 9 株 SMV 单克隆抗体进行 ELISA 分析,3 次重复, 如表 1 显示, 对于含 PVY SMV 和 CLYVV 的叶片粗研磨上清液,SMV 结合抗体的能力高于 PVY 和 CLYVV, 其与 9 株单克隆抗体均可反应 ; PVY 能与抗体 2D3 4F9 4G12 和 6E7 结合, 但是亲和力不如 SMV;CLYVV 与 4F9 和 4G12 反应较强 ; 对于已纯化的衣壳蛋白 :SMV CLYVV 与抗体 2D3 4F9 4G12 和 6E7 反应强烈,PVY 能与抗体 4F9 和 4G12 反应抗体 4F9 和 4G12( 表 1 加粗所示 ) 能特异性识别所有这 3 株病毒和重组衣壳蛋白

4 42 卷第 6 期尤晴等 : 马铃薯 Y 病毒属三种病毒通用型单克隆抗体的鉴定 79 表 1 病毒汁液重组表达犆犘蛋白分别对 9 株单克隆抗体的犈犔犐犛犃分析 1) 犜犪犫犾犲 1 犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犈犔犐犛犃犫犲狋狑犲犲狀狏犻狉狌狊犲狊, 狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋犮狅犪狋狆狉狅狋犲犻狀犪狀犱 9 犿狅狀狅犮犾狅狀犪犾犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊 1C2 2A8 2C1 2D3 3B8 4 犉 9 4 犌 12 5D2 6E7 PVY SMV CLYVV PVYCP SMVCP CLYVVCP )PVY: 马铃薯 Y 病毒扎兰屯分离株 ;SMV: 大豆花叶病毒东北 3 号株系 ;CLYVV: 白三叶黄脉病毒 ;PVYCP: 重组表达的马铃薯 Y 病毒衣壳蛋白 ;SMVCP: 重组表达的大豆花叶病毒衣壳蛋白 ;CLYVVCP: 重组表达的白三叶黄脉病毒衣壳蛋白 -:P/N<2.1;+:2.1 P/ N<5;++:5 P/N<10;+++:P/N 10 PVY: 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犢 Zalantunstrain;SMV: 犛狅狔犫犲犪狀犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 NortheastNo.3strain;CLYVV: 犆犾狅狏犲狉狔犲犾狅狑狏犲犻狀狏犻狉狌狊 strain; PVYCP:Recombinantexpressed 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犢 coatprotein;smvcp:recombinantexpressed 犛狅狔犫犲犪狀犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 coatprotein;cly VVCP:Recombinantexpressed 犆犾狅狏犲狉狔犲犾狅狑狏犲犻狀狏犻狉狌狊 coatprotein.-:p/n<2.1;+:2.1 P/N<5;++:5 P/N<10;+++:P/ N 讨论马铃薯 Y 病毒属的整个基因组编码一个多聚蛋白, 通过自身蛋白酶切割后形成至少 10 个功能不同的成熟蛋白, 其中衣壳蛋白是结构蛋白完整病毒粒子的衣壳蛋白质有四级结构病毒的 CP 起着保护核酸的作用, 并决定着病毒的不同形态 CP 在病毒的侵染过程中对寄主细胞还具有识别作用病毒 CP 还含有抗原决定簇, 决定着病毒的抗原特异性有利用相同单克隆抗体鉴别 PVY 不同血清型 [1819] 的研究本研究采用 ELISA 方法, 用实验室制备的 9 株抗 SMV 蛋白的单克隆抗体对马铃薯 Y 病毒属的 PVY SMV 和 CLYVV 进行检测结果证明, 这 9 株抗体都能不同程度地与同属不同种的病毒抗原结合, 其中一些抗体可识别所有测试毒株, 说明 PVY SMV CLYVV 衣壳蛋白有抗原的交叉性, 即存在共同的抗原表位, 且该抗原表位在马铃薯 Y 病毒属 3 种病毒中是高度保守的 ; 进一步对抗原表位的定位研究将有助于对马铃薯 Y 病毒属衣壳蛋白结构和功能的理解同种病毒的两种抗原状态, 即天然病毒分子和重组表达的衣壳蛋白针对同一株抗体反应有差别, 感病叶片组织的研磨上清为天然构象分子, 但在大肠杆菌中表达的衣壳蛋白缺少真核生物的蛋白折叠, 与病毒蛋白结构不一致, 这导致了同一抗体与同一病毒衣壳蛋白的不同结构形式的亲和力不一致前期研究表明,9 株抗体与大豆花叶病毒结合后能阻断病毒侵染大豆植株, 即具有中和活性, 属于中和抗体, 病毒编码基因可以作为抗病基因进行抗病育种, 即利用植物抗体技术进行抗病分子育种本研究表明,4F9 和 4G12 这两株单克隆抗体能够识别马铃薯 Y 病毒属的多个成员, 因此, 该抗体的应用范围更广, 该抗体所识别的抗原表位具有保守性, 可作为抗病研究的理想靶点本研究鉴定的马铃薯 Y 病毒属通用型单克隆抗体, 为病毒检测方法研究致病机理研究和抗病研究提供了基础材料参考文献 [1] FauquetC M,MayoM A,ManilofJ,etal.Virus 犜犪狓狅狀狅犿狔 :Ⅷthreportoftheinternationalcommiteeontaxonomyof virus[r].sandiego:elsevieracademicpress,2005. [2] McKernN M,ShuklaDD,TolerR W,etal.Confirmation thatthesugarcanemosaicvirussubgroupconsistsoffourdis tinctpotyvirusesbyusingpeptideprofilesofcoatproteins[j]. TheAmericanPhytopathologicalSociety,1991,81(9): [3] RiechmannJL,LaínS,GarcíaJA.Highlightsandprospects of 犘狅狋狔狏犻狉狌狊 molecularbiology[j].journalofgeneralvirolo gy,1992,73:1 16. [4] Urcuqui InchimaS,HaenniA L,BernaidiF.Potyviruspro teins:awealthoffunctions [J].VirusResearch,2001,74: [5] GovierDA,KassanisB.Evidencethatacomponentotherthan thevirusparticleisneededforaphidtransmissionof 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犢 [J].Virology,1974,57(1): [6] SakoN,OgataK.Diferenthelperfactorsasociatedwithaphid transmisionofsomepotyviruses[j].virology,1981,112(2): ( 下转 85 页 )

5 42 卷第 6 期袁高庆等 :3,4,5 三羟基苯甲酸甲酯防治番茄青枯病的物理作用方式及其对番茄根系次生代谢物质的影响 85 mechanismsofmethylgalateagainst 犚犪犾狊狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犪犮犲犪狉狌犿 [J].AustralasianPlantPathology,2014,43(1):1 7. [5] 李悦, 范腕腕, 袁高庆, 等.3,4,5 三羟基苯甲酸甲酯的抑菌特性及其对番茄青枯病的田间防治作用 [J]. 农药,2014,53 tyof 犎狔狆狅狓犻狊犺犲犿犲狉狅犮犪犾犻犱犲犪 (Hypoxidaceae):Canleavesbe substitutedforcormsasaconservationstrategy?[j].south AfricanJournalofBotany,2008,74(4): [13] MiraliakbariH,ShahidF.Antioxidantactivityofminorcompo (11): [6] ChaubalR,DeshpandeV H,DeshpandeNR.Methylgalate, themedicinalyimportantcompound:areview[j].electron JournalofEnvironmental,AgriculturalandFoodChemistry, 2005,4: [7] AhnYJ,LeeH S,OhH S,etal.Antifungalactivityand modeofactionofgalarhois derivedphenolicsagainstphyto pathogenicfungi[j].pesticidebiochemistryandphysiology, 2005,81(2): [8] MéndezJ,MatoM C.Methylgalateandrelatedpolyphenols asauxinprotectors[j].phytochemistry,1997,44: [9] MéndezJ,VázquezA,MatoMC.Methylgalateandits3 glu cosidepromoterootinginbeancutings [J].PlantGrowth Regulation,2004,43(3): [10] 郭广君, 高建昌, 王孝宣, 等. 不同番茄种质叶表次生代谢物质 [J]. 植物学报,2014,49(1): [11]LytovchenkoA,BeleggiaR,SchauerN,etal.Applicationof GC MSforthedetectionoflipophiliccompoundsindiverse planttissues[j].plantmethods,2009,5(1):4 11. nentsoftreenutoils[j].foodchemistry,2008,111: [14] 刘建群, 吴继梅, 张锐. 扁担杆化学成分体外抑菌活性研究 [J]. 江西中医学院学报,2009,21(2): [15]MendonAdeL,daSilvaCE,deMesquitaFL,etal.Anti mi crobialactivitiesofcomponentsoftheglandularsecretionsof leafcutingantsofthegenus 犃狋犪 [J].AntonieVanLeeuwen hoek,2009,95(4): [16] 隋洪楠. 香草精油作为抗菌剂的应用 [J]. 发酵科技通讯, 2014,43(2): [17]LeeI,LeeYH,LeonardJ,etal.Ursolicacid inducedchangesin tumorgrowth,o2consumptionandtumorinterstitialfluidpresure [J].AnticancerResearch,2001,21: [18] 周立刚. 植物抗菌化合物 [M]. 北京 : 中国农业科学技术出版社,2005: [19]GrayerRJ,HarborneJB.Asurveyofantifungalcompounds fromhigherplants[j].phytochemistry,1994,37: [20]AnY,ShenYB,WuLJ,etal.Achangeofphenolicacidscontent inpoplarleavesinducedbymethylsalicylateandmethyljasmonate [J].JournalofForestryResearch,2006,17(2): [12]KaterereDR,ElofJN.Anti bacterialandanti oxidantactivi ( 责任编辑 : 田?) 櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍 ( 上接 79 页 ) [7] DeomC M,OliverMJ,BeachyR N.The30 kilodaltongene productof 犜狅犫犪犮犮狅犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 potentiatesvirus movement [J].Science,1982,237(4813): [8] HilEK,HilJH,DurandDP.Productionofmonoclonalanti bodiestovirusesinthe 犘狅狋狔狏犻狉狌狊 group:useinradioimmunoas say[j].journalofgeneralvirology,1984,65: [9] 郭景荣, 陈永宣. 大豆花叶病毒单克隆抗体 (SMV McAb) 的研究 [J]. 植物病理学报,1990,20(2): [10] 王永志, 苏颖, 米丽娟, 等. 东北地区大豆花叶病毒 3 号株系衣壳蛋白的表达纯化及单克隆抗体制备 [J]. 吉林农业科学, 2011,36(6): [11] 姚康生, 蔡少华, 贾士荣, 等. 分泌抗与马铃薯 Y 病毒株系特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 [J]. 中国农业科学,1985 (3):91. [12] 郭军, 肖小文, 蔡少华, 等. 分泌抗马铃薯 Y 病毒单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞系的建立及抗体稳定性测定 [J]. 生物工程学报,1990,6(3): [13] 刘德虎, 郭军, 陈三风, 等. 植物抗体基因工程 :I. 分泌马铃薯 Y 病毒中和抗体杂交瘤细胞系的筛选 [J]. 高技术通讯, 1995(2): [14]RouisS,TraincardF,GargouriR,etal.Inhibitionofpotato virusyniaactivity:preparationofmonoclonalantibodydirect edagainst PVY NIproteinthatinhibitscleavage of PVY polyprotein [J].ArchivesofVirology,2001,146(7): [15] 高旭东, 王永志, 时圣凤, 等. 膦丝菌素乙酰转移酶的表达及单克隆抗体的制备 [J]. 细胞与分子免疫杂志,2013,29:4 7. [16] 王雨. 侵染大豆的病毒鉴定和部分 SMV 分离物 CP 基因的序列分析 [D]. 南京 : 南京农业大学,2011: [17] 谢联辉, 林奇英. 植物病毒学 [M]. 第 2 版. 北京 : 中国农业出版社,2004:26. [18]OunounaH,KerlanC,LafayeP,etal.Productionofmono clonalantibodiesagainstsyntheticpeptidesofthen terminalre gionof 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犢 coatproteinandtheiruseinpvystrain diferentiation[j].plantpathology,2002,51(4): [19] MohamadChikh Ali,Tetsuo Maoka,KeikoT Natsuaki.A pointmutationchangestheserotypeofa 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犢 isolate; genomicdeterminationoftheserotypeofpvystrains[j].virus Genes,2007,35(2): ( 责任编辑 : 田?)

(CIP) /., ISBN Ⅰ. Ⅱ. Ⅲ. Ⅳ.F239.1 CIP (2001) ISBN /F

(CIP) /., ISBN Ⅰ. Ⅱ. Ⅲ. Ⅳ.F239.1 CIP (2001) ISBN /F (CIP) /.,2001.7 ISBN7 301 05046 1 Ⅰ. Ⅱ. Ⅲ. Ⅳ.F239.1 CIP (2001)034699 ISBN7 301 05046 1/F 423 100871 62752015 62754140 62752027 787 10921620392 20017 20017 30.00 , ;, ; ;, ; ;, ,,,,,,,, ;, ; ; ;,,,,,,,,,,