1732 化工学报第 56 卷抑制丙酮酸激酶的活性, 对葡萄糖的主流代谢途径进行调节, 从而提高肌苷的产率 [5]. 本文应用代谢流分析技术, 利用大量的肌苷发酵过程在线数据和离线数据, 对这一现象进行了深入的定量研究. 要是将 1 分子葡萄糖分解为 2 分子丙酮酸, 包括狉 4 狉 6 狉 7

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禹都
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1 第 56 卷第 9 期化工学报 Vol.56 No 年 9 月 Journal of Chemical Industry and Engineering (China) September 2005 檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭研究论文柠檬酸钠对肌苷发酵过程代谢流分布的调节陈双喜 1,2, 黄明志 1, 储炬 1, 庄英萍 1, 张嗣良 1 ( 1 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海 ; 2 河南大学生命科学学院, 河南开封 ) 摘要 : 基于物料的质量守恒定律和中间代谢物的拟稳态假设, 定量研究了柠檬酸钠对肌苷发酵过程不同时段代谢流分布的影响. 结果表明, 添加的柠檬酸钠能够抑制存在于 EMP 途径和 TCA 循环之间的碳源溢流. 在 24 h 以后,EMP 途径的代谢通量平均降低 33%,HMP 途径通量平均增加 76%, 肌苷合成途径通量平均增加 77%, 最终产苷由 17.44g L -1 提高到 24g L -1, 增幅达 37.6%. 关键词 : 枯草杆菌 ; 肌苷 ; 碳源溢流 ; 代谢流调节中图分类号 :Q525 文献标识码 :A 文章编号 : (2005) 犚犲犵狌犾犪狋犻狅狀狅犳狊狅犱犻狌犿犮犻狋狉犪狋犲狅狀犿犲狋犪犫狅犾犻犮犳犾狌狓犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳犻狀狅狊犻狀犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狆狉狅犮犲狊狊 1,2 犆犎犈犖犛犺狌犪狀犵狓犻, 犎犝犃犖犌犕犻狀犵狕犺犻 1, 犆犎犝犑狌 1, 1 1 犣犎犝犃犖犌犢犻狀犵狆犻狀犵, 犣犎犃犖犌犛犻犾犻犪狀犵 ( 1 犛狋犪狋犲犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犅犻狅狉犲犪犮狋狅狉犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵, 犈犪狊狋犆犺犻狀犪犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔, 犛犺犪狀犵犺犪犻 , 犆犺犻狀犪 ; 2 犛犮犺狅狅犾狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲, 犎犲狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犓犪犻犳犲狀犵 , 犎犲狀犪狀, 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Metabolicfluxanalysis wasusedtounderstand macroscopicalcharacteristicsoffermentation processandcelularmetabolicregulation.basedonthelaw ofmassconservationandtheassumptionof pseudo steady statefortheintermediatesinthe metabolicpathways,theefectofsodiumcitrateonthe fluxesdistributionofinosinefermentationprocesswasquantitativelyanalyzed.itwasrevealedthatcarbon overflowbetweenemppathwaysandtcacyclecouldberestrainedwiththemediumsupplementedwith sodiumcitrate.after24hours,thefluxofemppathwaydecreasedby33% averagely,thefluxofhmp pathwayincreasedby76% averagely,andthefluxofinosinesynthesispathwayincreasedby77% on average.thefinalinosineyieldwasimprovedfrom17.44g L -1 to24g L -1,byanincreaseof37.6%. 犓犲狔狑狅狉犱狊 : 犅犪犮犻犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊 ;inosine;carbonoverflow;fluxregulation 引言对微生物细胞内的代谢网络进行定量分析, 对于深入理解发酵过程中的宏观代谢特征和细胞的代 [1,2] 谢调控机制有着很重要的意义. 代谢流的研究方法有很多种, 在缺乏相关代谢反应的动力学和调节信息时, 可利用物料的质量守恒定律和对中间代谢物的拟稳态假设, 通过测定细胞生长量产物生成量底物消耗量和其他代谢物积累量, 计算出细 [3] 胞内代谢流的分布. 目前, 代谢流分析技术已经 [4] 广泛应用于多种细胞培养和产物合成的研究中. 在肌苷发酵过程中, 加入 0.2% 柠檬酸钠能够收到初稿, 收到修改稿. 联系人 : 储炬. 第一作者 : 陈双喜 (1973 ), 男, 博士研究生, 讲师. 基金项目 : 上海市曙光计划资助项目 (01SG28); 上海市重点学科建设项目. 犚犲犮犲犻狏犲犱犱犪狋犲 : 犆狅狉狉犲狊狆狅狀犱犻狀犵犪狌狋犺狅狉 :Prof.CHU Ju. 犈 - 犿犪犻犾 ecust.edu.cn 犉狅狌狀犱犪狋犻狅狀犻狋犲犿 :supportedbytheshanghaishu GuangPlan (01SG28)andShanghaiKeySubjectConstructionItem.

2 1732 化工学报第 56 卷抑制丙酮酸激酶的活性, 对葡萄糖的主流代谢途径进行调节, 从而提高肌苷的产率 [5]. 本文应用代谢流分析技术, 利用大量的肌苷发酵过程在线数据和离线数据, 对这一现象进行了深入的定量研究. 要是将 1 分子葡萄糖分解为 2 分子丙酮酸, 包括狉 4 狉 6 狉 7 狉 9 和狉 10 共 5 个代谢反应磷酸戊糖途径 (HMP) 部分磷酸戊糖途径主要是为细胞生长和产物合成提供前体和还原 1 实验材料和方法 1 1 菌种枯草杆菌犅. 狊狌犫狋犻犾犻狊 306 # (A -,8 AG r ) 由力, 包括狉 2 和狉 5 共 2 个代谢反应三羧酸循环 (TCA) 部分三羧酸循环主要作用是提供可氧化磷酸化为 ATP 的 NADH, 包括狉 11 狉 13 狉 14 狉 15 狉 16 狉 17 和狉 18 共 7 个代谢反应. 广东肇庆星湖科技股份有限公司提供. 1 2 培养基每升培养基中含有葡萄糖 110g 酵母膏 14g KH 2PO 45g 硫酸铵 15g 硫酸镁 2g CaCO 320 g 尿素 5g 玉米浆 10g, 消前 ph= 培养方法实验采用 50L 发酵罐, 培养基装量为 30L, 接种量 10%,37 培养 50h, 可以在线测定温度溶氧搅拌 ph 排气氧和二氧化碳的浓度, 具氧化磷酸化部分氧化磷酸化可将 NADH 和 FADH 2 氧化磷酸化为 ATP, 包括狉 20 狉 21 和狉 22 共 3 个代谢反应代谢物积累部分包括狉 1 狉 3 狉 8 狉 12 和狉 19 共 5 个代谢反应. 体装置参见文献 [6]. 1 4 测定方法细胞干重测定 : 取 5 ml 发酵液,3000r min -1 下离心, 沉淀于 100 下烘 24h 至恒重, 称重. 葡萄糖测定 : 葡萄糖氧化酶试剂盒. 肌苷测定 :HPLC 法 ( 高效液相色谱仪型号 Agilent1100, 色谱柱 HypersilODS 型 C 18 反相柱,250 mm 4mm). 色谱条件 : 流动相为 0.5% 的 KH 2PO 4, 波长为 254nm, 流速为 1.2ml min -1. 有机酸测定 :HPLC 法 ( 高压液相色谱仪型号 Agilent1100, 色谱柱 Aquasep 型 C 18 反相柱,250 mm 4.6 mm). 色谱条件为 :ph=2.3 的磷酸溶液, 流速 0.5ml min -1, 波长为 210nm. 2 结果与讨论 2 1 代谢网络的构建图 1 是根据文献 [2,7,8] 和研究需要建立的犅. 狊狌犫狋犻犾犻狊的简化代谢网络, 该代谢网络主要由糖酵解途径磷酸戊糖途径三羧酸循环氧化磷酸化和代谢物积累 ( 注 : 经检测, 在肌苷发酵过程中没有氨基酸积累, 故代谢网络的代谢物积累部分没有涉及氨基酸 ) 等 5 个部分组成. 表 1 是代谢网络的代谢反应式, 表 2 是根据物料的质量守恒定律和对中间代谢物的拟稳态假设建立的代谢网络的代谢方程组糖酵解途径 (EMP) 部分糖酵解途径主 Fig.1 Simplifiedmetabolicnetworkof 犅犪犮犻犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊 G6P glucose 6 phosphate;ru5p ribulose 5 phosphate;f6p fructose 6 phosphate; GAP glyceraldehydes 3 phosphate; PGA 3 phosphoglycericacid; PEP phosphoenolpyruvate;pyr pyruvate; AcCoA acetylcoenzymea;oaa oxaloacetate; CIT citricacid;oga oxoglutarate;mal malate 表 2 中的 22 种代谢物可分为 3 个部分 : 菌体合成前体胞外代谢物和胞内中间代谢物. 菌体合成前体包括狓 2 狓 3 狓 5 狓 6 狓 7 狓 8 狓 9 狓 10 狓 11 狓 13 狓 15 狓 17 狓 19 和狓 20 共 14 种代谢物, 每合成 1g 菌体时它们所需的量按表 3 计算. 表 3 的数据取自文献 [8]. 胞外代谢物包括狓 1 狓 5 狓 9 狓 10 狓 12 狓 14 狓 17 狓 18 和狓 19, 胞内中间代谢物包

3 第 9 期陈双喜等 : 柠檬酸钠对肌苷发酵过程代谢流分布的调节 1733 括狓 16 和狓 21. 犜犪犫犾犲 1 犕犲狋犪犫狅犾犻犮狉犲犪犮狋犻狅狀狊狅犳犅犪犮犻犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊狉 1:g lucose G6P 狉 2: G6P Ru5P+2NADPH+CO2 狉 3:Ru5P+PGA+Cl+CO2 +10ATP+2NADPH inosine+2nadh 狉 4: G6P F6P 2 狉 5: Ru5P 3 F6P+ 1 3 GAP 狉 6: F6P+ATP 2GAP 狉 7: GAP PGA+ATP+NADH 狉 8: PGA+NADPH 2Cl+CO2+NADH 狉 9: PGA PEP 狉 10: PEP PYR+ATP 狉 11: PYR AcCoA+NADH+CO2 狉 12: AcCoA acetate+atp 狉 13: AcCoA+OAA CIT 狉 14: CIT OGA+NADPH+CO2 狉 15: OGA MAL+NADH+FADH2+ATP+CO2 狉 16: MAL OAA+NADH 狉 17:PYR+CO2 +ATP OAA 狉 18: OAA+ATP PEP+CO2 狉 19: CIT organicacids 狉 20:NADH+ 1 2 O 2 1.3ATP 狉 21:FADH O 狉 22: 2 NADPH NADH 犜犪犫犾犲 2 狓 1(glucose):- 狉 1= 狇 glucose 2 3 ( 1.3ATP) 犕犲狋犪犫狅犾犻犮犲狇狌犪狋犻狅狀狊狅犳犅犪犮犻犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊狓 2(G6P): 狉 1- 狉 2- 狉 4= μ 狓 3(F6P): 狉狉 5- 狉 6= μ 狓 4(Ru5P): 狉 2- 狉 3- 狉 5=( ) 10-6 μ 狓 5(inosine): 狉 3= 狇 inosine 狓 6(GAP): 1 3 狉 5+2 狉 6- 狉 7= μ 狓 7(PGA):- 狉 3+ 狉 7- 狉 8- 狉 9= μ 狓 8(Cl):- 狉 3+2 狉 8= μ 狓 9(PEP): 狉 9- 狉 10+ 狉 18= μ+ 狇 PEP 狓 10(PYR): 狉 10- 狉 11- 狉 17= μ+ 狇 PYR 狓 11(AcCoA): 狉 11- 狉 12- 狉 13= μ 狓 12(acetate): 狉 12= 狇 acetate 狓 13(OAA):- 狉 13+ 狉 16+ 狉 17- 狉 18= μ 狓 14(CIT): 狉 13- 狉 14- 狉 19= 狇 CIT 狓 15(OGA): 狉 14- 狉 15= μ 狓 16(MAL): 狉 15- 狉 16=0 狓 17(CO2): 狉 2- 狉 3+ 狉 8+ 狉 11+ 狉 14+ 狉 15+ 狉 17+ 狉 18= μ+ 狇 CO 2 狓 18(O2):- 狉 20- 狉 21=-2 狇 O 2 狓 19(NADPH):2 狉 2-2 狉 3- 狉 8+ 狉 14- 狉 22= μ 狓 20(NADH):2 狉 3+ 狉 7+ 狉 8+ 狉 11+ 狉 15+ 狉 16- 狉 20+ 狉 22= μ 狓 21(FADH2): 狉 15- 狉 21=0 狓 22(organicacids): 狉 19= 狇 organicacids 犜犪犫犾犲 3 犃犿狅狌狀狋狅犳狆狉犲犮狌狉狊狅狉狉犲狇狌犻狉犲犱犳狅狉犫犻狅犿犪狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀 /10-6 mol g -1 Precursors Amount Precursors Amount G6P 154 AcCoA 2132 F6P 190 OAA 1923 R5P 816 OGA 1071 E4P 308 Cl 156 GAP 194 CO PGA 1395 ATP PEP 711 NADH PYR 2942 NADPH 代谢方程组的解表 2 中, 有 22 个未知数,22 个方程. 但因狉 10 狉 17 和狉 18 形成循环, 某一时刻狉 17 和狉 18 只能存在一个, 故实际上只有 21 个未知数, 方程组有最优解. 但为了检验代谢方程组解的有效性, 在解方程组时只用了 21 个方程, 即保留第 18 个方程以检验解的有效性. 在发酵过程中, 通过在线检测通气流量发酵液体积排气氧和二氧化碳浓度, 离线测定菌体干重 (DCW) 葡萄糖和肌苷浓度, 用 HPLC 测定乙酸柠檬酸磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸浓度, 得到了计算所需要的数据 ( 在线数据未列出, 离线数据见表 4 表 5). 利用 MATLAB 语言, 编程解出了柠檬酸钠添加前后的代谢方程组的解, 表 6 和表 7 分别是对照肌苷发酵过程和添加柠檬酸钠的发酵过程在各个时间段内的代谢流分布, 表中狇 O 2 是由尾气分析仪数据计算出的氧比消耗速率,ratio O 是狇 O 2 与代谢方程组解出的氧化磷酸化的比耗氧速率的比值. 该比值在 1 左右, 表明代谢方程组的解是可信的. 2 3 柠檬酸钠对葡萄糖代谢途径的调节作用图 2 (a)~ (c) 分别是柠檬酸钠添加前后发酵过程各个时间段的 HMP 途径 ( 狉 2) 肌苷合成途径 ( 狉 3) 和 EMP 途径 ( 狉 4) 流量的对比, 图 2 (d) 是两种情况下 HMP 途径通量 /EMP 途径通量 ( 狉 2/ 狉 4) 的对比. 可以看出, 培养基中添加柠檬酸钠对发酵过程中后期的葡萄糖代谢途径具有明显的调节作用. 与同阶段的对照发酵过程相比, 添加柠檬酸钠的发酵过程在 24h 以后, 狉 2 和狉 3 明显增大, 平均增幅分别达到 76% 和 77%; 而狉 4 有所下降, 平均降幅为 33%; 狉 2 的大幅增加和狉 4 的下降造成狉 2/ 狉 4 大幅升高, 平均增幅为 187%. 这些结果表明, 在培养基中加入柠檬酸钠, 使得发酵过程中后

4 1734 化工学报第 56 卷 Time /h DCW 犜犪犫犾犲 4 犗犳犾犻狀犲犱犪狋犪狅犳犻狀狅狊犻狀犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狆狉狅犮犲狊狑犻狋犺狅狌狋狊狅犱犻狌犿犮犻狋狉犪狋犲犪犱犱犻狋犻狅狀 Inosine Glucose Acetate Citricacid Pyruvate PEP Time /h DCW 犜犪犫犾犲 5 犗犳犾犻狀犲犱犪狋犪狅犳犻狀狅狊犻狀犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狆狉狅犮犲狊狑犻狋犺狊狅犱犻狌犿犮犻狋狉犪狋犲犪犱犱犻狋犻狅狀 Inosine Glucose Acetate Citricacid Pyruvate PEP 犜犪犫犾犲 6 犕犲狋犪犫狅犾犻犮犳犾狌狓犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳犻狀狅狊犻狀犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狆狉狅犮犲狊狑犻狋犺狅狌狋狊狅犱犻狌犿犮犻狋狉犪狋犲犪犱犱犻狋犻狅狀 / mol g Time/h 狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狇 O ratio O

5 第 9 期陈双喜等 : 柠檬酸钠对肌苷发酵过程代谢流分布的调节 1735 犜犪犫犾犲 7 犕犲狋犪犫狅犾犻犮犳犾狌狓犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳犻狀狅狊犻狀犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狆狉狅犮犲狊狑犻狋犺狊狅犱犻狌犿犮犻狋狉犪狋犲犪犱犱犻狋犻狅狀 / mol g Time/h 狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狉狇 O ratio O 期的葡萄糖代谢流由 EMP 途径向 HMP 途径迁移. 由于与 EMP 途径通量相比,HMP 途径所占比例较低, 而且 HMP 途径的通量大小和肌苷的合成直接相关, 所以 HMP 途径通量的提高明显促进了肌苷的合成, 产苷由 17.44g L -1 提高到 24g L -1, 增幅达 37.6%. Fig.2 Regulationofsodiumcitrateon glucosemetabolicpathway withoutsodiumcitrateaddition; withsodiumcitrateaddition 2 4 柠檬酸钠对碳源溢流的抑制文献报道, 在枯草杆菌的连续培养中, 柠檬酸

6 1736 化工学报第 56 卷和葡萄糖的联合代谢可增加 Ca 2+ 离子的吸收, 对丙酮酸激酶的活性产生强烈抑制, 造成 PEP 的累积, 由于 PEP 是磷酸果糖激酶的强烈抑制剂, 而磷酸果糖激酶是 EMP 途径的关键酶, 所以造成糖酵解途径通量减弱 [9].EMP 途径的减弱, 缓解了 EMP 途径和 TCA 循环之间存在的碳源溢流 [10], 使得乙酸等有机酸的生成量大大降低, 因而更多的碳源进入 HMP 途径. 本实验室的研究结果与文献的报道相吻合 [5]. 图 3 (a) (b) 分别是添加柠檬酸钠前后发酵过程各个时间段的丙酮酸合成途径 ( 狉 10) 和乙酸合成途径 ( 狉 12) 流量的对比. 与同阶段的对照发酵过程相比, 添加柠檬酸钠的发酵过程在 24h 以后, 狉 10 有所下降, 平均降幅 37%; 而对整个过程而言, 狉 12 均较低, 平均降幅 81%. 狉 10 的大小反应了丙酮酸激酶的活性, 狉 10 下降 37% 造成发酵液中丙酮酸浓度平均下降 86%, 乙酸浓度随之平均下降 63%, 丙酮酸激酶活性的降低造成 PEP 浓度平均增加 2.43 倍 ( 见表 4 和表 5). 上述结果表明, 在培养基中加入柠檬酸钠使得中后期丙酮酸激酶活性下降, 继而造成发酵液中丙酮酸和乙酸浓度下降,PEP 浓度升高,PEP 是磷酸果糖激酶的抑制剂, 使得狉 4 降低, 即 EMP 途径通量降低. 3 结论应用代谢流分析技术定量研究了柠檬酸钠对肌苷发酵过程代谢流分布的影响, 结合本实验室的研究结果, 可以认为 : 柠檬酸钠的添加使得丙酮酸激酶的活性在 24h 后平均下降 37%, 继而造成发酵液中丙酮酸浓度平均下降 86%, 乙酸浓度平均下降 63%,PEP 浓度平均增加 2.43 倍,PEP 浓度的增加抑制了磷酸果糖激酶的活性, 使 EMP 途径的代谢通量平均降低 33%. 根据物料平衡的原理,EMP 途径通量的下降, 使得 HMP 途径通量平均增加 76%, 肌苷合成途径通量平均增加 77%, 从而有效地促进了肌苷的合成, 最终产苷由 g L -1 提高到 24 g L -1, 增幅达 37.6%. 符号说明 -1 狇物质变化的比速率,mol g μ -1 菌体比生长速率,g g 犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊 [1] Edwards J S, Palsson B O. How wil bioinformatics influence metabolic engineering. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅犲狀犵., 1998,58 (2 3): [2] GoelA,FerranceJ,JeongJ,Ataai M M. Analysisof metabolicfluxesinbatchandcontinuousculturesof 犅犪犮犻犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅犲狀犵.,1993,42 (6): [3] NielsenJ. Metabolicengineering:techniquesforanalysisof targets for genetic manipulation. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅犲狀犵., 1998,58 (2 3): [4] ParkS M,SinskeyAJ,StephanopoulosG.Metabolicand physiological studies of 犆狅狉狔狀犲犫犪犮狋犲狉犻狌犿犵犾狌狋犪犿犻犮狌犿 mutants. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅犲狀犵.,1997,55 (6): [5] LiuXinxing ( 刘新星 ). Metabolicregulationandprocess optimizationofinosinefermentation:[thesis]( 学位论文 ). Shanghai: East China University of Science and Technology,2004 [6] ChenShuangxi( 陈双喜 ),CaiXianpeng ( 蔡显鹏 ),Wang Zhongshi( 王仲石 ),ChuJu ( 储炬 ),ZhuangYingping ( 庄 Fig.3 Depressionofsodiumcitrate oncarbonoverflow withoutsodiumcitrateaddition; withsodiumcitrateaddition 英萍 ),ZhangSiliang ( 张嗣良 ).Studyonoptimizationof guanosinefermentation. 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵狔 ( 微生物学通报 ), 2002,29 (5):65 69 [7] Huang Mingzhi( 黄明志 ),CaiXianpeng ( 蔡显鹏 ),Chen Shuangxi( 陈双喜 ),ChuJu( 储炬 ),ZhuangYingping( 庄

7 第 9 期陈双喜等 : 柠檬酸钠对肌苷发酵过程代谢流分布的调节 1737 英萍 ), Zhang Siliang ( 张嗣良 ). Quantitation and optimizationofguanosinefermentationprocess:prevention of NH 4 + accumulationincreases guanosine production by 70%. 犆犺犻狀犲狊犲犑狅狌狉狀犪犾狅犳犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔 ( 生物工程学报 ), 2003,19 (2): [8] SauerU,CameronD C,BaileyJE. Metaboliccapacityof 犅犪犮犻犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊 fortheproductionofpurinenucleosides, riboflavin,andfolicacid. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅犲狀犵.,1998,59 (2): [9] GoelA,LeeJ,Domach M M,Ataai M M. Metabolic fluxes,poolandenzyme measurementssuggestatighter couplingofenergeticsandbiosyntheticreactionsassociated withreducedpyruvatekinaseflux. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅犲狀犵., 1999,64 (2): [10] Majewski R A, Domach M M. Simple constrained optimizationviewofacetateoverflowin 犈. 犮狅犾犻. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅犲狀犵.,1990,35 (7): 櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭信息与交流国家高新区成为最具潜力创新区域国家高新技术产业开发区工作会议在盘点业绩时, 一组数据给人留下深刻的印象 :53 个国家高新区以不到全国万分之一的土地, 创造了占全国 4% 以上的 GDP 年, 国家高新区平均每平方公里土地实现工业产值 31.9 亿元, 实现工业增加值 7.8 亿元, 出口创汇 1.2 亿美元, 远远高于全国平均水平国家高新区集聚大量的科技创新资源, 已成为我国最具潜力的创新区域 2004 年, 国家高新区企业研发经费达到 614 亿元, 占全国全部研发经费的 33% 全国 21 个国家级留学人员创业园, 有 18 个落在了国家高新区大批高新技术企业聚集的国家高新区, 已成为转变经济增长方式的主力军高新区培育和扶持了一大批拥有自主知识产权的高科技企业, 促进了一大批具有国内外领先水平和自主知识产权的高新技术成果转化为现实生产力通过大力实施国际化战略, 一些国家高新区在美国英国俄罗斯新加坡奥地利等国家建立了海外科技园, 在重点领域开展与国际接轨的尖端技术开发, 初步构筑起国际化的高新技术产业化服务体系

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