456 王旭辉, 等 DAPT 对食管鳞癌细胞株增殖与凋亡影响机制探讨 was(8.4±.60)% and (0.±5.90)%,whichwassignificantlyhigherthantheapoptosisrateofEca09andTE incontrolgroupthatwas(0.4

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1 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No 前沿报道 / 论著 犇犃犘犜对食管鳞癌细胞株增殖与凋亡影响机制探讨 王旭辉, 花盛浩 王慧 王文红 刘强 陈艳 尤海燕 焦志军. 江苏大学附属医院检验科 镇江市医学免疫学重点实验室, 江苏镇江 00. 湖南省湘乡市人民医院检验科, 湖南湘乡 4400 摘要 目的 : 观察 γ 分泌酶抑制剂 DAPT 阻断 Notch 信号通路对食管鳞状细胞癌细胞株增殖和凋亡的影响, 并初步探讨其作用机制 方法 : 采用 γ 分泌酶抑制剂 DAPT 处理培养的食管鳞癌 Eca09 和 TE 细胞株以阻断 Notch 信号, 分别应用 CCK 8 试剂和流式细胞术检测两种食管鳞癌细胞株的增殖与凋亡情况 ; 同时采用定量 PCR 检测细胞 Notch 受体及靶基因 Hes mrna 的表达, 蛋白质印迹法检测与细胞增殖 凋亡相关蛋白 CyclinD 和 Bcl 的表达 结果 : DAPT 处理明显抑制了食管鳞癌 Eca09 和 TE 细胞株增殖,5μmol/LDAPT 处理 Eca09 细胞株 7h TE 细胞株 96h 后增殖抑制率分别为 (6.8±5.3)% 和 (59.8±.9)%, 与 DMSO 对照组 (7.±.6)% 和 (7.0±.)% 相比差异有统计学意义, 犘 =0.000 和犘 <0.000, 且抑制作用呈时间和浓度依赖关系 DAPT 可诱导 Eca09 和 TE 细胞株凋亡,5μmol/LDAPT 处理组 Eca09 细胞凋亡率在 4 和 48h 分别为 (8.4±.60)% 和 (.77±5.8)%, 与相应对照组 (0.49±.7)% 和 (9.74±3.38)% 相比凋亡率增加, 差异有统计学意义, 犘值分别为 和 ; 处理组 TE 细胞凋亡率在 4 和 48h 分别为 (0.±5.90)% 和 (3.4±5.9)%, 与相应对照组 (8.00±.84)% 和 (.59± 3.7)% 相比凋亡率增加, 差异有统计学意义, 犘值分别为 0.03 和 DAPT 处理下调两种细胞株 Notch 受体 Notch 信号靶基因 Hes 及 CyclinD 的表达水平 DAPT 处理可上调 Eca09 细胞 Bcl 水平, 但下调了 TE 细胞中 Bcl 水平 结论 :γ 分泌酶抑制剂 DAPT 可抑制食管鳞癌细胞株增殖并促进其凋亡, 其机制可能与 DAPT 阻断 Notch 信号活化 调控 CyclinD 和 Bcl 的表达有关, 阻断 Notch 信号通路有望成为食管鳞状细胞癌治疗的新靶点 关键词 食管肿瘤 ;DAPT; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 ;Notch; 信号传导 ; 印迹法, 蛋白质 犈犳犲犮狋狊狅犳 γ 狊犲犮狉犲狋犪狊犲犻狀犺犻犫犻狋狅狉犇犃犘犜狅狀狋犺犲狆狉狅犾犻犳犲狉犪狋犻狅狀犪狀犱犪狆狅狆狋狅狊犻狊狅犳犲狊狅狆犺犪犵犲犪犾犮犲犾犾犻狀犲狊 中华肿瘤防治杂志,03,0(9): , 犠犃犖犌犡狌 犺狌犻, 犎犝犃犛犺犲狀犵 犺犪狅, 犠犃犖犌犎狌犻, 犠犃犖犌犠犲狀 犺狅狀犵, 犔犐犝犙犻犪狀犵, 犆犎犈犖犢犪狀, 犢犗犝犎犪犻 狔犪狀, 犑犐犃犗犣犺犻 犼狌狀. 犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犕犲犱犻犮犪犾犐犿犿狌狀狅犾狅犵狔狅犳犣犺犲狀犼犻犪狀犵, 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犑犻犪狀犵狊狌犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犣犺犲狀犼犻犪狀犵 00, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲, 犘犲狅狆犾犲 狊犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犡犻犪狀犵狓犻犪狀犵, 犡犻犪狀犵狓犻犪狀犵 4400, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToinvestigatetheefectofinhibitingNotchsignalingpathwayontheproliferationandap optosisofesophagealcancercellinesthroughdapt. 犕犈犜犎犗犇犛 :γ secretaseinhibitordaptwasadministratedtoblock NotchsignalingpathwayinculturedesophagealcancercellineEca09andTE.Theproliferationandapoptosisofboth esophagealcancercellinesweredetectedbycck8andflowcytometry (FCM),respectively.Real timepolymerasechain reaction (PCR)wasperformedtoassessmRNAexpressionofNotchreceptorsandNotchtargetgeneHes.Inaddition, cyclindandbcl proteinweredetectedby Westernblot. 犚犈犛犝犔犜犛 :TheproliferationofEca09andTE wassignifi cantlyinhibitedbydaptinatime dependentanddose dependentmanner.underthetreatmentwith5μmol/ldapt,the inhibitoryratioofeca09for7hwas(6.8±5.3)% andtheinhibitoryratioofte for96hwas(59.8±.9)%,while incontrolgrouptheinhibitoryratiowas(7.±.6)% and (7.0±.)% ( 犘 =0.000and 犘 <0.000),respectively. DAPTinducedtheapoptosisofEca09and TE.TheapoptosisrateofEca09and TE intreatmentgroupat4h 基金项目 国家自然科学基金 (8787) 第一作者简介 王旭辉, 男, 湖南湘乡人, 硕士, 主管检验师, 主要从事医学免疫学的临床与基础研究工作 Tel: E mail:ncclwang448@63.com 通讯作者简介 焦志军, 男, 江苏如皋人, 博士, 副教授, 硕士生导师, 主要从事医学免疫学临床与基础的研究工作 Tel: E mail:jiaozhijun@yahoo.com.cn

2 456 王旭辉, 等 DAPT 对食管鳞癌细胞株增殖与凋亡影响机制探讨 was(8.4±.60)% and (0.±5.90)%,whichwassignificantlyhigherthantheapoptosisrateofEca09andTE incontrolgroupthatwas(0.49±.7)% ( 犘 =0.078)and (8.00±.84)% ( 犘 =0.03).At48h,theapoptosisof Eca09andTE intreatmentgroupwere(.77±5.8)% and(3.4±5.9)% alsosignificantlyincreasedthanthatin controlgroupwhichwas(9.74±3.38)% ( 犘 =0.0364)and (.59±3.7)% ( 犘 =0.0084).ExpressionofNotch, HesandCyclinD wasdown regulatedbydapttreatment.additionaly,daptpromotedtheexpressionofbcl in Eca09.TheexpressionofBcl inte wasinhibitedbydapttreatment. 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖犛 :γ secretaseinhibitordapt caninhibittheproliferationandinducetheapoptosisofesophagealsquamouscarcinomacellinesanditsmechanismsmay involveinhibitingnotchsignalingandregulatingtheexpressionofcyclindandbcl.blockageofnotchsignalingpath waymayoferanewstrategyforthetreatmentofesophagealsquamouscelcarcinoma. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] esophageal;dapt;proliferation;apoptosis;notch;signaltransduction;bloting,western 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R735. 文献标识码 A 文章编号 (03) Notch 作为进化过程中高度保守介导细胞间相互作用的信号通路, 在决定细胞命运中发挥着重要作用, 近年来研究发现,Notch 信号活性变化与消化道肿瘤的 [] 发生 发展也有密切的关系 食管癌在我国是一种高发性的恶性肿瘤, 但其发病原因至今仍不完全清楚 已有文献报道, 在食管癌发病过程中存在 Notch 信号通路 [ 3] 异常改变 本研究采用 γ 分泌酶抑制剂 DAPT 阻断食管鳞癌细胞株的 Notch 信号通路, 观察对细胞增殖和凋亡的影响并初步探讨其机制, 以期为食管鳞癌的靶向治疗提供实验依据 材料与方法. 材料食管鳞状细胞癌细胞系 Eca09 和 TE 购自中国科学院上海典型培养物保藏委员会细胞库 ;RP MI640 培养液购自美国 Gibco 公司 ; 优级胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司 ;CelCountingKit 8 (CCK 8) 购自碧云天公司 ;Trizol 购自美国 Invitro gen 公司 ; 胰蛋白酶购自美国 Sigma 公司 ; 逆转录和 PCR 试剂盒购自大连 TaKaRa 公司 ;FITC Annexin Ⅴ 凋亡检测试剂盒购自 BD 美国公司 ;Bcl Cyclin D 及相应二抗均来自美国 SantaCruz 公司. 方法.. 细胞培养人食管鳞状细胞癌细胞 Eca09 和 TE 培养于含 0% 胎牛血清的 RPMI640 培养基, 并添加 00U/mL 青霉素钠 00U/mL 硫酸链霉素, 于 37 5% CO 饱和湿度条件下培养, 每 3d 更换培养液 次 将对数生长期细胞用含 0.05%EDTA 的 0.5% 胰酶消化液消化后用于相应实验.. 细胞增殖按照 CCK 8 试剂盒说明书进行 经胰酶消化的细胞制成单个悬液并按 0 4 细胞 / 00μL3 复孔接种至 96 孔板, 贴壁 4h 后更换新鲜培养液, 加终浓度为 5 和 0μmol/L 的 DAPT, 再分别培养 和 0h 后弃培养上清, 加含 0% CCK 8 试剂的新鲜无血清 RPMI640 培养液 00μL,37 孵育 h; 吸移上清至新的 96 孔平底比色板, 于 450nm 波长酶标仪读吸光度, 计算细胞增殖抑制率, 描绘细胞增殖曲线 细胞增殖抑制率 (%)= 对照孔吸光度值 - 待测孔吸光度值对照孔吸光度值 00%..3 RT PCR 采用 TrizolReagent 提取各组细胞总 RNA, 按照反转录试剂盒说明进行 cdna 逆转录 ; 采用 SYBRPremixExTaq TM 试剂盒以 cdna 为模板进行实时荧光定量 PCR 扩增反应, 总反应体系为 0μL, 按试剂盒说明书操作 引物 Notch~4 Hes 和 β actin 均由上海生工生物工程公司合成, 以 β actin 为内参相对定量 mrna 的表达水平 [4]..4 蛋白质印迹法对照组或 DAPT 刺激培养的 Eca09 和 TE 细胞经冷 PBS 洗涤 RIPA(Sigma) 细胞裂解液 4 裂解细胞 30min 后,000r/min 离心 0min (r=9.5cm) 吸取上清测定蛋白浓度 取 50μg 总蛋白经 Bio Rad 电泳仪 SDS PAGE 分离后, 电转至 PVDF 膜 在含 5% 脱脂奶粉的 TBS 封闭 h 后, 分别加一抗 ( 鼠抗人 Bcl 单克隆抗体 兔抗人 CyclinD 多克隆抗体, 抗体工作液 000 稀释 )4 孵育过夜 TBS T 洗膜 3 次, 每次 5min, 加入相应来源 HRP 标记的 IgG( 5000 稀释 ) 37 孵育 h 经 SuperSignal 化学发光底物显色成像, 以 β actin 为内参, 应用 QuantityOne 软件分析结果..5 细胞凋亡检测根据 Annexin Ⅴ FITC 细胞凋亡说明书, 分别收集对照组和 DAPT 刺激 0 4 及 48h 培养后的细胞, 预冷 PBS 洗涤后 500r/min 离心 5min(r=cm) 去上清 ; 用 BindingBufer 按 0 6 L - 的密度重悬细胞, 取 00μL 细胞置于流式管中, 加入 Annexin Ⅴ FITC 和碘化丙啶 (PI) 各 5μL, 混匀避光孵育 5min 后流式细胞仪检测 0 4 个细胞 CelQuest 软件分析, 右下象限 Annexin Ⅴ 单阳性细胞为早期凋亡细胞, 右上象限 Annexin Ⅴ 和 PI 双阳性细胞为晚期凋亡或坏死细胞, 计算右下和右上

3 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No.9 46 犖犇犚犌 狊犻犚犖犃对宫颈癌犎犲犾犪细胞顺铂化疗敏感性影响的研究 杨乐, 张健 刘军叶. 西安市中心医院肿瘤科, 陕西西安 第四军医大学 ( 放射医学教研室 : 刘军叶 ; 生物化学与分子生物学教研室 : 杨乐, 张健, 刘军叶 ), 陕西西安 7003 前沿报道 / 论著 摘要 目的 : 探讨人源 N myc 下游调节基因 (N Mycdownstream regulatedgene,ndrg) 小干扰 RNA(smalin terferingrna,sirna) 对宫颈癌 Hela 细胞的化疗增敏作用 方法 : 利用化学合成的针对 NDRG 特异性 sirna 借助脂质体转染宫颈癌 Hela 细胞 采用 RT PCR 和蛋白质印迹法检测 NDRG mrna 和蛋白在宫颈癌 Hela 细胞的表达情况 通过 MTT 法检测该细胞在顺铂作用下的体外存活率 结果 : 化学合成的 NDRG 特异性 sirnaoligomer 可使 He la 细胞的 NDRG 表达水平明显降低, 增强了顺铂对 Hela 细胞体外生存的抑制能力 转染 Negative controloligomer 的 Hela 细胞与转染 NDRGsiRNA oligomer HSS669 的 Hela 细胞相比, 其存活情况出现明显差异,IC50 值分别为 (6.69±0.33) 和 (.69±0.5) μ g/l, 差异有统计学意义, 狋 =7.3, 犘 =0.003 结论: 抑制 NDRG 表达可以提高宫颈癌 Hela 细胞对顺铂的化疗敏感性, 具有一定的临床应用前景 关键词 宫颈肿瘤 ;NDRG;RNA 干扰 ; 药物耐受性 ; 顺铂 ;Hela 细胞 ; 印迹法, 蛋白质 EfectofNDRGsiRNAsensitivityofcervicalcancerHelacelstocisplatin, 犢犃犖犌犔犲, 犣犎犃犖犌犑犻犪狀, 犔犐犝犑狌狀 狔犲. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗狀犮狅犾狅犵狔, 犡犻 犪狀犆犲狀狋狉犪犾犎狅狊狆犻狋犪犾, 犡犻 犪狀 70003, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犉狅狌狉狋犺犕犻犾犻狋犪狉狔犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犡犻 犪狀 7003, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 中华肿瘤防治杂志,03,0(9): [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToexploretheefectsofsmalinterferingRNA (sirna)specifictondrgonchemosen sitivitytocisplatinofcervicalcancerhelacels. 犕犈犜犎犗犇犛 :ThesiRNAspecificforNDRGwassynthesizedandtrans fectedintocervicalcancer Helacelsbylipofectamine.NDRGexpressionin Helacels wasdetectedby RT PCRand Westernblot.MTTassaywasusedtodeterminetheinhibitoryefectsofcisplatincombinedwithNDRGspecificsiRNA 犻狀狏犻狋狉狅. 犚犈犛犝犔犜犛 :RT PCRand WesternblotanalysisdemonstratedthatHelacelstransfectedwiththeNDRGsiRNA oligomersignificantlyreducedndrgtranscriptandproteinlevels.itincreasedtheinhibitoryefectsofcisplatintohela celsviability 犻狀狏犻狋狉狅.TheIC50forcisplatininHela negativecontrolcelswas(6.69±0.33) μ g L - butwasdecreased almost4 foldto(.69±0.5) μ g L - in Hela NDRG HSS669siRNAcels.Statisticalanalysisshowedthedifer enceoftheic50valuesbetweenthetwogroupstobehighlysignificant(t=7.3, 犘 =0.003). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :Down regulationofndrgresultsinincreasedsensitivitytocisplatinincervicalcancerhelacelsandcanbeusedasapowerful adjuncttoconventionalchemotherapy. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] cervicalneoplasms;ndrg;rnainterference;drugtolerance;cisplatin;helacels;bloting,western 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R 文献标识码 A 文章编号 (03) 基金项目 国家自然科学基金 (306006;87490); 西安市卫生局 0 年度科研计划 (J003) 第一作者简介 杨乐, 男, 陕西西安人, 硕士, 主治医师, 主要从事实体肿瘤内科综合治疗的研究工作 E mail:leyang79@gmail.com 通讯作者简介 刘军叶, 女, 陕西西安人, 博士, 副教授, 主要从事肿瘤生物学的研究工作 E mail:junyeliu@fmmu.edu.cn 宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一, 发病率位于女性肿瘤第 位, 占女性恶性肿瘤 >50%, 严重威胁 [] 女性健康 作为中晚期宫颈癌治疗的常规标准, 放 [] 疗与含铂方案的化疗已广泛应用于临床 由于具有辐射抗性及化疗耐药的宫颈癌细胞的存在, 目前宫颈癌的综合疗效仍然受限 因而, 宫颈癌的分子生物学和肿瘤相关基因治疗的研究逐渐受到人们的重视 人源 N myc 下游调节基因 (N Mycdownstream regu

4 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No 高危型犎犘犞感染者负性生活事件暴露与宫颈癌发生相关性分析 袁林徐又先 陈静覃莹莹陈广莉 流行病学研究 / 论著 柳州市人民医院 ( 肝胆外科 : 袁林 ; 妇科 : 徐又先, 陈静, 覃莹莹, 陈广莉 ), 广西柳州 摘要 目的 : 研究高危型人乳头状瘤病毒 (highriskhumanpapilomavirus,hr HPV) 感染者负性生活事件暴露与宫颈癌的相关性 方法 : 对 60 例感染 HR HPV 的宫颈癌患者进行 5 年回顾性研究, 并选取同时期 HR HPV 感染且未患宫颈病变者相应病例的年龄 性别 民族和学历配对的人群为对照组 采用 Logistic 回归分析探讨一般行为因素 饮食及心理因素等对 HR HPV 感染的影响 结果 : 宫颈癌患者血清锌 硒水平分别为 (0.79±0.63) 和 (0.079± 0.035)mg/mL, 均低于对照组的 (.09±0.) 和 (0.08±0.03)mg/mL, 差异有统计学意义, 狋值分别为 和 8.53, 犘值分别为 和 0.00 蛋白质摄入量 蔬果类摄入量高与 HR HPV 相关的宫颈癌呈密切负相关, 并有明显剂量效应关系 服避孕药 首次性交年龄 多个性伴侣与 HR HPV 相关的宫颈癌无关,~0 年有负性生活事件与 HR HPV 相关的宫颈癌相关 结论 : 低硒 低锌 长期蛋白质及蔬菜水果摄入量低 ~0 年有明显的负性生活事件与高危型 HPV 感染的致癌性有协同作用 关键词 宫颈肿瘤 ; 人乳头状瘤病毒 ; 负性生活事件 ; 回顾性研究 犚犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀狀犲犵犪狋犻狏犲犾犻犳犲犲狏犲狀狋狊犲狓狆狅狊狌狉犲犪狀犱犻狀犮犻犱犲狀犮犲狅犳犮犲狉狏犻犮犪犾犮犪狉犮犻狀狅犿犪犪犿狅狀犵犎犘犞犻狀犳犲犮狋犻狅狀 犢犝犃犖犔犻狀, 犡犝犢狅狌 狓犻犪狀, 犆犎犈犖犑犻狀犵, 犙犐犖犢犻狀犵 狔犻狀犵, 犆犎犈犖犌狌犪狀犵 犾犻犘犲狅狆犾犲 狊犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犔犻狌狕犺狅狌, 犔犻狌狕犺狅狌 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 中华肿瘤防治杂志,03,0(9): [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Tostudytherelationshipbetweennegativelifeeventsexpoureandcervicalcarcinomaamong highriskhumanpapilomavirus(hr HPV). 犕犈犜犎犗犇犛 :A5 yearretrospectivestudywascarriedoutinacohortof60 cervicalcarcinomawithhr HPVinfection,atthesametime: matched (age,gender,ethnic,education)60participants ofhr HPV withoutcervicallesion wereselected.logisticregressionanalysiswasusedtoexploretheassociationsbe tweenbehaviors,diethabitspsychologicalfactorsand HR HPV. 犚犈犛犝犔犜犛 :Serum ZnandSelevelsweresignificantly lowerinpatientswithcervicalcancer[(0.79±0.63)and(0.079±0.035)mg/ml]thanincontrolsubjects[(.09± 0.)and (0.08±0.03)mg/mL].Inthestudycases,themeanofseleniumandzincweresignificantlylowerthan thoseofcontrols( 狋 =6.094, 犘 =0.004; 狋 =8.53, 犘 =0.00).Aclosenegativecorrelationwasfoundbetweentheamount ofproteinandfruitthinningintakewiththeriskofcervicalcarcinomaamonghr HPV,andtherewasdoseresponserela tionship.therewerenorelationshipsbetweenhr HPVandusingcontraceptives,ageatfirstsexualintercourse,multiple sexualpartners,butitrelatedtoonetotenyearspsychictrauma. 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :Therewasasynergicintractionbetween HR HPVinfectionandlowselenium,lowzinc,lowproteinandfruitthinningintakesinalongterm,onetotenyearspsy chictrauma. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] cervicalneoplasms;humanpapilomavirus;negativelifeevents;retrospectivestudy 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R 文献标识码 A 文章编号 (03) 在本研究中与第一作者贡献相同 基金项目 国家自然科学基金 (860446); 广西科技厅青年科学基金 ( 桂科青 0999) 第一作者简介 袁林, 男, 湖北大冶人, 硕士, 副主任医师, 主要从事恶性肿瘤免疫学的研究工作 Tel: E mail:yuanl35@sina.com 通讯作者简介 徐又先, 女, 湖北武汉人, 博士, 副主任医师, 副教授, 硕士生导师, 主要从事宫颈肿瘤防治的研究工作 Tel: E mail:xyx47@sina.com

5 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No 鲁北地区子宫内膜癌发病因素病例对照研究 姜娜 贾改珍 孙红卫 张磊磊 刘书敏 张英姿. 滨州医学院附属医院妇产科, 山东滨州 滨州医学院统计与流行病学教研室, 山东滨州 流行病学研究 / 论著 摘要 目的 : 了解子宫内膜癌发病情况及相关因素, 为临床进行预防及治疗提供依据 方法 : 采用病例 对照流行病学分析方法, 对鲁北地区 6 所三级医院 病理确诊的 89 例子宫内膜癌患者及 74 例对照进行统一问卷调查 ; 采用单因素和多因素的 Logistic 回归分析, 以 OR 和 95% 可信区间为评价指标, 分析与子宫内膜癌有关联的危险性因素 结果 : 鲁北地区子宫内膜癌患者 89 例, 其中子宫内膜样腺癌 59 例 (90%); 非子宫内膜样腺癌 ( 浆液性腺癌, 透明细胞癌等 )30 例 (0%) Ⅰ 期患者 9 例 (76%),Ⅱ 期患者 9 例 (0%),Ⅲ~Ⅳ 期患者共 4 例 (4%) 子宫内膜癌的发病年龄为 5~78 岁, 平均发病年龄为 55.4 岁,58~6 岁为发病高峰 已绝经妇女占 6% 单因素分析结果表明, 高血压 (OR=3.67, χ =33.70, 犘 =0.00) 糖尿病 (OR=.9, χ =4.3, 犘 =0.04) 肥胖 (OR =4.63, χ =50.6, 犘 =0.00) 饮用茉莉花茶史 (OR =.63, χ =9.84, 犘 =0.00) 重体力劳动 (OR =.8, χ =9.8, 犘 =0.00) 月经不规律 (OR=.68, χ =07.0, 犘 =0.00) 口服中草药调经 (OR=5., χ =68.8, 犘 =0.00) 绝经年龄 (OR =.0, χ =.56, 犘 =0.00) 未产 (OR=9.07, χ =5.84, 犘 =0.00) 和一级亲属恶性肿瘤家族史 (OR=.9, χ =., 犘 =0.00) 等可增加子宫内膜癌发病风险 ; 使用宫内节育器 (intrauterinedevice,iud) 可降低子宫内膜癌发病风险,OR=0.9, χ = 37., 犘 =0.00 多因素 Logistic 回归分析结果表明, 高血压 (OR=3.69,95%CI:.89~7.) 肥胖 (OR=3.06, 95%CI:.6~5.75) 月经不规律 (OR=4.53,95%CI:.3~9.60) 口服中草药调经 (OR=9.3,95%CI:.9~ 9.76) 绝经年龄晚 (OR=.3,95%CI:.06~.0) 和一级亲属恶性肿瘤家族史 (OR=5.0,95%CI:.3~.73) 是内膜癌发病的危险因素 ; 使用 IUD 是内膜癌的保护性因素,OR=0.84,95%CI:0.79~0.88 结论: 高血压 肥胖和绝经年龄等因素可影响子宫内膜癌的发生, 应针对相关危险因素采取相应的预防措施 关键词 子宫内膜肿瘤 / 流行病学 ; 病例对照研究 ; 危险因素 ; 保护因素 中华肿瘤防治杂志,03,0(9): 犆犪狊犲 犮狅狀狋狉狅犾狊狋狌犱狔狅狀狉犻狊犽犳犪犮狋狅狉狊狅犳犲狀犱狅犿犲狋狉犻犪犾犮犪狀犮犲狉犻狀狀狅狉狋犺犲狉狀犛犺犪狀犱狅狀犵犪狉犲犪 犑犐犃犖犌犖犪, 犑犐犃犌犪犻 狕犺犲狀, 犛犝犖犎狅狀犵 狑犲犻, 犣犎犃犖犌犔犲犻 犾犲犻, 犔犐犝犛犺狌 犿犻狀, 犣犎犃犖犌犢犻狀犵 狕犻. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗犫狊狋犲狋狉犻犮狊犪狀犱犌狔狀犲犮狅犾狅犵狔, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犅犻狀狕犺狅狌犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犅犻狀狕犺狅狌 56600, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犚犲狊犲犪狉犮犺犛犲犮狋犻狅狀狅犳犛狋犪狋犻狊狋犻犮狊犪狀犱犈狆犻犱犲犿犻狅犾狅犵狔狅犳犅犻狀狕犺狅狌犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犅犻狀狕犺狅狌 56600, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Toexplorethemorbidityandrelevantfactorsofendometrialcancer,andtoprovideevidence forclinicpreventionandtreatment. 犕犈犜犎犗犇犛 :Thedataof89endometrialcarcinomaspathologicalydiagnosedinsix hospitalsinnorthernshandongareabetween and0 0 0andacontrolgroupof74healthypeoplewere analyzeduniformlywithacasecontrol studybasedonaepidemiologicalsurvey.weanalyzedthedatausingsinglefactora nalysisandmultivariateregressionanalysiswithorand95% confidenceintervalasevaluationindextolearntheriskfac torsassociatedwithendometrialcancer. 犚犈犛犝犔犜犛 :ThenumberofendometrialcancerinnorthernShandongareawas89. Thenumberofendometrioidcancerwas59(90%),andthenumberofnon endometrioidcancerwas30(0%).thenum berofpatientswithstageⅠ was9(76%),thenumberofpatientswithstageⅡ was9(0%),thenumberofpatients withstageⅢ and Ⅳ was4(4%).theageofthepatientsrangedfrom5to78withthemeanof55.4,andthepeak onsetagewas58to6.thenumberofpostmenopausalwomenaccountedfor6%.thesinglefactoranalysisshowedthat hypertension(or =3.67, χ = 33.70, 犘 =0.00),diabetesmelitus(OR=.9, χ =4.3, 犘 =0.04),obesity(OR=4.63, χ =50.6, 犘 =0.00),takingjasminetea(OR=.63,=9.84, 犘 =0.00),heavyphysicallabour(OR=.8, χ =9.8, 犘 =0.00),irregularmenstruation(OR=.68, χ =07.0, 犘 =0.00),takingChineseherbalmedicine (OR=5., 第一作者简介 姜娜, 女, 山东烟台人, 硕士, 主要从事妇科肿瘤的临床研究工作 E mail:jiangna-00@63.com 通讯作者简介 张英姿, 女, 山东烟台人, 硕士, 教授, 硕士生导师, 主要从事妇科肿瘤的临床研究工作 E mail:zhangyingzihelo@63.com

6 470 姜娜, 等鲁北地区子宫内膜癌发病因素病例对照研究 χ =68.8, 犘 =0.00),ageofmenopause(OR=.0, χ =.56, 犘 =0.00),nulipara(OR=9.07, χ =5.84, 犘 = 0.00),familyhistoryofcancer(OR=.9, χ =., 犘 =0.00)couldincreasetheriskofendometrialcancer;andtheu singofintra uterinedevicecouldreducetheriskofendometrialcancer(or=0.9, χ =37., 犘 =0.00).Multiplefactors regressionanalysisshowedthattheor (95%CI)ofhypertension,obesity,irregularmenstruation,takingChineseherbal medicineforirregularmenstruation,ageofmenopause,familyhistoryofcancerwere3.69(.89-7.),3.06( ),4.53( ),9.3( ),.3(.06-.0),5.0(.3-.73)respectively.theor (95%CI) ofintra uterinedevicewas0.84( )andintra uterinedevicewastheprotectivefactorofendometrialcancer. 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :Factorssuchashypertension,obesity,ageofmenopausemaybetheinfluencefactorsonendomtialcancer andearlypreventiveproceduresshouldbetaken. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] endometrialneoplasms/epidemiology;case controlstudy;riskfactor;protectivefactor 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R 文献标识码 A 文章编号 (03) 近年来, 世界范围内子宫内膜癌的发病率均有上 [ ] 升, 并且具有年轻化趋势 但是子宫内膜癌的病因仍不十分清楚 因此, 了解子宫内膜癌发病的相关因素具有重要意义 本研究通过对鲁北地区女性流行病问卷调查, 了解子宫内膜癌发病情况及相关因素, 为临床早期诊断及早期治疗提供依据 对象与方法. 研究对象 收集鲁北地区 6 所三级及以上医院 ( 滨州医学院附属医院 滨州市人民医院 滨州市第二人民医院 东营市人民医院 东营市胜利油田医院和德州市人民医院 ) 手术治疗 且临床病理资料完整的子宫内膜癌患者共 30 例, 其中死亡 例, 给予剔除, 纳入统计的子宫内膜癌患者为 89 例 其中, 滨州医学院附属医院 90 例, 滨州市人民医院 60 例, 滨州市第二人民医院 0 例, 东营市人民医院 50 例, 东营市胜利油田医院 6 例, 德州市人民医院 53 例 取年龄相差 <5 岁 居住同一地区 相同职业 排除子宫肌瘤及其他恶性肿瘤的健康女性共 74 名作为对照组进行统计. 研究方法 调查时间 调查方法采用回顾性分析 建立问卷调查表和面对面访问患者及对照组 调查内容包括 :) 一般情况 : 年龄 身高 体质量 职业 文化程度 经济状况 居住环境和体力劳动程度等 ;) 生活习惯 : 饮茶史 吸烟和被动吸烟及饮酒史等 ;3) 月经婚育史 : 月经初潮年龄 绝经年龄 月经情况 分娩及流产次数 累计哺乳时间以及避孕措施等 ; 4) 既往史和家族史 对照组要求行彩超 妇科检查 宫颈涂片 ( 或活检 ) 以及诊断性刮宫等检查, 除外妇科恶性肿瘤, 对怀疑有恶性肿瘤者予以剔除.3 统计学方法 全部问卷经整理核对并录入 EXCEL003, 采用 单因素 ( 狋检验 χ 检验 ) 和多因素的 Logistic 回归分 析, 以 OR 和 95% 可信区间为评价指标,SPSS3.0 统计软件进行分析 检验水准 α=0.05 结果. 病例组与对照组的均衡性检验两组的均衡性检验见表 病例组年龄(55.4± 6.35) 岁, 对照组年龄 (55.03±5.864) 岁 经狋检验, 两组年龄差异无统计学意义, 犘 =0.5 表 89 例子宫内膜癌患者与 74 名对照组均衡性检验结果 ( 狀 ) 因素 对照组 病例组 χ 值 犘值 年龄 ( 岁 ) ~ ~ 职业 农民 非农民 居住地农村 08 5 城市 病例组的一般情况病例组的病理诊断分布包括子宫内膜样腺癌 59 例 (90%), 非子宫内膜样腺癌 ( 包括浆液性腺癌 透明细胞癌和鳞腺癌等 )30 例 (0%) 按照 988 年 FIGO 标准,Ⅰ 期 9 例 (76%),Ⅱ 期 9 例 (0%),Ⅲ~Ⅳ 期 4 例 (4%) 不规则阴道流血为主要临床表现.3 单因素分析变量定义如下, 子宫内膜癌患者中肥胖 :BMI<8 =0,BMI 8=; 高血压 : 否 =0, 是 =; 糖尿病 : 否 =0, 是 =; 从事重体力劳动 ( 指除了从事一般家务还从事大量农田等体力劳动 ): 否 =0, 是 =; 饮用茉莉花茶史 : 累计时间 <3 年 =0, 累计时间 3 年 =; 月经不规律 ( 既

7 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No 实验研究 / 论著 右丙亚胺对表柔比星诱导大鼠心肌损伤干预机制研究 吴晖 欧阳取长 李晶 肖华伍 黄小平. 湖南省肿瘤医院 中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院乳腺内科, 湖南长沙 湖南中医药大学生理教研室, 湖南长沙 4008 摘要 目的 : 比较不同剂量右丙亚胺对表柔比星诱导大鼠心肌损伤的干预作用及可能机制 方法 :35 只 SD 大鼠随机分 5 组, 每组 7 只 对照组 : 于大鼠双侧腹腔分别注射生理盐水 5mL/kg, 间隔时间为 30min, 隔日 次, 共 4 次 (7d); 模型组 ( 表柔比星 + 生理盐水 ): 大鼠腹腔内注射表柔比星 4.5 mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d), 注射表柔比星前 30 min 于另一区域腹腔内注射生理盐水 5mL/kg; 表柔比星 + 低 中 高剂量右丙亚胺组 : 大鼠腹腔内注射表柔比星 4.5mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d), 注射表柔比星前 30min 于另一区域腹腔内注射右丙亚胺 和 90mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d) 处死大鼠后检测各组大鼠心肌组织微量丙二醛(MDA) 含量 总超氧化物歧化酶 (T SOD) 活性 血浆乳酸脱氢酶 (LDH) 及肌钙蛋白 I(cTnI) 水平, 观察心肌组织病理形态学改变及心肌细胞凋亡情况 结果 : 模型组较对照组 SOD 活性降低, 分别为 (75.0±5.4) 和 (0.8±3.)U/mL, 犉 =5.7, 犘 =0.00;MDA 含量升高, 分别为 (3.60±.88) 和 (5.8±3.4)nmol/mg, 犉 =7.3, 犘 =0.00; 血浆 LDH 升高, 分别为 (5.7±0.58) 0 3 和 (.3±0.47) 0 3 U/L, 犉 =3.7, 犘 =0.00;cTnI 升高, 分别为 (483.38±5.07) 和 (64.6±5.07) ρ g/ml, 犉 =0.3, 犘 =0.00; 心肌细胞病理评分升高, 分别为.70±0.0 和 0, 犉 =8.65, 犘 =0.00; 凋亡指数明显升高, 分别为 (66.54±3.46)% 和 (.55±0.74)%, 犉 =6.86, 犘 =0.00 而加用右丙亚胺各组均较模型组提高 SOD 活性, 降低 MDA 血浆 LDH 及 ctni 含量, 减少心肌病理评分及心肌细胞凋亡指数, 犘 <0.0 或犘 <0.05 结论: 右丙亚胺对表柔比星诱导的大鼠心肌损伤有保护作用, 其机制可能与减少氧自由基的产生 降低脂质过氧化物含量以及调节心肌细胞凋亡机制有关 关键词 表柔比星 ; 右丙亚胺 ; 心脏毒性 ; 细胞凋亡 ; 大鼠 中华肿瘤防治杂志,03,0(9): 犉狌狀犮狋犻狅狀犪狀犱犿犲犮犺犪狀犻狊犿狅犳犱犲狓狉犪狕狅狓犪狀犲犻狀狋犲狉狏犲狀狋犻狀犵犿狔狅犮犪狉犱犻犪犾犱犪犿犪犵犲犻狀犱狌犮犲犱犫狔犲狆犻狉狌犫犻犮犻狀犻狀狉犪狋狊 犠犝犎狌犻, 犗犝犢犃犖犌犙狌 犮犺犪狀犵, 犔犐犑犻狀犵, 犡犐犃犗犎狌犪 狑狌, 犎犝犃犖犌犡犻犪狅 狆犻狀犵. 犅狉犲犪狊狋犆犪狀犮犲狉犜狉犲犪狋犿犲狀狋犆犲狀狋狉犲, 犎狌狀犪狀犘狉狅狏犻狀犮犻犪犾犜狌犿狅狉犎狅狊狆犻狋犪犾, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犜狌犿狅狉犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犡犻犪狀犵狔犪犕犲犱犻犮犪犾犛犮犺狅狅犾狅犳犆犲狀狋狉犪犾犛狅狌狋犺犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犆犺犪狀犵狊犺犪 4003, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犘犺狔狊犻狅犾狅犵狔, 犎狌狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犆犺犻狀犲狊犲犕犲犱犻犮犻狀犲, 犆犺犪狀犵狊犺犪 4008, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Tostudytheinterventfunctionofdiferentdosesofdexrazoxaneon myocardialinjuryin ducedbyepirubicininratsanditsmechanism. 犕犈犜犎犗犇犛 :Thirty fivesdratswererandomlydividedintofivegroups,each ofseven.theratsincontrolgroupweregivenbilateralyintraperitonealinjectionofsaline5 ml/kg,theintervaltimeof 30min,everyotherday,4times(7d);Inmodelgrouptheratsweregivenintraperitonealinjectionepirubicin4.5mg/kg everyotherday,4times(7d),injectiontabledexrazoxane30minbeforeepirubicininotherareaintraperitonealinjectionof saline5ml/kg;inepirubicinandlow,mediumandhighdosedexrazoxanegrouptheratsweregivenintraperitonealinjec tionofepirubicin4.5mg/kg,everyotherday,4times(7d),thedexrazoxanewasinjected30minbeforeepirubicininjec tioninanotherareaintraperitonealy45,67.5,90mg/kg,everyotherday,4times(7d).thebiochemicalmarkersofmyo cardialtissueofratsineachgroupweredetected,whichincludedatraceofmyocardialtissuemalondialdehyde (MDA) contentandtotalsuperoxidedismutase(t SOD)activity,plasmalactatedehydrogenase(LDH)andtroponinI(cTnI)lev els,andobservemyocardialpathologicalchangesandcardiomyocyteapoptosis. 犚犈犛犝犔犜犛 :TheSODactivitywassignifi cantlylowerinmodelgroup (75.0±5.4)U/mLthanthatofthecontrolgroup (0.8±3.)U/mL,( 犉 =5.7, 基金项目 湖南省卫生厅科研计划 (B0 094) 第一作者简介 吴晖, 女, 湖南长沙人, 副主任医师, 主要从事乳腺癌内科治疗的基础与临床研究工作 Tel: E mail:rabby876@sohu.com 通讯作者简介 欧阳取长, 男, 湖南娄底人, 博士, 主任医师, 主要从事乳腺癌内科治疗的基础与临床研究工作 Tel: E mail:oyqc@yahoo.com.cn

8 474 吴晖, 等右丙亚胺对表柔比星诱导大鼠心肌损伤干预机制研究 犘 =0.00),MDAcontentwasincreased,(3.60±.88)nmol/mg 狏狊 (5.8±3.4)nmol/mg,( 犉 =7.3, 犘 =0.00).Plas maldh [(5.7±0.58) 0 3 U/L 狏狊 (.3±0.47) 0 3 U/L, 犉 =3.7, 犘 =0.00]andcTnIcontent [(483.38± 5.07) ρ g/ml 狏狊 (64.6±5.07) ρ g/ml, 犉 =0.3, 犘 =0.00],myocardialcelpathologyscore(.70±0.0 狏狊 0, 犉 = 8.65, 犘 =0.00)andapoptoticindex [(66.54±3.46)% 狏狊 (.55± 0.74)%, 犉 =6.86, 犘 =0.00]weresignificantly higherinepirubicinmodelgroupthanthatinthecontrolgroup ( 犘 <0.0).SODactivitywashigher,MDA,plasmaLDH andctnicontentwerelowerineachdexrazoxanegroupthanthatinepirubicinmodelgroup,thatreducedmyocardialpa thologyscoreandmyocyteapoptosisindex( 犘 <0.0or 犘 <0.05). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :Dexrazoxanehasaprotectiveefectto myocardialinjuryinducedbyepirubicinininratsandthemechanism maybetoregulatemyocardialapoptosismechanism andreducethegenerationofoxygenfreeradicalsandlipidperoxidecontent. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] epirubicin;dexrazoxane;cardiotoxicity;apoptosis;mice 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R73-3 文献标识码 A 文章编号 (03) 表柔比星等蒽环类抗肿瘤抗生素广泛应用于治疗血液肿瘤和实体肿瘤, 但其在化疗过程中诱导的心脏毒性限制了其使用剂量, 也因此限制了患者从持续使用蒽环类药物中获益 目前国内外已有动物实验和临床研究表明, 应用右丙亚胺 (dexrazoxane,dex) 可以 [ ] 改善使用蒽环类药物治疗时对心脏的损害作用 本研究以表柔比星致大鼠心肌损伤为研究基础, 给予不同剂量右丙亚胺干预治疗, 通过检测各组大鼠心肌损伤生化指标 心肌组织病理形态学改变及心肌细胞凋亡情况来探讨右丙亚胺保护心肌组织的机制, 并比较不同剂量组的右丙亚胺对心肌组织保护的差异, 为临床用药提供实验依据 材料与方法. 动物 雌性健康 SD 大鼠 35 只, 体质量 (80±30)g, 购自湖南省疾病控制中心实验动物中心 合格证号 : SCXK(0 0004) 饲养于室温 5 湿度 45% 的环境. 主要试剂与仪器 微量丙二醛 (malondialdehyde,mda) 总超氧化物歧化酶 (suporoxidedismutase,sod) 乳酸脱氢酶 (lactatedehydrogenase,ldh) 及大鼠肌钙蛋白 Ⅰ (ctni) 测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所 ; TUNEL 试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限公司 紫外分光光度计产地为瑞士, 型号为 VATR OPEC4300PRO; 超低温冰箱产地为美国, 型号为 NU 663W34; 低速离心机产地为德国, 型号为 Biofuge Primo; 显微镜成像系统产地为日本, 型号为 Olympus BX5; 石蜡切片机产地为德国, 型号为 Leica RM35.3 药物 盐酸表柔比星 (E ADM) 由辉瑞制药 ( 无锡 ) 有限公司提供, 规格 :0 mg/ 支, 批准文号 : 国药准字 H , 产品批号 :0 56 右丙亚胺 (DEX) 由江苏奥赛康药业有限公司提供, 规格 :50 mg/ 瓶, 批准文号 : 国药准字 H00657, 产品批号 :E00.4 方法.4. 实验分组及给药方法 SD 大鼠随机分为对照组 模型组 ( 表柔比星 + 生理盐水 ) 表柔比星 + 低剂量右丙亚胺组 表柔比星 + 中剂量右丙亚胺组和表柔比星 + 高剂量右丙亚胺组 5 组, 每组 7 只 末次给药后 4h 采血 处死大鼠及采集标本 ) 对照组 : 于 SD 大鼠双侧腹腔分别注射生理盐水 5 ml/kg, 间隔时间为 30 min, 隔日 次, 共 4 次 (7d) ) 模型组 ( 表柔比星 + 生理盐水 ):SD 大鼠腹腔内注射表柔比星 4.5 mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d); 注射表柔比星前 30min 于另一区域腹腔内注射生理盐水 5mL/kg 3) 表柔比星 + 低剂量右丙亚胺组 :SD 大鼠腹腔内注射表柔比星 4.5 mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d); 注射表柔比星前 30min 于另一区域腹腔内注射右丙亚胺 45 mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d) 4) 表柔比星 + 中剂量右丙亚胺组 :SD 大鼠腹腔内注射表柔比星 4.5 mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d); 注射表柔比星前 30min 于另一区域腹腔内注射右丙亚胺 67.5 mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d) 5) 表柔比星 + 高剂量右丙亚胺组 :SD 大鼠腹腔内注射表柔比星 4.5mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d); 注射表柔比星前 30 min 于另一区域腹腔内注射右丙亚胺 90mg/kg, 隔日 次, 共 4 次 (7d).4. 观察及检测指标 ) 一般情况 : 每天观察各组大鼠的毛发 进食及活动等情况, 记录生存数, 隔天测体质量 次 ) 血浆 LDH 及 ctni 水平测定 : 末次给药后 4h 收集血液, 抗凝, 分离血浆,-0 以下保存 速率法测定血浆 LDH 含量, 放射免疫法定量分析测定 ctni 3) 心肌组织 MDA 含量和 SOD 活性的测定 :0% 心肌组织匀浆, 离心后取上清液, 黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 活性, 硫代巴比妥酸法测定 MDA 的

9 478 倪晶, 等 SS PEI/ 核酸纳米复合物的构建分析 实验研究 / 论著 犛犛 犘犈犐 / 核酸纳米复合物的构建分析 倪晶 夏伟 王国玉 庄菊花 胡翠华. 上海市第七人民医院核医学科, 上海 上海市普陀区人民医院核医学科, 上海 摘要 目的 : 构建一种可生物降解的基因载体, 并观察其体外转染 DNA/siRNA 的效率和细胞毒性 方法 : 采用低分子质量 PEI 与 3,3 二硫代二丙酸在催化剂作用下合成可降解的 PEI 衍生物 SS PEI, 用红外波谱仪和核磁波谱仪分析其化学结构 ; 动态光散射分析动态光散射 (dynamiclightscatering,dls)ss PEI/DNA 和 SS PEI/siRNA 的粒径 ; 采用流式细胞技术 (FCM) 和荧光激活细胞分类术 (FACS) 分别分析 SS PEI 对 GFP DNA 和 FAM dsrna 的转染率 ; 通过 GFP 表达水平分析 SS PEI 对 GFP 质粒和 GFP sirna 的转染效率 ; 采用考马斯蓝法分析 SS PEI/DNA 和 SS PEI/siRNA 的细胞毒性 结果 : 红外波谱和核磁波谱与 SS PEI 理论波谱一致 ;DLS 结果显示,SS PEI/DNA 复合物粒径为 95~75nm,SS PEI/siRNA 平均粒径约 00nm FCM 结果显示,SS PEI 对 DNA 的最大转染率为 (5.±.3)%, 稍低于 HWPEI 组的 (33.8±3.)%;SS PEI/GFP DNA 转染后 GFP 的表达水平与 HWPEI 转染组接近 (50±7)FI(A.U.)/mg 蛋白狏狊 (68±8)FI(A.U.)/mg 蛋白, 差异无统计学意义, 狋 =.6, 犘 =0.8; 细胞毒性分析显示,SS PEI/DNA 组细胞活力 (89±5.)%, 显著高于 HWPEI/DNA 组的 (70±4.9)%, 差异有统计学意义, 狋 =4.6, 犘 =0.00 FACS 结果显示,SS PEI 对 FAM dsrna 的转染率为 (86.5±.5)%;SS PEI 转染 GFP sirna, 靶基因 GFP 被显著敲除, 相对表达水平为 (4±3.5)FI(A.U.)/mg 蛋白, 与对照组的 (79±0.8)FI(A.U.)/mg 蛋白相比差异有统计学意义, 狋 =5.64, 犘 =0.004 结论:SS PEI 的合成可明显提高装载核酸的效率, 具有低毒和高效等特点 关键词 聚乙烯亚胺 ;DNA; 小干扰 RNA; 质粒 ; 流式细胞术 犘狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊犲狅犳犛犛 犘犈犐 / 狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱犮狅犿狆犾犲狓犲狊 犖犐犑犻狀犵, 犡犐犃犠犲犻, 犠犃犖犌犌狌狅 狔狌, 犣犎犝犃犖犌犑狌 犺狌犪, 犎犝犆狌犻 犺狌犪 中华肿瘤防治杂志,03,0(9): 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犖狌犮犾犲犪狉犕犲犱犻犮犻狀犲, 犛犺犪狀犵犺犪犻犛犲狏犲狀狋犺犘犲狅狆犾犲 狊犎狅狊狆犻狋犪犾, 犛犺犪狀犵犺犪犻 0037, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犖狌犮犾犲犪狉犕犲犱犻犮犻狀犲, 犛犺犪狀犵犺犪犻犘狌狋狌狅犃狉犲犪犘犲狅狆犾犲 狊犎狅狊狆犻狋犪犾, 犛犺犪狀犵犺犪犻 00060, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :TosynthesizeabioreduciblegenevectorSS PEIandtoanalyzeitscytotoxicityandcapacityofbind ingdnaandsirna. 犕犈犜犎犗犇犛 :SS PEIwassynthesizedbychemicalcouplingofthe3 dithiobispropanoicacidwiththelowmolec ularweightpei(800da)viaanedc/nhsactivationreaction.theh NMRspectraandFouriertransforminfrared(FTIR)spectra ofthess PEIpolymerweredetected,respctrively.ThesizeofSS PEI/DNAandSS PEI/siRNA weremeasuredbybynamiclight scatering(dls).thetransfectionratesofss PEIoftransfectingDNAandsiRNAweretestedbyflowchtometry(FCM)andfluo rescence activatedcelsorting(facs),respectively.expressionlevelofgfpproteinwasmeasuredtoevaluatethetransfectioncapaci tyofss PEImediatingDNAandsiRNAdelivery.ThecytotoxicityofSS PEIwasdeterminedusingcoomassiebluestaining. 犚犈 犛犝犔犜犛 :H NMRandFTIRspectraofthepolymerwereinfulaccordancewiththeexpectedstructure.ThesizesofSS PEI/DNA wereintherangefrom95to75nmandtheaveragediameterofss PEI/siRNAwas00nm.FCMindicatedthatthehighesttrans fectionrateofss PEI/DNAwas(5.±.3)% whichwasslightlylowerthanthatofthehwpei/dna (33.8±3.)%.Theex pressionlevelofgfpproteininthegroupss PEI/GFP DNAwassimilartothatofthegroupHWPEI/GFP DNA [(50±7)FI(A. U.)/mgproteinvs(68±8)FI(A.U.)/mgprotein; 狋 =.6, 犘 =0.8].However,thecelviabilityofthegroupSS PEI/DNAwas significantlyhigherthanthatofthegrouphwpei/dna [(89±5.)% 狏狊 (70±4.9)%, 狋 =4.6, 犘 =0.00].FACSindicatedthat transfectionrateofss PEI/siRNAwas(86.5±.5)%,andtheexpressionlevelofGFPproteinaftertransfectingSS PEI/GFP sir NAwasnotablydescendedthanthatofthecontrolgroup,whichwere(4±3.5)and(79±0.8)FI(A.U.)/mgprotein,( 狋 =5.64, 犘 =0.004). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :SS PEIcanenhancetheeficacyofloadingDNAandsiRNAanditissafeandinhighperformance. 基金项目 上海市第七人民医院 七院新星 基金 (XX0 08) 第一作者简介 倪晶, 女, 上海人, 技师, 主要从事分子生物学的研究工作 E mail:nijing6@yahoo.com.cn 通讯作者简介 夏伟, 男, 河南商丘人, 博士, 主治医师, 主要从事分子生物学与分子影像学的研究工作 E mail:awingxia@hotmail.com

10 484 黄旭晖, 等小鼠肝癌休眠模型的建立 实验研究 / 论著 小鼠肝癌休眠模型的建立 黄旭晖 王昌俊 张晓文 林举择 付婷婷. 广东省人民医院 广东省医学科学院 广东省老年医学研究所中医科, 广东广州 广州市体育科学研究所, 广东广州 摘要 目的 : 建立小鼠肝癌休眠模型并验证休眠细胞的存在 方法 :30 只昆明种小鼠均右侧腋下接种 0 6 个 H 腹水型肝癌细胞, 常规喂养 周, 第 5 天选择表皮肿瘤直径 >0.5cm 的小鼠, 进行姑息性手术, 将肉眼可见肿瘤组织全部切除 手术后的小鼠再常规喂养 8 周, 如接种处未见肿瘤组织生长, 即认为肝癌小鼠休眠模型建立成功 ( 按照平均寿命折算, 小鼠生存期 8 周, 即相当于人类寿命 5 年 ) 其后模型小鼠分为复发对照组和复发实验组, 复发对照组小鼠常规喂养 ; 复发实验组模型小鼠给予连续外伤刺激 6 周后处死全部模型小鼠, 接种部位取材, 组织固定和 HE 染色观察肿瘤再生成情况确定休眠细胞的存在 结果 : 肝癌细胞接种于小鼠并行手术后, 有 0% 小鼠成瘤,80% 处于休眠状态 复发实验组给予连续外伤刺激 6 周后,00% 小鼠成瘤, 而复发对照组只有 8.3%, 两组差异有统计学意义, 犘 =0.000 结论 : 本方法成功建立了小鼠肝癌休眠模型, 并用外伤刺激引起肝癌休眠细胞增殖, 验证了休眠肿瘤细胞在体内的存在 关键词 肝肿瘤 ; 休眠 ; 疾病模型, 动物 ; 小鼠 犈狊狋犪犫犾犻狊犺犿犲狀狋狅犳狋狌犿狅狉犱狅狉犿犪狀犮狔犿狅犱犲犾狅犳犺犲狆犪狋狅犿犪犻狀犿狅狌狊犲 犎犝犃犖犌犡狌 犺狌犻, 犠犃犖犌犆犺犪狀犵 犼狌狀, 犣犎犃犖犌犡犻犪狅 狑犲狀, 犔犐犖犑狌 狕犲, 犉犝犜犻狀犵 狋犻狀犵 中华肿瘤防治杂志,03,0(9): 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犜狉犪犱犻狋犻狅狀犪犾犆犺犻狀犲狊犲犕犲犱犻犮犻狀犲, 犌狌犪狀犵犱狅狀犵犌犲狉犻犪狋狉犻犮犐狀狊狋犻狋狌狋犲, 犌狌犪狀犵犱狅狀犵犘犲狅狆犾犲 狊犎狅狊狆犻狋犪犾, 犌狌犪狀犵犱狅狀犵犃犮犪犱犲犿狔狅犳犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊, 犌狌犪狀犵狕犺狅狌 50080, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犌狌犪狀狕犺狅狌犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犛狆狅狉狋狊犛犮犻犲狀犮犲, 犌狌犪狀犵狕犺狅狌 50650, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Toestablishamousehepatomadormancymodelandprovidetheprooffortheexistenceof dormanttumorcels. 犕犈犜犎犗犇犛 :ThehepatomaHcels( 0 6 cels)wereinjectedintoasubcutaneousofrightarmpit ofeachkunming (KM)mice.Then,paliativesurgerywasperformedinthemicewhichthediameteroftumorwaslarge than0.5cmatthe5thdayafterinoculation.afteranother8weeksthemicewithoutrecurrencewereregardedasthesuc cessfulhepatomadormancymodel.thosehepatomadormancymicewererandomlydividedintotwogroups,therecurrence groupandthecontrolgroup.then,cutofthetailofmiceintherecurrencegroupmmevery4daysandrepeatedfor5 times.themiceinbothgroupswerefednormalyduringthesametime.duringthetime,ifthetumorrecurrenceinmouse thetumorsizewasmeasured.thetumorcelswereassessedbyhistopathologywhenthemiceintwogroupsweresacri ficedin6weeks. 犚犈犛犝犔犜犛 :Theresultsshowedthatthesuccessrateofhepatomadormancymodelwas80%.Therecur rencerateofhepatomainrecurrencegroupwas00%,andincontrolgroupwas8.3% respectively.therecurrencerateof recurrencegroupwassignificantlyhigherthanthatincontrolgroup ( 犘 =0.000). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :Themousehepatoma dormancymodelwassuccessfulyestablishedbypaliativesurgery,andtherecurrenceofhepatomacouldbeinducedby cutingofthetailofmicerepeatedly. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] liverneoplasms;dormancy;diseasemodels,animal;mice 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R735.7 文献标识码 A 文章编号 (03) 肿瘤休眠是指肿瘤细胞在宿主体内持续存在而没有明显生长的一种状态 许多临床报道证实, 在肿瘤 基金项目 广东省中医药局建设中医药强省科研课题 (0049) 通讯作者简介 黄旭晖, 男, 广东广州人, 硕士, 主治医师, 主要从事中西医结合治疗肿瘤的临床研究工作 Tel: E mail:api007@63.com 原发灶切除以后, 可有少量休眠的肿瘤细胞在体内存在, 这些仍具有增殖分裂能力的休眠肿瘤细胞, 长期不被机体识别消灭, 又没有出现明显的增殖, 但可能在几年至几十年后, 由于各种诱因被再次激活并开始增殖, [] 从而导致肿瘤的复发转移 体内存在潜伏休眠肿瘤细胞是导致肿瘤复发转移的重要原因, 因此肿瘤休眠与肿瘤的预后密切相关 研究肿瘤细胞在体内休眠的

11 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No 实验研究 / 论著 鸦胆子油乳对犎犲狆 细胞增殖与凋亡诱导作用的研究 马斌娟 卫旭东 高江霞 李娟 3 何健. 宁夏医科大学临床医学院, 宁夏银川 甘肃省人民医院耳鼻咽喉头颈外科, 甘肃兰州 兰州大学基础医学院实验中心, 甘肃兰州 摘要 目的 : 探讨鸦胆子油乳注射液对喉癌 Hep 细胞的增殖抑制及调亡诱导作用 方法 : 利用 MTT 比色法检测 5 个不同药物浓度 ( 和 0.8g/L) 对细胞的抑制率 ; 采用倒置显微镜观察细胞的形态变化 ; 流式细胞仪检测细胞凋亡率 ; 实时荧光定量 PCR 检测凋亡基因 Bcl 和 Bax 的表达 结果 :MTT 显示, 鸦胆子油乳对 Hep 细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖性 倒置显微镜下可见细胞凋亡的形态学改变, 显示加药组细胞染色体固缩, 聚集呈块状 新月状, 出现凋亡小体 流式细胞仪检测显示, 和 0.6g/L 药物作用 48h 后凋亡率分别为 (4.58±4.36)% (57.7± 3.07)% 和 (75.50±3.93)%, 显著高于对照组 (0.96±0.7)%, 差异有统计学意义, 犉 =8.8, 犘 =0.003; 实时荧光定量 PCR 结果显示, 随着鸦胆子油乳注射液的浓度增加,Bcl mrna 的表达减少,BaxmRNA 的表达量逐渐上升, 与对照组比较差异有统计学意义, 犘 <0.0 结论: 鸦胆子油乳能够抑制 Hep 细胞的增殖并诱导其凋亡, 作用呈剂量和时间依赖性 关键词 喉肿瘤 ; 鸦胆子油乳注射液 ;Hep 细胞 ; 细胞凋亡 ; 流式细胞术 犈犳犲犮狋狅犳犅狉狌犮犲犪犼犪狏犪狀犻犮犪狅犻犾犲犿狌犾狊犻狅狀狅狀狆狉狅犾犻犳犲狉犪狋犻狅狀犪狀犱犪狆狅狆狋狅狊犻狊狅犳犺狌犿犪狀犾犪狉狔狀犵犲犪犾犮犪狀犮犲狉犎犲狆 犮犲犾狊 犕犃犅犻狀 犼狌犪狀, 犠犈犐犡狌 犱狅狀犵, 犌犃犗犑犻犪狀犵 狓犻犪, 犔犐犑狌犪狀 3, 犎犈犑犻犪狀. 犆犾犻狀犻犮犪犾犕犲犱犻犮犻狀犲犆狅犾犲犵犲, 犖犻狀犵狓犻犪犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犖犻狀犵狓犻犪, 犢犻狀犮犺狌犪狀 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 中华肿瘤防治杂志,03,0(9): 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗狋狅狉犺犻狀狅犾犪狉狔狀犵狅犾狅犵狔 犎犲犪犱犪狀犱犖犲犮犽犛狌狉犵犲狉狔, 犘犲狅狆犾犲 狊犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犲, 犔犪狀狕犺狅狌 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 3. 犈狓狆犲狉犻犿犲狀狋犆犲狀狋犲狉狅犳犅犪狊犻犮犕犲犱犻犮犪犾犆狅犾犲犵犲, 犔犪狀狕犺狅狌犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犔犪狀狕犺狅狌 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToexploretheefectofBruceajavanicaoilemulsionononthegrowthofhumanlaryngeal Hep cels. 犕犈犜犎犗犇犛 :MTTassaywasusedtoobservetheproliferationofhumanlaryngealcarcinomaHep celstrea tedwithvariousconcentrationsofbruceajavanicaoilemulsionatdiferenttimes.morphologicchangesofhep celswas observedbyinvertedmicroscopyaftertreated withbruceajavanicaoilemulsion;flowcytimetry (FCM)and Real time quantitativepcr wasappliedtomeasuretheapoptosisrateandtheexpressionofbcl andbaxmrnainthehep cels treatedwithbruceajavanicaoilemulsionat0.,0.4,0.6g/lfordiferenttime. 犚犈犛犝犔犜犛 :Bruceajavanicaoilemulsion inhibitedgrowthofhep celsindose dependentandtime dependentmanner( 犘 <0.0).Typicalmorphologicalchanges ofapoptoticcels,celularrounding up,cytoplasmiccontraction,chromatincondensationandparticularlyapoptoticbody, themainmorphologicalcharacteristicofapoptpsiswereobservedbyreservedmicroscopy.inhibitedcelproliferationand induceddeathwereinadose dependentmanner,withapoptoticrateof(4.58±4.36)%,(57.7±3.07)% and(75.50± 3.93)% accordingly.thereexistedastatisticalysignificantdiferencebetweentreatmentandcontrol( 犉 =8.8, 犘 = 0.003).Real timequantitativepcrshowedthatbruceajavanicaoilemulsioncouldreducethebcl geneexpressionand increasegeneexpressionofbax( 犘 <0.0). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :Bruceajavanicaoilemulsionhasobviousinductionofapopto sisonhumanlaryngealcancerhep celsinadose dependentandtime dependentmanner. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] laryngealneoplasms;bruceajavanicaoilemulsion;hep cels;apoptosis;flowcytometry 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 基金项目 甘肃省中医药科研立项课题 (GZK 00 43) 第一作者简介 马斌娟, 女, 甘肃甘谷人, 硕士, 主要从事头颈肿瘤基础与临床的研究工作 Tel: E mail:mabinjuan@63.com 通讯作者简介 卫旭东, 男, 甘肃灵台人, 博士, 副主任医师, 主要从事头颈肿瘤基础与临床的研究工作 Tel: E mail:ty_wei003@yahoo.com.cn

12 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No.9 49 实验研究 / 论著 犈钙黏蛋白对犕犖犖犌诱导犌犈犛 增殖影响及其与犌犾犻 基因相关性研究 闫慧明贾彬陈栋张明明孙志涛 山西医科大学第二医院普外科, 山西太原 摘要 目的 : 研究 E 钙黏蛋白 (E Cad) 在甲基硝基亚硝基胍 (MNNG) 作用于人胃黏膜 GES 永生化细胞生成 MC 细胞后对增殖能力的影响, 并探讨其与 Gli 基因的相关性 方法 :MTT 比色法观察 GES 细胞组 MC 细胞组及环靶明干扰细胞组的生长周期表达 半定量 RT PCR 观察 3 组细胞 Shh 和 Gli 基因的表达 荧光共聚焦观察 3 组细胞 E Cad 的表达 结果 :MTT 比色实验绘制生长曲线显示,MC 组 > 环靶明干扰组 >GES 细胞组, 差异有统计学意义, 犘 < 0.05 半定量 RT PCR 显示,MC 细胞组的 Gli mrna 相对表达水平为 0.454±0.0084, 高于环靶明干扰组的 0.448±0.006, 狋 =6.735, 犘 =0.05; 荧光免疫显示,GES 细胞组与环靶明干扰细胞组 E Cad 的平均荧光强度分别为 79±4 与 78±43, 均明显高于 MC 细胞组的 64±4, 狋值分别为 和 4.357, 犘值分别为 0.00 和 0.00 结论 :Gli 可能参与调控 E Cad 的表达, 使其在 MC 细胞的表达减少, 增强 MC 细胞的体外增殖活性 关键词 胃肿瘤 ;E 钙黏蛋白 ;MNNG;SHH 信号传导 ; 基因,Gli;GES 细胞 ; 比色法中华肿瘤防治杂志,03,0(9): 犈 犆犪犱犺犲狉犻狀犲狓狆狉犲狊犻狅狀犻狀犕犖犖犌犻狀犱狌犮犲犱犌犈犛 狑犻狋犺狆狉狅犾犻犳犲狉犪狋犻狅狀犪狀犱犻狋狊狉犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆狑犻狋犺狋犺犲犲狓狆狉犲狊犻狅狀狅犳犌犾犻 犢犃犖犎狌犻 犿犻狀犵, 犑犐犃犅犻狀, 犆犎犈犖犇狅狀犵, 犣犎犃犖犌犕犻狀犵 犿犻狀犵, 犛犝犖犣犺犻 狋犪狅犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犌犲狀犲狉犪犾犛狌狉犵犲狉狔, 犛犲犮狅狀犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犛犺犪狀狓犻犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犜犪犻狔狌犪狀 03000, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToexploreE Cadherin(E Cad)expressioninmethylationnitroiminotetrahydroofnitrogua nidine(mnng)inducedges to MCcelsanditsrelationshipwiththeexpressionofGli. 犕犈犜犎犗犇犛 :TheMTT was usedtoobserveges celsgrew,mccelgrewandcyclopamineinterferencegroup scelgrowthcycle.fluorescence confocalmicroscopyand Semi quantitative RT PCR wereusedtoobserveexpression of E Cadherin,ShhmDNA and GlimDNA. 犚犈犛犝犔犜犛 :MTTcolorimetricexperimentalgrowthcurvedisplayed MCcelgrew> MCcels>GES cels grew ( 犘 <0.05).Semi quantitativert PCRshowedthattheMCcel sglimrna was0.454±0.0084,itwashigher thanthatofcyclopamineinterferencegroup s0.448±0.006( 狋 =6.735, 犘 =0.05).Thefluorescenceimmunoassay showedthatges celsandcyclopamineinterferencegroup smeanfluorescenceintensitywas79±4and78±43, significantlyhigherthanthatofthe MCcelsgroup s64±4( 狋 =9.437, 犘 =0.00; 狋 =4.357, 犘 =0.00). 犆犗犖犆犔犝 犛犐犗犖 :GlimaybeinvolvedintheregulationE CadherinexpressionbydecreasingtheexpressioninMCcelstostrength entheproliferativeactivityin MCcels. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] stomachneoplasms;e Cadherin;MNNG;SHHsignaltransduction;genes,Gli;GES cels;colori metry 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R735. 文献标识码 A 文章编号 (03) 基金项目 山西省卫生厅科技攻关项目 (0090) 第一作者简介 闫慧明, 男, 山西太原人, 博士, 主任医师, 主要从事胃肠道肿瘤的研究工作 Tel: E mail:yanhuiming003cn@6.com 通讯作者简介 贾彬, 男, 山西太原人, 博士, 主任医师, 主要从事肝胆微创的研究工作 Tel: E mail:jiabin@63.com

13 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No 实验研究 / 论著 人热休克蛋白对树突状细胞表面共刺激分子表达影响的研究 林晓为陈雪芳汪相如谢云青龚福生郑秋红应敏刚 福建医科大学教学医院 福建省肿瘤医院肿瘤研究所肿瘤外科研究室, 福建福州 摘要 目的 : 研究人热休克肿瘤抗原复合物对树突状细胞 (dendriticcels,dc) 表面共刺激分子表达的影响 方法 : 分离培养人外周血来源的 DC 细胞, 在培养过程中加入分离纯化的人热休克蛋白 70(HSP70) 抗原复合物及肿瘤细胞裂解物, 流式细胞技术分析比较负载 HSP70 肿瘤抗原复合物 负载肿瘤细胞裂解物及负载前 DC 细胞表面分子 CD80 CD83 CD86 及 HLA DR 表达水平的变化 结果 : 培养基中加入 HSP70 肿瘤抗原复合物后, 其表面共刺激分子 CD80 CD86 和成熟标记分子 CD83 的表达水平分别为 (98.9±.5)% (98.3±.3)% 和 (53.±0.8)%, 与负载前 CD80 CD86 和 CD83 的 (66.±.6)% (94.±.0)% 和 (6.3±.4)% 相比显著提高, 犘 =0.03; 与肿瘤细胞裂解物负载的 DC 表面 CD80 CD86 和 CD83 的 (86.±.9)% (96.5±.)% 和 (55.±.0)% 相比, 共刺激分子 CD80 的表达显著提高, 犘 = 0.00 结论: 人热休克肿瘤抗原复合物可提高 DC 表面共刺激分子的表达水平, 促进 DC 功能活化, 有可能在抗肿瘤免疫机制中起重要作用 关键词 肿瘤 ;HSP70 抗原复合物 ; 树突细胞 ; 成熟 ; 流式细胞术中华肿瘤防治杂志,03,0(9): 犈犳犲犮狋狅犳犺犲犪狋狊犺狅犮犽狆狉狅狋犲犻狀狋狅犱犲狀犱狉犻狋犻犮犮犲犾狊犫狔狋犺犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犿犲犿犫狉犪狀犲狊狌狉犳犪犮犲犿狅犾犲犮狌犾犪狉 犔犐犖犡犻犪狅 狑犲犻, 犆犎犈犖犡狌犲 犳犪狀犵, 犠犃犖犌犡犻犪狀犵 狉狌, 犡犐犈犢狌狀 狇犻狀犵, 犌犗犖犌犉狌 狊犺犲狀犵, 犣犎犈犖犌犙犻狌 犺狅狀犵, 犢犐犖犌犕犻狀 犵犪狀犵犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犛狌狉犵犲狉狔, 犉狌犼犻犪狀犜狌犿狅狉犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲, 犉狌犼犻犪狀犜狌犿狅狉犎狅狊狆犻狋犪犾, 犜犲犪犮犺犻狀犵犎狅狊狆犻狋犪犾狅狉犉狌犼犻犪狀犕犲犱犻犮犻狀犲犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犉狌狕犺狅狌 35004, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Tostudytheefectofhumanshockproteinondendriticcel(DCs)surfacecostimulating moleculesexpression. 犕犈犜犎犗犇犛 :DCcelswereisolatedandculturedfrom peripheralblood,loadedby HSP70peptides complexandtumorcelslysates,andthentheexpressionofdccelsmembranesurfacemolecularcd80,cd83,cd86and HLA DR weredetectedbyflowcytometrybeforeandafterloaded. 犚犈犛犝犔犜犛 :Theexpressionofco stimulatorymolecular CD80,CD86andmaturelabeledmolecularCD83ofDCcelsloadedwith HSP70peptidescomplexwere(98.9±.5)%, (98.3±.3)% and (53.±0.8)%,which wereraisedbycontroled withdcbeforeloaded (66.±.6)%,(94.±.0)% and (6.3±.4)% ( 犘 =0.03),andcontroledwithDCloadedwithtumorcelslysates(86.±.9)%,(96.5±.)% and (55.±.0)%.CD80wasraised ( 犘 =0.00). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :ItissuggestedthatHsp70peptidecomplex canimprovetheexpressionofco stimulatorymolecularofdcs,activatedcfunctionsdirectly,whichmaypossessimpor tantefectinimmunologicanti tumormechanism. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] neoplasms;hsp70peptideprotein;dendriticcels;mature;flowcytometry 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R73-3 文献标识码 A 文章编号 (03) 基金项目 福建省科技厅重点项目 (007Y004) 第一作者简介 林晓为, 女, 福建福州人, 技师, 主要从事肿瘤免疫学的研究工作 Tel: 通讯作者简介 应敏刚, 男, 福建福州人, 主任医师, 主要从事腹部外科的临床与基础研究工作 Tel: E mail:yingmg@63.com

14 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No 犡犃犉 基因对顺铂诱导肺腺癌犃 549 细胞凋亡作用的研究 朱传东王礼学郭晶晶耿杰徐瀚峰张全安郑勤 东南大学附属第二医院肿瘤科, 江苏南京 0003 实验研究 / 论著 摘要 目的 : 通过顺铂诱导人肺腺癌细胞 A549 的凋亡, 研究 X 染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子 (X linkedinhibi torofapoptosisproteinassociatedfactor,xaf) 基因在 A549 细胞中的表达情况, 初步探讨该基因在凋亡中的作用 方法 : 采用 4μg/mL 浓度的顺铂处理 A549 细胞,MTT 法检测细胞的增殖抑制率 ;AnnexinⅤ/7 AAD 检测 A549 细胞凋亡情况 ;RT PCR 和蛋白质印迹法分别检测 A549 凋亡后 XAFmRNA 和蛋白的表达 ;Caspase 3 试剂盒检测 A549 细胞凋亡后 Caspase 3 的活性 结果 : 用 4μg/mL 浓度顺铂处理 A549 细胞 和 4h 后,A549 细胞增殖抑制率分别为 (3.40±0.65)% (8.3±0.73)% 和 (4.7±0.4)%, 与对照组 (.03±0.8)% 相比均明显增高, 犘值分别为 和 0.000, 细胞增殖抑制率随时间增加而增强 ;A549 细胞凋亡率分别为 (4.35±0.95)% (9.69±.60)% 和 (.35±.4)%, 与对照组 (.39±0.)% 相比均明显增加, 犘值分别为 和 0.000, 细胞凋亡率随顺铂作用时间延长而增加 ; 实验组 XAFmRNA 表达水平分别为 (0.99±0.09) (0.654±0.093) 和 (.6±0.0), 对照组为 (0.09±0.00),XAFmRNA 表达水平随作用时间的延长呈增加趋势, 犘值分别为 和 0.000; 实验组 XAF 蛋白表达水平分别为 (0.3±0.04) (0.508±0.04) 和 (0.90±0.04), 对照组为 (0.4±0.007),XAF 蛋白表达水平随作用时间的延长呈增加趋势, 犘值分别为 和 0.000;Caspase 3 活性 (A405nm) 分别为 (34.745±3.78) (69.54±3.096) 和 (94.787±5.49), 对照组为 (.94±.96),Caspase 3 活性随顺铂作用时间的延长而增加 结论 : 顺铂诱导 A549 细胞凋亡可以引起 XAF 表达增加, 且随细胞凋亡水平的提高而增加, 提示 XAF 可能参与顺铂诱导人肺腺癌 A549 细胞的凋亡过程 关键词 肺肿瘤 ; 顺铂 ;A549 细胞 ;X 染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子 ; 细胞凋亡 ; 印迹法, 蛋白质中华肿瘤防治杂志,03,0(9): 犈犳犲犮狋狅犳犡犃犉 犵犲狀犲狅狀犾狌狀犵犪犱犲狀狅犮犪狉犮犻狀狅犿犪犃 549 犮犲犾犪狆狅狆狋狅狊犻狊犻狀犱狌犮犲犱犫狔犮犻狊狆犾犪狋犻狀 犣犎犝犆犺狌犪狀 犱狅狀犵, 犠犃犖犌犔犻 狓狌犲, 犌犝犗犑犻狀犵 犼犻狀犵, 犌犈犖犌犑犻犲, 犡犝犎犪狀 犳犲狀犵, 犣犎犃犖犌犙狌犪狀 犪狀, 犣犎犈犖犌犙犻狀犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗狀犮狅犾狅犵狔, 犛犲犮狅狀犱犎狅狊狆犻狋犪犾犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱狋狅犛狅狌狋犺犲犪狊狋犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犖犪狀犼犻狀犵 0003, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :BasedontheapoptosisprocessofA549celsinducedbycisplatin,weresearchedtheexpres sionandfunctionsofthexafgene. 犕犈犜犎犗犇犛 :TheproliferationinhibitionrateafterA549celstreatedwiththecispla tinof4μg/mlwasdetectedby MTT.TheA549celapoptosiswasdetectedbyAnnexinⅤ/7 AAD.TheXAF mrna andproteinexpressionwasmonitoredbythert PCRandwesternbloting.TheCaspase 3activityinapoptoticA549cels wasdetectedbythecaspase 3assay. 犚犈犛犝犔犜犛 :Thecelproliferationinhibitionrateincreasedwiththecisplatintreating duration.thecelproliferationinhibitionratesoftheexperimentgroupwereh(3.40±0.65)%,h(8.3±0.73)%, and4h(4.7±0.4)% respectively.comparedwiththecelproliferationinhibitionrate(.03±0.8)% ofthecontrol group, 犘 valueswere0.004,0.000,and0.000respectively.thecelapoptosisrateincreasedwiththecisplatintreatingdu ration.theapoptosisrateswereh (4.35±0.95)%,h (9.69±.60)%,and4h (.35±.4)% respectively. Comparedwiththecelapoptosisrate(.39±0.)% ofthecontrolgroup, 犘 valueswere0.006,0.005,and0.000re spectively.themrnaexpressionsoftheexperimentgroupwereh (0.99±0.09),h (0.654±0.093),and4h (.6±0.0)respectively,whilethemRNAexpressionofthecontrolgroupwas(0.09±0.00).TheXAFmRNA expressionincreasedwiththecelapoptosisrate.comparedwiththemrnaexpressionofthecontrolgroup, 犘 valueswere 0.006,0.00,and0.000respectively.TheXAFproteinexpressionsoftheexperimentgroupwereh (0.3±0.04), h (0.508±0.04),and4h (0.90±0.04)respectively,whiletheXAFproteinexpressionofthecontrolgroup 第一作者简介 朱传东, 男, 安徽颍上人, 博士, 住院医师, 主要从事肿瘤内科的临床与基础研究工作 Tel: E mail:zswx00@63.com 通讯作者简介 郑勤, 男, 江苏高淳人, 主任医师, 硕士生导师, 主要从事肿瘤临床与生物治疗的研究工作 Tel: E mail:njzq836647@sina.com

15 500 朱传东, 等 XAF 基因对顺铂诱导肺腺癌 A549 细胞凋亡作用的研究 was(0.4±0.007).theproteinexpressionoftheexperimentgroupwasincreasedwiththecelapoptosisrate.com paredwiththexafproteinexpressionofthecontrolgroup, 犘 valueswere0.00,0.000,and0.000respectively.the Caspase 3activityincreased withthecisplatintreatingduration.thecaspase 3activityvaluesoftheexperimentgroup wereh (34.745±3.78),h (69.54±3.096),and4h (94.787±5.49)respectively.TheCaspase 3activityvalue ofthecontrolgroupwere(.94±.96). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖犛 :A549celapoptosisinducedbycisplatinmayincreasethe XAFgeneexpression.TheexpressionlevelincreasesaccordingtotheimprovementofA549celapoptosislevel,whichin dicatesthatthexafgenetakesefectsintheapoptosisprocessofa549celsinducedbycisplatin. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] lungneoplasms;cisplatin;a549cel;x linkedinhibitorofapoptosisproteinassociatedfactor ;apop tosis;bloting,western 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R734. 文献标识码 A 文章编号 (03) 近年来, 在发展中国家, 尤其是中国, 肺癌的发病 [ ] 率呈明显上升趋势 关于肺癌的发生发展机制及治疗新策略的探索是学术界关注的焦点之一 X 染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子 (X linkedinhibitorof apoptosisproteinassociatedfactor,xaf) 是一个新发现的拮抗凋亡蛋白抑制因子 (inhibitorofapopto sisprotein,iap), 可以促进肿瘤细胞凋亡 有研究表明,XAF 在胚胎组织及成人正常组织中广泛表达, 但是在肿瘤细胞株以及肿瘤组织中低表达甚至不表达, [3 5] 是一个潜在的抑癌基因 本研究采用肺癌化疗的基本药物顺铂来诱导人肺腺癌细胞的凋亡, 观察细胞凋亡过程中细胞内 XAF 基因表达的变化, 初步探讨 XAF 在细胞凋亡中的作用 材料与方法. 材料人肺腺癌细胞 A549 为我院肝病研究室保存, 细胞用含 0% 胎牛血清的 MEM 培养液培养于 37 5% CO 孵箱内, 每 ~3d 换液传代 胎牛血清购自杭州四季青公司 ; 顺铂为齐鲁制药厂生产, 批号 : 0004DB;RT PCR 试剂盒和质粒抽提纯化试剂盒购自 Promega 公司 ;TaqDNA 聚合酶 dntps T4 DNA 连接酶和 DNA Marker 购自 Takara 公司 ;DNA 电泳凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司 ; 琼脂粉购自上海药物所 ; 寡核苷酸引物由上海博亚生物技术有限公司合成 ;RPMI640 MEM 和 OPTI MEM 培养基为美国 Gibco 产品 ;Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司 ; 碘化丙锭 (propidiumiodide,pi) 购自 Sigma 公司 ; 电泳级琼脂糖 (Agarose) 为 MBI 进口分装 ;An nexin Ⅴ/7AAD 购自 BD 公司 鼠抗人 XAF 单克隆抗体 C 6 购自 SantaCruz 公司 ; β actin 单克隆抗体购自 Sigma 公司 ; 辣根过氧化酶连接的二抗购自 San tacruz 公司 ; 硝酸纤维膜购自 Bio Rad 公司 ;ECL 购自 Amersham Biosci ences 公司 ;Caspase 3 活性检测试剂盒为 Clintech 公司产品. 方法.. MTT 测定细胞增殖抑制率取对数生长期的细胞, 调整细胞密度至 0 4 个 /ml, 接种于 96 孔细胞培养板, 每孔 00μL, 于细胞悬液中分别加入 8μg/mL 的顺铂 00μL,37 5% CO 孵箱中培养 和 4 h 后, 每孔分别加入 5 mg/ml MTT 0μL,37 培养箱孵育 4h, 弃 MTT, 加入 DMSO 00μL/ 孔,0.5h 后于波长 570nm 处检测吸光度值 (A), 计算细胞增殖抑制率 (IR) 每组浓度设 6 个复孔, 实验重复 3 次 处理组 A 值 IR(%)=(- 对照组 A 值 ) 00%.. AnnexinⅤ/7 AAD 检测细胞凋亡率将 A549 细胞在含 4μg/mL 的顺铂培养基中孵育 和 4h 后, 取对照组和药物处理组细胞, 参照 Annex inⅤ/7 AAD 凋亡检测试剂盒说明书, 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况, 每组实验重复 3 次..3 RT PCR 检测 XAFmRNA 表达变化收集经 4μg/mL 顺铂处理的 和 4h 及对照组未经处理的 A549 细胞, 每组细胞为 0 6 个,Trizol 法提取细胞总 RNA 逆转录反应合成 cdna 第 条链, 以 GAPDH 为内参照, 运用 PCR 技术检测细胞 XAF mrna 的表达 反应条件为 95 3min;94 45s, 57 45s,7 45s,3 个循环 ;7 延长 0 min PCR 产物在含 0.5%EB 的.% 琼脂糖凝胶电泳分离 XAF 的上游引物为 5 GAGGAGATAAAG CAGCCTATGAC 3, 下游引物为 5 CTCTTGCCT GATTGCTGTGG 3,PCR 产物长度大小 50 bp; GAPDH 的上游引物为 5 CAACTAAGCGGCA CAGAATG 3, 下游引物为 5 GCCAGTGGACTC CACGAC 3,PCR 产物长度大小 30bp..4 蛋白质印迹法检测 XAF 蛋白的表达收集细胞离心沉淀后加入细胞裂解液, 蛋白含量用蛋白检测试剂盒检测 取 5μg 蛋白进行变性聚丙烯酰氨凝胶电泳, 转移蛋白至硝酸纤维膜先后与特异性抗体

16 中华肿瘤防治杂志 03 年 0 月第 0 卷第 9 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October03,Vol.0 No 犿犻犚 34 犪稳定表达株构建及其对宫颈癌犆犪狊犽犻细胞功能影响的观察 汤文凡 佐满珍 刘朝奇 查锦芬 汤超. 三峡大学人民医院妇产科, 湖北宜昌 三峡大学医学院, 湖北宜昌 实验研究 / 论著 摘要 目的 : 构建人 mir 34a 的真核表达载体, 并研究其对宫颈癌细胞株 Caski 细胞活性的影响 方法 : 以人正常组织基因组 DNA 为模板, 用 PCR 法扩增得到 mir 34a 的前体序列, 构建 mir 34a 真核表达载体 pegfp C mir34a 同时用重组载体 pegfp C mir34a 转染宫颈癌细胞株 Caski 细胞, 筛选 mir 34a 稳定表达细胞系作为实验组,pEGFP C 转染组为对照组 (Control), 用 RT PCR 及 RealtimeRT RCR 法鉴定 mir 34a 在克隆细胞中的表达, 并用 MTT FCM 分析 mir 34a 的生物学特性,RT PCR 研究检测其靶基因表达改变 结果 : 成功构建了人 mir 34a 真核表达载体 pegfp C mir34a, 并在宫颈癌 Caski 细胞中上调 mir 34a 的表达, 实验组 mir 34a 的表达相对于对照组升高约 3.3 倍 ;MTT 提示, 实验组 mir 34a 能够显著的抑制 Caski 细胞增殖, 差异有统计学意义, 犘 =0.08; 实验组 G0/G 期百分率为 77.7%, 与对照组的 50% 比较, 差异有统计学意义, 犘 =0.004; 而实验组 S 期百分率为 0.3%, 对照组为 35.4%, 两组比较差异有统计学意义, 犘 =0.07; 实验组细胞 mir 34a 靶基因细胞周期基因 CDK4 CDK6 CyclinE 和 EFmRNA 的表达下调, 与对照组比较差异有统计学意义, 犘 =0.00 结论: 成功构建人 mir 34a 的真核表达载体, 并能显著抑制宫颈癌细胞株 Caski 细胞活性, 为进一步研究 mir 34a 在宫颈癌中的功能及基因调控机制奠定了实验基础 关键词 宫颈肿瘤 ; 微小 RNAs;miR 34a; 表达载体 ; 基因表达 ; 细胞周期 ; 细胞增殖 中华肿瘤防治杂志,03,0(9): 犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犿犻犚 34 犪狊狋犪犫犾犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狊狋狉犪犻狀犻狀犮犲狉狏犻犮犪犾犮犪狀犮犲狉犆犪狊犽犻犮犲犾犪狀犱狆狉犲犾犻犿犻狀犪狉狔狊狋狌犱狔狅犳犻狋狊犳狌狀犮狋犻狅狀 犜犃犖犌犠犲狀 犳犪狀, 犣犝犗犕犪狀 狕犺犲狀, 犔犐犝犆犺犪狅 狇犻, 犣犎犃犑犻狀 犳犲狀, 犜犃犖犌犆犺犪狅. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗犫狊狋犲狋狉犻犮狊犪狀犱犌狔狀犲犮狅犾狅犵狔, 犘犲狅狆犾犲 狊犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犆犺犻狀犪犜犺狉犲犲犌狅狉犵犲狊犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犢犻犮犺犪狀犵 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犵. 犕犲犱犻犮犪犾犆狅犾犲犵犲狅犳犆犺犻狀犪犜犺狉犲犲犌狅狉犵犲狊犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犢犻犮犺犪狀犵 44300, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToconstructaneukaryoticexpressionvectorofmiR 34aandexploreitsinfluenceonthecel viabilityincervicalcancercellinescaskicels. 犕犈犜犎犗犇犛 :ThemiR 34aprecursorsequenceswereamplificatedbyPCR withhumangenomicdnaastemplate.theeukaryoticexpressionvectorofpegfp C mir34awasconstructed.thecer vicalcancercellinescaskicelsweretransfectedwiththevectorpegfp C mir34ainexperimentalgroupandcaskicels weretransfectedwithpegfp Cvectorascontrolgroup.RT PCRandReal timercr wereusedtoidentifymir 34aeu karyoticexpressioninclonecels.thebiologicalcharacteristicsofthemir 34aincaskicelswerestudiedby MTT,FCM andrt PCR methods,theexpressionlevelsofcelcyclegenecdk4,cdk6,cyclin E,EF mrna weretestedby RT PCR. 犚犈犛犝犔犜犛 :TheeukaryoticexpressionvectorofmiR 34apEGFP C mir 34awassuccessfulyconstructedandit couldbeexpressedin cervicalcancercellines Caskicels.Expression of mir 34aintheexperimentalgroup was 3.3timeshigherthanthatofthecontrolgroup;MTTsuggestedthatmiR 34acansignificantlyinhibittheproliferation ofcaskicels,andthere wasstatisticalsignificance ( 犘 =0.08);celcycleofG0/Gintheexperimentalgroup was 77.7%,whilethecontrolgroupwas50%,andthediferencewasstatisticalysignificant( 犘 =0.004).ThepercentageofS phasecelsinexperimentalgroupwas0.3%,comparedwiththecontrolgroup (35.4%)thediferencewasstatisticaly 基金项目 三峡大学硕士学位论文培优基金 (0PY048) 第一作者简介 汤文凡, 男, 湖北咸宁人, 硕士, 主要从事 microrna 对妇科肿瘤调控的研究工作 E mail:tangwenfan094@63.com 通讯作者简介 佐满珍, 女, 湖北咸宁人, 主任医师, 硕士生导师, 主要从事妇科肿瘤方面的研究工作 E mail:ycyy_zmz@6.com

17 504 汤文凡, 等 mir 34a 稳定表达株构建及其对宫颈癌 Caski 细胞功能影响的观察 significant( 犘 =0.07);ThedownregulatedexpressionofthemiR 34atargetgenesofcelcyclegenesCDK4,CDK6,Cyc line,ef mrnainexperimentgrouphadstatisticalysignificantdiferencecompared withthecontrolgroup ( 犘 = 0.00). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :TheeukaryoticexpressionvectorofmiR 34acanbeefectivelyexpressedincervicalcancercel linescaskicels,inhibitthecelproliferationanddownregulatethemrnaexpressionofcelcyclegenescdk4,cdk6,cy cline,ef,whichhaslaidtheexperimentalfoundationforfurtherstudyingthefunctionofmir 34aincervicalcancer anditsgeneregulatorymechanisms. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] cervicalneoplasms;micrornas;mir 34a;expressionvectors;geneexpression;celcycle;celprolif eration 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(9): 中图分类号 R 文献标识码 A 文章编号 (03) mirna 是一类内源性非编码单链小分子 RNA, 可作为原癌基因或者抑癌基因, 在肿瘤的发生和发展 [] 中扮演着重要的角色 编码 mir 34a 的基因定位于染色体 p36, 这一位点经常伴随多个基因的缺失突变而导致肿瘤的发生 异常的 mir 34 表达可诱导细胞 [ 3] 凋亡 细胞周期阻滞或衰老 ;mir 34a 受经典抑癌因子 p53 的直接调控,miR 34a 通过下调 CDK4 CDK6 EF3 EF5 和 C MET 等发挥其肿瘤抑制作 [4] 用 p53 引起细胞周期的 G 期阻滞 细胞衰老和凋 [5] 亡,miR 34a 起着重要的调控作用 mir 34a 的失 [6] 活或缺失可能与多种肿瘤的发病机制有关, 但目前 mir 34a 在宫颈癌中的功能鲜有报道 本研究通过构建人 mir 34a 真核表达载体, 转染宫颈癌 Caski 细胞并筛选出 mir 34a 稳定表达细胞系, 为进一步研究 mir 34a 在宫颈癌中的功能及基因调控机制奠定基础 材料与方法. 材料 pegfp C 质粒 EcoliDH5α 感受态细胞和宫颈癌 Caski 细胞株由三峡大学分子生物学研究所实验室提供 Lipofectamine TM 000Reagent 为 Invitrogen 公司产品 ;TaqDNA 聚合酶 限制性内切酶 凝胶回收试剂盒和 T4DNA 连接酶均为 Fermentas 公司产品 ; DNA 提取试剂盒和质粒抽提试剂盒为 OMEGA 公司产品. 方法.. 引物合成从 mirbase 数据库中得到 mir 34a 和 Pre mir34a 的序列, 搜索人类基因组数据库 (GeneBank), 获得 Pre mir34a 对应的基因组序列及其两侧约 300nt 的侧翼序列 依据该序列利用 prime 5.0 设计引物, 引入酶切位点 BamHⅠ EcoRⅠ 和保护碱基 同时合成 pegfp C 通用引物 T7 和 BGH 引物由上海生物工程有限公司合成 Pri mir34a: 上游引物 5 CGGAATTCGTAATTTCCTTCTTATC AACAGGTGC 3, 下游引物 5 CGGGATCCCAAA CTTCTCCCAGCCAA 3.. 重组质粒 pegfp C mir34a 的构建与鉴定 提取人正常细胞基因组 DNA, 利用引物 Pri mir34a 进行 PCR 扩增, 反应条件为 94 3 min,94 30s, 60 30s,7 30s,30 个循环后 % 琼脂糖凝胶电泳酶切, 获得目的基因 将线性化空载体 pegfp C 质粒与目的基因片段于 6 连接过夜, 转化 EcoliDH5α 感受态细胞, 涂于 LB 含有卡那霉素平皿上,37 培养过夜 挑取菌落克隆扩大培养, 抽提质粒后对酶切鉴定正确的克隆进一步测序鉴定..3 细胞转染与稳定转染细胞系的筛选用含 0% NCBS 的 RPMI640 完全培养基于 37 5% CO 培养箱中培养细胞 细胞转染前 4h, 收集对数生长期细胞接种于 6 孔板 当细胞数目达到 80% 时, 用脂质体转染试剂 Lipofectamine TM 000Reagent 于无抗生素无血清培养基中进行质粒转染, 转染后 6h 更换为完全培养基 培养 4h 后用终浓度 500μg/mL 的 G48 筛选 5 周, 于 00μg/mL 维持浓度压力筛选下扩大培养, 并在荧光显微镜下挑取单克隆细胞株..4 转染细胞 mir 34a 表达的 RealtimeRT PCR 检测 以总 RNA 在反转录酶作用下反转录形成得第 链 cdna 为模板, 由 Prime5.0 设计的实时定量 mirna 特异引物进行 PCR 反应, 使用 Lightcycler faststartdna mastersybrgreenⅠ 试剂盒, 反应条件为 94 变性 30s,60 退火 30s,7 荧光检测 3s, 重复 40 个循环 70~95 绘制溶解曲线, 电泳检测 PCR 扩增情况, 并进行数据分析 PCR 反应以 U6 RNA 作为内参照 mir 34a 的反转录引物为 5 GT CGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC TGGATACGACTACAAC 3,miR 34a 实时定量 PCR 引物序列为上游引物 5 GCCCGCTGGCAGT GTCTTAGCTG 3 和下游引物 5 GTGCAGGGTC CGAGGT 3..5 转染细胞 mir 34a 下游靶基因的 RT PCR 检测总 RNA 在反转录酶作用下以 Olig(DT) 为引物

18 508 曾四元, 等宫颈腺癌组织 ERK/ 和 p6 INK4a 及 P gp 表达与耐药相关性分析 临床基础研究 / 论著 犐犖犓 4 犪宫颈腺癌组织犈犚犓 / 和狆 6 及犘 犵狆表达与耐药相关性分析, 曾四元江维梁美蓉李凌钟美玲. 南昌大学医学院, 江西南昌 江西省妇幼保健院肿瘤科, 江西南昌 摘要 目的 : 探讨细胞外信号调节激酶 /(ERK/) p6 INK4a 及 P 糖蛋白 (P gp) 与宫颈腺癌耐药的关系 方法 : PV9000 免疫组化二步法检测化疗敏感组 (4 例 ) 及耐药组 (5 例 ) 宫颈腺癌活检组织中 ERK/ p6 INK4a 及 P gp 蛋白的表达情况, 分析 ERK/ p6 INK4a 及 P gp 在两组的表达差异 3 者的表达相关性及与宫颈腺癌患者 3 年生存率的关系 结果 :ERK/ 在耐药组及敏感组的高表达率分别为 7.0%(8/5) 及 35.7%(5/4), 差异有统计学意义, 犝 =96, 犘 = 0.06;P gp 在耐药组的高表达率为 76.0%(9/5), 显著高于敏感组的 8.6%(4/4), 差异有统计学意义, 犝 =0, 犘 = 0.06;p6 INK4a 蛋白在耐药组及敏感组的表达差异无统计学意义, 犝 =9, 犘 =0.40 ERK/ 与 p6 INK4a 的表达呈正相关, 狉 =0.57, 犘 <0.00;ERK/ 与 P gp 的表达呈正相关, 狉 =0.364, 犘 =0.03;p6 INK4a 与 P gp 的表达无明显相关性, 狉 =0.54, 犘 =0.3 ERK/ 高表达与低表达患者的 3 年生存率分别为 60.9%(4/3) 和 93.8%(5/6), 差异有统计学意义, χ =4.73, 犘 =0.030; 而 p6 INK4a 高表达与低表达患者的 3 年生存率分别为 68.0%(7/5) 和 85.7%(/4), 差异无统计学意义, χ =.355, 犘 =0.44;P gp 高表达与低表达患者的 3 年生存率分别为 65.% (5/3) 和 87.5% (4/6), 差异无统计学意义, χ =.347, 犘 =0.5 结论:ERK/ 和 P gp 的高表达与宫颈腺癌耐药相关 ;ERK/ 的表达情况不仅可为宫颈腺癌化疗用药提供参考, 而且可作为宫颈腺癌判断预后的指标 关键词 宫颈肿瘤 ;ERK/ 蛋白 ;p6 INK4a 蛋白 ;P 糖蛋白 ; 抗药性, 多药中华肿瘤防治杂志,03,0(9):508-5 犐犖犓 4 犪犈狓狆狉犲狊犻狅狀狊狅犳犈犚犓 /, 狆 6 犪狀犱犘 犵狆犻狀犮犲狉狏犻犮犪犾犪犱犲狀狅犮犪狉犮犻狀狅犿犪犪狀犱犻狋狊狉犲犾犪狋犻狅狀狋狅犮犺犲犿狅狉犲狊犻狊狋犪狀犮犲, 犣犈犖犌犛犻 狔狌犪狀, 犑犐犃犖犌犠犲犻, 犔犐犃犖犌犕犲犻 狉狅狀犵, 犔犐犔犻狀犵, 犣犎犗犖犌犕犲犻 犾犻狀犵. 犕犲犱犻犮犪犾犆狅犾犲犵犲狅犳犖犪狀犮犺犪狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犖犪狀犮犺犪狀犵 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗狀犮狅犾狅犵狔, 犑犻犪狀犵狓犻犕犪狋犲狉狀犪犾犪狀犱犆犺犻犾犱犎犲犪犾狋犺犎狅狊狆犻狋犪犾, 犖犪狀犮犺犪狀犵 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Toexplorerelationbetweentheexpressionsofextracelularsignal regulatedkinase/ (ERK/),p6 INK4a,P glycoprotein (P gp)andthechemoresistanceofcervicaladenocarcinoma. 犕犈犜犎犗犇犛 :PV9000im munohistochemistrywasusedtodetecttheexpressionsoferk/,p6 INK4a andp gpinthebiopsyspecimensofcervical adenocarcinomaofchemosensitivegroup (4patients)andchemoresistantgroup (5patients).Expressiondiferencesof ERK/,p6 INK4a andp gpbetweenthechemosensitivegroupandchemoresistantgroupandthecorrelationamongthem wereanalyzed.therelationbetweentheexpressionsoferk/,p6 INK4a andp gpandthe3 yearsurvivalrateofthepa tientswithcervicaladenocarcinoma wasanalyzed. 犚犈犛犝犔犜犛 :ThehighlyexpressedratesofERK/inchemoresistant groupandchemosensitivegroupwere7.0%(8/5)and35.7%(5/4)respectively,andtherewasstatisticalsignificance betweenthem ( 犝 =96, 犘 =0.06);thehighlyexpressedrateofP gpwas76.0%(9/5)inchemoresistantgroupwhich wasobviouslyhigherthanthatofchemosensitivegroup8.6% (4/4),andthisdiferencewasstatisticalysignificant ( 犝 =0, 犘 =0.06);whiletheexpressiondiferencesofp6 INK4a betweenthechemoresistantgroupandchemosensitive groupwerenotstatisticalysignificant( 犝 =9, 犘 =0.40).TheexpressionofERK/waspositivelycorrelatedwith 基金项目 国家自然科学基金 (860383) 通讯作者简介 曾四元, 男, 江西遂川人, 硕士, 主任医师, 主要从事妇科肿瘤的研究工作 Tel: E mail:jacksonzeng@yeah.net