56 李民, 等类 Smac 小分子 SmacN7 对人胰腺癌细胞株 SW990 凋亡影响的观察 ofsmacn7was morethan95%,with molecularweightof378.08;)treatmentofthesw990celsfor4h with 500μg/mLofSma

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1 中华肿瘤防治杂志 03 年 4 月第 0 卷第 8 期 CHINJCANCERPREV TREAT,April03,Vol.0 No.8 56 前沿报道 / 论著 类犛犿犪犮小分子犛犿犪犮犖 7 对人胰腺癌细胞株犛犠 990 凋亡影响的观察 李民,,3 张波 刘波 倪淑琴 韩淑梅 牛作兴. 山东省医学科学院 济南大学医学与生命科学学院临床医学 009 级, 山东济南 500. 山东省肿瘤医院内科, 山东济南 上海交通大学附属第六人民医院南院 ( 奉贤区中心医院 ) 消化内科, 上海 0400 摘要 目的 : 观察外源性类 Smac 小分子 SmacN7 对人胰腺癌细胞株 SW990 凋亡的影响, 以期找到治疗胰腺癌的新方法 方法 : 使用固相多肽合成技术 (SPPS) 和反相高效液相层析法 (RP HPLC) 制备 SmacN7;Heochst3334 染色法观察 SW990 分别与 PBS 液和 500ng/mLTRAIL 500μg/mLSmacN7 作用 4h 的细胞凋亡形态 ; 流式细胞术 (FCM) 检测 SW990 分别与 500μg/mLSmacN7 和 500ng/mLTRAIL 作用 4h 的细胞凋亡率 (CAR) 并观察细胞周期分布 ; 四甲基偶氮唑盐法 (MTT 法 ) 检测 SW990 分别与 和 500μg/mLSmacN7 作用 4 48 和 7h 的细胞生长抑制率 (CGIR);MTT 法检测 500μg/mLSmacN7 分别与 和 500ng/mLTRAIL 或 和 60μmol/L 吉西他滨 (GEM) 联用, 与 SW990 作用 4h 的 CGIR 结果:SmacN7 纯度 95%, 相对分子质量 , 质谱鉴定结果与预期结果完全一致 SW990 与 500μg/mLSmacN7 作用 4h 和与 500ng/mLTRAIL 作用 4h 细胞形态变化类似, 细胞体积和细胞核增大, 轻度肿胀, 细胞变为短梭形, 细胞核呈亮蓝色, 分叶或碎片状, 边缘集中, 且数目更多 ; 细胞周期均显示 G0/G 期阻滞,S 期比例下降, 细胞生长变缓 ;CAR 分别为 5.64% 和 5.30% SW990 分别与 和 500μg/mLSmacN7 作用 4 48 和 7h,CGIR 不同, 且随 SmacN7 浓度增加和作用时间延长,CGIR 升高, 犘 <0.05; 500μg/mLSmacN7 分别联合 和 500ng/mL TRAIL, 与 SW990 作用 4h,SW990 的 CGIR 为 8.% 37.67% 4.63% 和 67.60%; 分别联合 和 60μmol/L GEM 与 SW990 作用 4h,SW990 的 CGIR 分别为 7.65% 3.85% 40.% 和 74.99% 两组均随 TRAIL 和 GEM 浓度的增加,SW990 的 CGIR 升高 结论 : SmacN7 能促使 SW990 凋亡, 且有浓度和作用时间依赖性 其作用机制与 XIAP 表达量降低, 细胞色素 C 和 Caspase 3 活性裂解片段 p7 表达量升高有关 SmacN7 有可能成为治疗胰腺癌的新方法 关键词 胰腺肿瘤 ; 类 Smac 小分子 SmacN7;SW990; 凋亡 中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犈犳犲犮狋狊狅犳犛犿犪犮犖 7 狅狀犪狆狅狆狋狅狊犻狊犻狀犺狌犿犪狀狆犪狀犮狉犲犪狋犻犮犮犪狀犮犲狉犮犲犾犾犻狀犲犛犠 990,,3 犔犐犕犻狀, 犣犎犃犖犌犅狅, 犔犐犝犅狅, 犖犐犛犺狌 狇犻狀, 犎犃犖犛犺狌 犿犲犻, 犖犐犝犣狌狅 狓犻狀犵. 犆狅犾犲犵犲狅犳犕犲犱犻犮犻狀犲犪狀犱犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲狊, 犛犺犪狀犱狅狀犵犃犮犪犱犲犿狔狅犳犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊, 犑犻狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犑犻狀犪狀 500, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犇犲狆犪狋犿犲狀狋狅犳犐狀狋犲狉狀犪犾犕犲犱犻犮犻狀犲, 犛犺犪狀犱狅狀犵犆犪狀犮犲狉犎狅狊狆犻狋犪犾, 犑犻狀犪狀 507, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 3. 犇犲狆犪狋犿犲狀狋狅犳犌犪狊狋狉狅犲狀狋犲狉狅犾狅犵狔, 犛狅狌狋犺犲狉狀犅狉犪狀犮犺, 犛犻狓狋犺犘犲狅狆犾犲 狊犎狅狊狆犻狋犪犾, 犛犺犪狀犵犺犪犻犑犻犪狅狋狅狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犉犲狀犵狓犻犪狀犃狉犲犪犆犲狀狋狉犪犾犎狅狊狆犻狋犪犾, 犛犺犪狀犵犺犪犻 0400, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToobservetheefectofSmacN7ofexogenousSmacsmalmoleculegroupontheapoptosis ofhumanpancreaticcancercellinesw990andwishtolookforanewoptionforpancreaticcancertreatment. 犕犈犜犎 犗犇犛 :)SmacN7waspreparedthroughsolid phasepeptidesynthesistechniqueandrp HPLC;)Apoptosiscelmorphol ogyofsw990treatedwith500μg/mlsmacn7andtrailfor4hourswasobservedwith Heochst3334staining. 3)CelcircledistributionSW990treatedwithSmacN7andTRAILwasassayedwithflowcytometry;4)SW990growth inhibitionratefromdiferentconcentrationandactingtimeofsmacn7wereassayedwithmtt. 犚犈犛犝犔犜犛 :)Thepurity 基金项目 国家自然科学基金 ( ) 第一作者简介 李民, 男, 山东济宁人, 副主任医师, 主要从事消化系肿瘤内科治疗干预的临床与基础研究工作 Tel: E mail:limindeyouxiang@hotmail.com 通讯作者简介 牛作兴, 男, 山东济南人, 主任医师, 硕士生导师, 主要从事肿瘤内科 造血干细胞移植的临床与基础研究工作 Tel: E mail:nzx66@yahoo.com.cn

2 56 李民, 等类 Smac 小分子 SmacN7 对人胰腺癌细胞株 SW990 凋亡影响的观察 ofsmacn7was morethan95%,with molecularweightof378.08;)treatmentofthesw990celsfor4h with 500μg/mLofSmacN7and500ng/mLofTRAILyieldedsimilarresults,includingcelvolumeandnucleienlargement withmildsweling,celsshortenandspindled,bluebrightofnucleiandleaf likeorfragmentedwithedgeconcentration. CelcircleanalysisshowedthatcelswereblockedatG0/Gstage,theproportionofSphagewasdecreasedandcelgrowth wassloweddown.3)thecarofsw990 was5.3% after4hsmacn7treatment,significantlyhigherthanthatof TRAILtreatment(5.64%).4)AlongwithdiferentconcentrationofSmacN7 (50,00,00and500μg/mL)atdiferent durationoftreatment(4,48and7h),cgir wereelevatedwithconcentrationincrementandelongationoftime ( 犘 < 0.05).5)Treatmentwith500μg/mLofSmacN7combinedwithdiferentconcentrationofTRAIL (00,500,000and 500ng/mL)andGEM (0,0,40and60μmol/L),theCGIRpercentagewereincreasedwiththeconcentrationelevation (8.%,37.67%,4.63% and67.60% intrail,7.65%,3.85%,40.% and74.99% in GEM respectively). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖犛 :SmacN7caninducepancreaticcancercelapoptosisinaconcentration andtime dependentmanner,de creasedexpressionofxiapandincreasedexpressionofcytocandp7ofcaspase 3bio activefragmentmaybetheun derlyingmechanism.smacn7maybecomeanewoptionforpancreaticcancertreatment. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] pancreaticneoplasms;smacn7;sw990;apoptosis 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(8): 中图分类号 R735.9 文献标识码 A 文章编号 (03) 胰腺癌 (Pancreaticcancer) 是临床上常见的消化系统恶性肿瘤, 发病率全球均出现明显上升趋势 根据 GLOBOCAN008 的数据, 胰腺癌世界人口标准化发病率 ( 世标率 ) 男性 4.5/0 万, 女性 3.3/0 万 美 [] 国胰腺癌死亡率居恶性肿瘤死因第 4 位, 我国居第 [] 0 位, 且早期诊断十分困难, 大多数患者确诊时已属肿瘤晚期或是发生了转移, 手术切除率低, 中位生存期短 目前胰腺癌的治疗主要以手术治疗为主, 辅以化疗 放疗 分子靶向治疗 介入治疗 高强度聚焦超声 (HIFU) 治疗 基因治疗及免疫治疗等的综合治疗 对于局部晚期胰腺癌患者, 联合放化疗相对于单用放疗或化疗可以明显提高 6 个月 和 3 年的总生存 [3] 率, 还可以提高瘤灶显效率和胰腺癌疼痛缓解率, 却 [4 6] 增加了不良反应 自 996 年美国 FDA 批准吉西他滨 (GEM) 取代 5 FU 用于治疗晚期胰腺癌至今, 虽然试用了多种药物和方法, 但是晚期胰腺癌患者生存时间并没有根本改善 因此, 本研究模拟合成类 Smac 小分子 SmacN7, 以期找到治疗胰腺癌的新方法 材料与方法. 实验材料人胰腺癌细胞株 SW990 由山东省肿瘤防治研究院 山东省医药卫生肿瘤外科重点实验室保种传代, 各种合成肽单体购于西安联美生物科技有限公司 ; RPMI640 培养液购于 GIBCO 公司,TRAIL 购于加拿大 Chemicon 公司,GEM 购于 LilyFranceS.A. 公司, 辣根酶标记羊抗兔及羊抗鼠二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司,Heochst3334 购于美国 in vitrogen 公司 ; 四甲基氮唑盐 (MTT) 二甲基亚砜 (DMSO) 购于美国 Sigma 公司,Annexin Ⅴ FITC 试剂盒购于美国 Alexis 公司 CO 培养箱 (Heraeus40) 和高速低温离心机 (HeraeusPrimoR) 购于德国 HERAEUS 公司, 真空干燥箱 (DZF 6050) 和漩涡振荡器 (XW 80A) 磁力搅拌器购于上海精宏公司, 电子天平 (MP00A) 购于上海精科公司, 普通双目显微镜 倒置相差显微镜 (O LYMPUS 7) 和荧光显微镜购于日本 OLYMPUS 公司, 超低温冰箱 (MDFU50L) 购于日本 SANYO 公司, 电热恒温水浴箱 (HS 4) 购于江苏太仓科教器材厂, 超净工作台购于苏州苏净公司, 一次性各种型号塑料培养皿 培养瓶和培养板购于美国 Costar 公司, 微量移液器购于德国 Eppendorf 公司. 方法.. SmacN7 合成以 SmacN 端 AVPI 四肽结构为基础, 选择与成熟 SmacAVPI 结合 XIAP BIR3 的 KD 值相似的七肽 AVPIAQK 为合成序列, 具有细胞膜穿透性的果蝇触角因子序列 RQIKIWFQNRRMK WKK 为载体肽, 中间以脯氨酸 (P) 相连, 利用人工标准固相合成方案 (SPPS), 将单个氨基酸顺序加在 AV PI 的 C 端并在末端进行生物素标记 固相支持剂为树脂, 流动相为 0.% 三氟乙酸 (TFA) 水溶液 /0.% TFA CH3CN 水溶液, 经过多步反应合成目标多肽 利用反相高效液相层析法 (RP HPLC), 使用 Waters 600E HPLC 仪 C8 柱 (C8Column,0 50 mm) 进行纯化, 旋转蒸发仪真空抽干, 低温冷冻, 干燥后收集结晶物, 电子天平称量, mg/ 瓶分装,-0 保存备用 使用时根据需要用 PBS 液配制成 和 500μg/mL 不同浓度 SmacN7 合成流程图 ( 图 )

3 566 吴义高, 等 mir 05 对肾上腺皮质癌 SW 3 细胞转移潜能影响的研究 犿犻犚 05 对肾上腺皮质癌犛犠 3 细胞转移潜能影响的研究 吴义高王尉胡卫列肖戈徐文清 前沿报道 / 论著 广州军区广州总医院泌尿外科 全军泌尿外科中心 广州军区泌尿外科研究所, 广东广州 5000 摘要 目的 : 通过调控 mir 05 在肾上腺皮质癌 (ACC) 细胞株 SW 3 中的表达, 探讨 mir 05 对 SW 3 细胞生物学行为的影响 方法 : 通过基因重组技术构建 pcdna3.(+) mir 05 重组质粒并合成 mir 05 的反义寡核苷酸作为反向对照, 调控 mir 05 在肾上腺皮质癌 SW 3 细胞中表达, 实时荧光定量 PCR 法验证 mir 05 表达情况 ; 分别采用 MTS EdU TUNNEL 及 Transwel 小室法, 检测过表达及抑制 mir 05 对增殖 凋亡及侵袭的影响 结果 : 在转染 pcdna3.(+) mir 05 及 mir 05 反义寡核苷酸后,SW 3 细胞中 mir 05 分别上调了 63. 倍 ( 犘 =0.00) 及下调了 86.3%( 犘 =0.00) MTS 结果显示, 在 和 96h 时,miR 05 上调后 SW 3 细胞增殖率下降了 (0.50±.80)% (3.67±4.80)% (30.9±5.40)% 和 (38.34±6.0)%, 犘值分别为 和 0.03;miR 05 下调后增殖率提高了 (5.3± 3.0)% (3.5±4.60)% (40.5±4.0)% 和 (38.34±6.0)%, 犘值分别为 和 0.03 TUNNEL 结果显示,pcDNA3.(+) mir 05 组 SW 3 细胞凋亡数为 (46±4) 个,pcDNA3.(+) 组为 (5±3) 个, 犘 =0.009;anti mir 05 转染组为 (±) 个, 空白组为 (5±3) 个, 犘 =0.005 Transwel 侵袭实验显示,pcDNA3.(+) mir 05 组穿过小室膜细胞数为 (43±8) 个,pcDNA3.(+) 组为 (0±5) 个, 犘 =0.004;anti mir 05 转染组为 (8±4) 个, 空白组为 (0± 0) 个, 犘 =0.009 结论:miR 05 通过抑制细胞增殖 侵袭并促进凋亡在 ACCSW 3 细胞中起抑癌作用 ; 成功构建 pcd NA3.(+) mir 05 真核表达质粒, 为进一步研究 mir 05 在 SW 3 细胞中的基因调控机制奠定基础 关键词 肾上腺皮质肿瘤 / 生物学 ;mirna;sw 3 细胞 ;mir 05 细胞凋亡 犈犳犲犮狋狊狅犳犿犻犚 05 狅狀狆狉狅犾犻犳犲狉犪狋犻狅狀, 犪狆狅狆狋狅狊犻狊犪狀犱犻狀狏犪狊犻狏犲犪犫犻犾犻狋犻犲狊狅犳犪犱狉犲狀狅犮狅狉狋犻犮犪犾犮犪狉犮犻狀狅犿犪犮犲犾犾犻狀犲犛犠 3 中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犠犝犢犻 犵犪狅, 犠犃犖犌犠犲犻, 犎犝犠犲犻 犾犻犲, 犡犐犃犗犌犲, 犡犝犠犲狀 狇犻狀犵犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犝狉狅犾狅犵狔, 犌狌犪狀犵狕犺狅狌犌犲狀犲狉犪犾犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犌狌犪狀犵狕犺狅狌犕犻犾犻狋犪狉狔犆狅犿犿犪狀犱, 犝狉狅犾狅犵狔犛狌狉犵犲狉狔犆犲狀狋犲狉, 犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犝狉狅犾狅犵狔犛狌狉犵犲狉狔, 犌狌犪狀犵狕犺狅狌 5000, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToinvestigatetheefectofmiR 05onSW 3celproliferation,apoptosisandinvasiveabili tiesbyregulatingtheexpressionofmir 05inadrenocorticalcarcinomaSW 3celline. 犕犈犜犎犗犇犛 :Toregulatetheex pressionofmir 05inadrenocorticalcarcinomaSW 3cellinebyrecombinantDNAtechnologytoconstructthepcD NA3.(+) mir 05recombinantplasmidandsynthesizingantisenseoligonucleotidesofmiR 05asthereversecontrol, TheexpressionofmiR 05 mrna wasdetectedbyreal timefluorogenicquantitative PCR(qRT PCR).Theefectsof pcdna3.(+) mir 05onSW 3celproliferation,apoptosisandinvasiveabilitiesweredetectedby MTS,EdU,TUN NELandTranswelchambermethods,respectively. 犚犈犛犝犔犜犛 :qrt PCRresultsrevealedthatmiR 05wasincreasedby 63.fold ( 犘 =0.00)andreducedby86.3% ( 犘 =0.00)inSW 3celsafterpcDNA3. (+) mir 05andmiR 05 antisenseoligonucleotidestransfectedrespectively.themtsresultssuggestedthattherateofcelproliferationofsw 3 wasdeclined(0.50±.80)%,(3.67±4.80)%,(30.79±5.40)% and(38.34±6.0)% aftertheupregulationofmir 05in4,48,7and96h ( 犘 valueswere0.04,0.04,0.06and0.03),whiletherate wasincreased (5.3± 3.0)%,(3.5±4.60)%,(40.5±4.0)% and(38.34±6.0)% afterthedownregulationofmir 05 ( 犘 valueswere 0.03,0.06,0.0and0.03).TheTUNNELresultsindicatedthatthenumberofSW 3apoptoticcelswere(46±4) and (5±3)pervisioninpcDNA3. (+) mir 05groupandpcDNA3. (+)group ( 犘 =0.009),While(±)and (5±3)pervisioninanti mir 05groupandblankgroup ( 犘 =0.005).Transwelinvasionassayfoundthatthenumberof 基金项目 国家自然科学基金 (874); 国家自然科学基金青年科学基金 (8004) 第一作者简介 吴义高, 男, 安徽安庆人, 硕士, 主要从事肾上腺肿瘤的基础研究工作 Tel: E mail:xiaomaowang006@63.com 通讯作者简介 胡卫列, 男, 安徽合肥人, 教授, 博士生导师, 主要从事泌尿系肿瘤基础与临床的研究工作 Tel: E mail:huwl mr@vip.sina.com

4 中华肿瘤防治杂志 03 年 4 月第 0 卷第 8 期 CHINJCANCERPREV TREAT,April03,Vol.0 No SW 3celsthroughthesmalroomfilm were(43±8)and(0±5)pervisioninpcdna3. (+) mir 05groupandpcD NA3. (+)group(p=0.004),while(8±4)and (0±0)pervisioninanti mir 05groupandblankgroup ( 犘 = 0.009). 犆犗犖犆犔犝犖犛犐犗犖犛 :mir 05mayplayatumorsuppressorroleinadrenocorticalcarcinomaSW 3celsthroughinhibi tingcelproliferation,invasionandpromotingapoptosis.theeukaryoticexpressionvectorofmir 05isconstructedsuccessfuly, whichprovidemir 05anexperimentalbasisforfurtherstudyofgeneregulationmechanismsintumors. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] adrenalcortexneoplasms/biology;mirna;sw 3cel;miR 05apoptosis 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(8): 中图分类号 R736.6 文献标识码 A 文章编号 (03) micrornas(mirnas) 是一类生物体内参与转录后基因调控的非编蛋白质单链小分子 RNA, 研究表明,miRNAs 与靶基因 mrna 的 3 UTR 部分或完全结合, 引起靶 mrnas 的降解或翻译抑制, 从而调控人 [ ] 体内 30% 以上的基因表达 研究发现,miR 05 参与了细胞的增殖 分化 凋亡及侵袭等, 并在多种肿瘤 [3 4] 发生 发展中起癌基因或抑癌基因的作用 Adachi [5] 等研究发现,miR 05 在肺癌中与 erbb 信号通路密切相关,erbB 基因的过表达会引起 mir 05 表达降低和相关细胞周期蛋白的升高 ; 同时也有研究表明, 在肾癌中 mir 05 抑制了 Src 介导的肿瘤信号通路, [6] 与肿瘤预后相关 本研究构建了 mir 05 真核表达载体及合成 mir 05 反义核苷酸, 调控 SW 3 细胞中 mir 05 表达, 观察其对肾上腺皮质癌 (ACC) SW 3 细胞增殖 凋亡和侵袭的影响 材料与方法. 材料人肾上腺皮质癌细胞株 SW 3 由广州军区广州总医院实验室提供 ; 载体 pcdna3.(+ ) E.coli DH5α 感受态细胞为南方医科大学肿瘤研究所保存 ; Lipofectamine TM 000 Trizol 试剂和质粒抽提试剂盒购自 Invitrogen 公司 ;G48 LATaq 聚合酶 T4DNA Ligase HindⅢ XhoⅠ 限制性内切酶 DNA marker DNA 胶回收试剂盒 SYBR GreenPCR Master Mix 和 PrimeSTAR R HSDNA Polymerase 均为 TaKaRa 公司产品 ; 胎牛血清 LeibovitzL 5 培养基购自 Hy clone 公司 ;celtiter96aq 单溶液细胞增殖检测试剂盒购自 Promega 公司 ;TUNEEL 细胞凋亡试剂盒购自南京凯基公司 ;EdU 细胞增殖检测试剂购自广州锐博生物 ;Transwel 小室购自美国 Corning 公司. 方法.. pcdna3.(+) mir 05 的构建从 mir base 数据库中查找获得 hsa mir 05 的前体序列, 取其上下游侧翼序列各约 00bp 序列设计引物, 并插入限制性内切酶 HindⅢ 和 XhoⅠ 上游引物 :5 CCC AAGCTTCTGGGTGGCTGTTTTGAAAAC 3 ; 下 游引物 :5 CCGCTCGAGGAAGCA CGCACACTC CAGATG 3 以人正常肾上腺皮质细胞基因组 DNA 尾模板, 引物在 DNA Polymerase 酶作用下进行 PCR 扩增反应, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,DNA 凝胶回收试剂盒回收目的产物 将 pcdna3.(+) 目的产物经 HindⅢ 和 XhoⅠ 限制性内切酶双酶切, 获得线性化空载体及目的基因片段, 并在 T4DNA Ligase 作用后转染 E.coliDH5α 感受态细胞, 在含氨苄青霉素 (Amp) 的 LB 平板上 37 过夜培养 质粒提取纯化试剂盒提取质粒, 进行 HindⅢ XhoⅠ 双酶切鉴定, 最后将酶切鉴定正确的克隆送华大基因公司测序和序列比对分析.. mir 05 反义核苷酸的合成根据 mir 05 的 mrna 互补序列合成 mir 05 的反义核苷酸 (anti mir 05):5 CAGACTCCGGTGGAATGAAGAC AGACTCCGGTGGAATGAAGGA 3, 串联 3 次, 互补序列由上海生工生物公司合成..3 mir 05 表达的检测采用细胞转染及实时定量 PCR 检测, 实验分为 4 组 :)pcdna3.(+ ) mir 05 组 ;)pcdna3.(+) 空载体组 ;3)anti mir 05 组 ;4) 空白对照组 按 Lipofectamine TM 000 试剂说明书进行转染 pcdna3.(+) mir 05 组在转染后采用 G48 抗生素压力筛选,8 周后获得 mir 05 过表达稳定细胞株,pcDNA3.(+) 空载体作为对照 ; anti mir 05 组在转染 mir 05 反义核苷酸 48h 后即进行下一步实验 按照 Trizol 试剂说明书提取各组细胞总 RNA, 纯度检测 A 60 /A 80 的比值均 >.8, 基因特异性引物在反转录酶作用下合成得第一链 cdna 为模板, 以 U6 为内参照,SYBRGreen 法进行 PCR 扩增, PCR 引物序列为 has mir 05F:5 ACACTCCAGC TGGGTCCTTCATTCCACCGGAG 3,has mir 05 R:5 CTCAACTGGTGTCGTGGA 3 PCR 反应条件 :95 变性 5s,65 退火 5s,7 荧光检测 3s, 重复 40 个循环 60~95 绘制溶解曲线, 每个样品重复 3 次 mir 05 的 mrna 相对表达量采用 -ΔΔCt 相对定量法计算..4 SW 3 细胞增殖的检测采用新型四唑氮盐

5 57 周永春, 等 Sox4 表达抑制对宣威地区女性肺癌细胞凋亡影响及其机制的探讨 犛狅狓 4 表达抑制对宣威地区女性肺癌细胞凋亡影响及其机制的探讨 前沿报道 / 论著 周永春 陈艳 王熙才 黄尤光 金从国 姚乾 杨世华 刘馨 黄云超. 昆明医科大学第三附属医院 云南省肿瘤研究所, 云南昆明 昆明理工大学生命科学与技术学院, 云南昆明 摘要 目的 : 研究靶向抑制 sox4 基因的表达对宣威地区女性肺癌细胞凋亡的影响, 并初步探讨其作用机制 方法 : 构建靶向抑制转录因子 sox4 的 shrna 重组载体 pgfp V RS sox4shrna 并转染宣威地区女性肺癌细胞 XWLC 05, 以转染 pgfp V RS scramshrna 的 XWLC 05 细胞及亲本 XWLC 05 细胞作为对照, 研究 sox4 表达抑制对 Caspase 3 表达 细胞形态 细胞周期和凋亡率等凋亡指标的影响 使用 Caspase 3 抑制剂 z VAD FMK 处理转染细胞, 检测上述细胞凋亡指标 结果 : 成功构建了能高效抑制 sox4 基因表达的 pgfp V RS A sox4shrna 重组载体 ; 转染后 48 及 7h, 实验组细胞 sox4mrna 表达水平分别为 0.09±0.08 及 0.44±0.06, 比转染后 4h 降低了 88% 和 40%, 与同一时段中的阴性对照及空白对照组相比表达水平明显降低 ( 犘 <0.05), 其中以转染后 48h 的抑制最为明显, 而 Caspase 3mRNA 表达与阴性对照及空白对照组相比均明显升高 ( 犘 <0.05), 以 48h 升高最明显 ; 空白对照组与阴性对照组间比较, 转染 48 及 7h 后 sox4mrna( 犘 =0.07; 犘 =0.063) 和 Caspase 3 mrna( 犘 =0.03; 犘 =0.9) 的表达水平差异无统计学意义 ; 抑制 sox4 基因的表达后细胞出现典型的凋亡形态学改变 ; 流式细胞术 (FCM) 检测显示, 转染干扰质粒后 48h, 细胞出现明显的亚二倍体峰, 实验组细胞的凋亡率平均为 (34.8±3.37)%, 显著高于阴性对照组 (0.45±0.05)% 及空白对照组 (0.44±0.06)%, 犘均为 经 z VAD FMK 阻断 Caspase 3 酶活性后, 实验组细胞中活化的 Caspase 3 (3.6±.76)% 显著低于阴性对照组 (50.5±6.5)%, 差异有统计学意义, 犘 =0.000; 实验组细胞的凋亡率 (0.8±.05)% 也明显低于阴性对照组细胞 (38.3±3.6)%, 犘 =0.000 结论: 抑制 sox4 的表达可促进宣威地区女性肺癌细胞凋亡 ; 转录因子 sox4 可能通过抑制 Caspase 3 依赖的凋亡途径而促进宣威地区女性肺癌的发生发展 关键词 sox4; 女性 ; 肺肿瘤 ; 宣威 ; 细胞凋亡 ; 基因表达 犛狅狓 4 狋犪狉犵犲狋犲犱犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋狊狅狀犾狌狀犵犮犪狀犮犲狉犮犲犾犪狆狅狆狋狅狊犻狊狅犳犡狌犪狀狑犲犻犳犲犿犪犾犲狆犪狋犻犲狀狋狊犪狀犱犻狋狊犿犲犮犺犪狀犻狊犿狉犲狊犲犪狉犮犺 中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犣犎犗犝犢狅狀犵 犮犺狌狀, 犆犎犈犖犢犪狀, 犠犃犖犌犡犻 犮犪犻, 犎犝犃犖犌犢狅狌 犵狌犪狀犵, 犑犐犖犆狅狀犵 犵狌狅, 犢犃犗犙犻犪狀, 犢犃犖犌犛犺犻 犺狌犪, 犔犐犝犡犻狀, 犎犝犃犖犌犢狌狀 犮犺犪狅. 犜狌犿狅狉犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲, 犜犺犻狉犱犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犓狌狀犿犻狀犵犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犓狌狀犿犻狀犵 6508, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔, 犓狌狀犿犻狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔, 犓狌狀犿犻狀犵 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Tostudytheefectsoftargetedinhibitingsox4geneexpressiononpromotingapoptosisofXuanwei femalelungcancercelsanditspossiblemechanisminvitro. 犕犈犜犎犗犇犛 :RecombinantplasmidpGFP V RS sox4shrna was constructedandtransfectedintoxuanweifemalelungcancercellinexwlc 05toinhibittheexpressionoftranscription factorsox4takingparentalxwlc 05celsandthecelstransfectedbyblasmidpGFP V RS scramshrna ascontrol. ThencelapoptosiswasidentifiedbyanalyzingexpressionofCaspase 3,celcycle,morphologyandapoptosisrateoftransfect edcelstreatedwithorwithoutcaspase 3inhibitorz VAD FMK. 犚犈犛犝犔犜犛 :RecombinantplasmidpGFP V RS A sox4shrna wassuccessfulyconstructedandeficientlytransfectedintoxwlc 05cels.Thesox4mRNAexpressioninsox4inhibited celswas0.09±0.08and0.44±0.06at48hand7haftertransfection,decreased88% and40% whencomparedwith 本研究中与第一作者贡献相同 基金项目 国家自然科学基金 ( ); 云南省卫生厅应用基础研究项目 (00NS078); 云南省科技厅 昆明医科大学联合专项基金 (0FB067) 第一作者简介 周永春, 女, 重庆人, 博士, 主治医师, 主要从事肺癌的分子机制研究工作 Tel: E mail:chungui765@63.com 通讯作者简介 黄云超, 男, 云南昭通人, 教授, 博士生导师, 主要从事肺癌的临床研究工作 Tel: E mail:huangych00@yahoo.com.cn

6 中华肿瘤防治杂志 03 年 4 月第 0 卷第 8 期 CHINJCANCERPREV TREAT,April03,Vol.0 No theexpressionat4h,andtheirexpressionwassignificantlylowerthanthatinthenegativecontrolandblankcontrolin thesameperiod( 犘 <0.05).Theinhibitionefectwasmostobviousat48haftertransfection.TheCaspase 3mRNAand proteinweresignificantlyup regulated48hand7haftertransfectionwhencomparedwithnon transfectedcels ( 犘 < 0.05).Therewasnosignificantdiferenceinthesox4mRNAexpressionlevelbetweenblankandnegativecontrolat48h and7h( 犘 =0.07; 犘 =0.063)afterplasmidtransfection,alsoofCaspase 3 mrnaexpression( 犘 =0.03; 犘 =0.9). Thetypicalapoptosismorphologicalchangeswereobservedinsox4 inhibitedcelsbymicroscope.therewasobvioussub Gpeakinsox4 inhibitedcelsandtheiraverageapoptosisrate(34.8±3.37)% wassignificantlyhigherthanthatinthe negativecontrol(0.45±0.05)% andblankcontrol(0.44±0.06)% (both 犘 were0.000)48haftertransfection.after treatingwithz VAD FMK,theactivatedCaspase 3ofsox4inhibitedcels (3.6±.76)% wassignificantlylowerthan thatinthenegativecontrol(50.5±6.5)% ( 犘 =0.000)andtheirapoptosisrate(0.8±.05)% alsolowerthanthatin thenegativecontrol(38.3±3.6)%( 犘 =0.000). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖犛 :Inhibitionofsox4expressioncanpromotetheapopto sisofxwlc 05cels;Transcriptionfactorsox4mayplayanimportantroleinoccurrenceandprogressofXuanweifemale lungcancerthroughinhibitingthecaspase 3dependentapoptosispathway. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] sox4;female;lungneoplasms;xuanwei;apoptosis;geneexpression 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(8): 中图分类号 R734. 文献标识码 A 文章编号 (03) 云南省宣威地区位于中国西南部及云南省东北部乌蒙山区, 拥有人口约 30 万, 当地女性肺癌的死亡率从 0 世纪 70 年代以来持续上升, 部分地区高达 0/0 万, 远高于中国女性平均水平 (.9/0 万 ), 且临床上表现出发病年轻化 对常规放疗及化疗不敏感性的特 [ ] 性 sox4 属于 sox(sexdeterminationregionofy chromosome relatedbox) 家族中的 C 亚族, 其特征为编码的蛋白质中含有一个 HMG(highmobilitygroup) 蛋白结构域, 通过与 DNA 中的 ATATCAAATG 序列结 [3] 合发挥转录因子的作用 前期研究证实, 转录因子 sox4 在宣威地区女性肺癌中的表达显著高于其他地区女性肺癌, 且采用 sirna 抑制 sox4 的表达可显著降低 [4] 宣威地区女性肺癌细胞的迁移及转移能力 本研究在此基础上深入研究稳定表达 sox4 shrna 的重组质粒对宣威地区女性肺癌细胞凋亡的影响并探讨其作用机制, 为研发宣威地区女性肺癌的早期诊断筛查分子标志和潜在的干预或治疗靶点提供实验依据 材料与方法. 细胞株和试剂 宣威地区女性肺癌细胞株 XWLC 05 由昆明医科大学第一附属医院提供, 实验用细胞为第 9 代,RP MI640 培养液 opti MEM 培养液和胎牛血清购自美国 Gibco 公司,cDNA 合成和 SYBGreen 实时荧光定量 PCR 试剂盒购自美国 Bio Rad 公司,sox4 Caspase 3 及 GAPDH 基因引物由生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司合成,sox4 及 β actin 兔抗人单克隆抗体购自美国 Mili pore 公司,Caspase 3 兔抗人多克隆抗体购自北京 Bioss 公司, 鼠抗兔二抗和 ECLPlus 购自瑞典 Amersham 公司, 质粒的构建由美国 Origene 公司完成,Caspase 3 抑 制剂 z VAD FMK 购自美国 Promega 公司, 流式细胞术 (FCM) 检测 Caspase 3 试剂盒购自美国 Calbiochem 公司,COULTER R DNA PREP TM 及 Tunel 检测试剂盒购自美国 Beckman 公司. 重组质粒的构建和扩增转化及鉴定.. 质粒的构建从 GENEBANK 中查获人 sox4 基因的已知序列信息 ( 编号 :00307.), 按 sirna 设计原则设计针对不同靶点的 sirna, 序列提交 Origen 公司进行筛选 优化及纯化, 分别构建针对 sox4 基因上 4 个不同靶点的 shrna 片段及阴性对照, 序列如下 :pg FP V RS sox4shrna 为 AAGGTGAAGTCCGGCA ACGCCAACTCCAG,pGFP V RS sox4shrna 为 GG CAAGCACCTGGCGGAGAAGAAGGTGAA,pGFP V RS sox4shrna 3 为 AAGGTGAAGCGCGTCTACCT GTTCGGCGG,pGFP V RS sox4shrna 4 为 AGCAA ACCGCACGCCAAGCTCATCCTGGC,pGFP V RS A scramshrna 为 GCACTACCAGAGCTAACTCAGAT AGTACT 经 BLAST 分析排除与其他非相关基因序列同源, 在克隆位点 BamHⅠ/HindⅢ 处插入 pgfp V RS 空质粒中, 重组质粒含绿色荧光蛋白 (greenfluores centprotein,gfp) 序列, 稳定筛选标志为嘌呤霉素.. 质粒的扩增转化及鉴定将 pgfp V RS sox4shrna 重组质粒加入己制备好的 0μL DH5α 感受态细胞中混匀, 通过冷却热激后, 加入 600μL 无抗 LB 培养基 (5μg/mL) 震荡培养 ~3h 以活化抗性基因, 取 00μL 培养物涂布于 LB 卡拉霉素抗性 (5μg/mL) 平板,37 倒置培养过夜后挑克隆接种于含卡那霉素抗性的 LB 液体培养基中,37 恒温摇床培养至对数生长期, 按试剂盒 (QIAGEN, 美国 ) 说明书抽提质粒 抽提的质粒送测序, 测序引物为 AT

7 580 司马秀田, 等 mir 靶基因 IL A3 UTR 插入 / 缺失多态性与脑胶质瘤关联分析 犿犻犚 靶基因犐犔 犃 3 犝犜犚插入 / 缺失多态性与脑胶质瘤关联分析 司马秀田刘浩杨燕武周培志胡鑫游潮 四川大学华西医院神经外科, 四川成都 6004 流行病学研究 / 论著 摘要 目的 : 调查 mir 靶基因白细胞介素 A(IL A)3 翻译区 (3 UTR) 插入 (ins)/ 缺失 (del) 多态性 (rs ) 与脑胶质瘤的关联 方法 : 采用聚合酶链反应检测 6 例脑胶质瘤患者和 06 名正常对照组人群 rs 多态性 结果 : 对照组中 del/del ins/del 和 ins/ins 基因型频率分别为 37.9% 48.% 和 4.%; 脑胶质瘤组中各基因型频率分别为 47.8% 44.7% 和 7.5% 与 del/del 基因型相比,ins/ins 基因型显著降低了脑胶质瘤的发病风险,OR=0.4,95%CI: 0.0~0.88, χ =5.45, 犘 =0.0 对照组中 del 和 ins 等位基因频率分别为 6.9% 和 38.%; 脑胶质瘤组中两等位基因频率分别为 70.% 和 9.8% 与 del 等位基因相比,ins 等位基因显著降低了脑胶质瘤的发病风险,OR=0.69,95%CI: 0.5~0.94, χ =5.50, 犘 =0.09 根据脑胶质瘤病理分级进行分层分析,ins 和 del 等位基因在 Ⅰ~Ⅱ 级中的频率分别为 69.5% 和 30.5%, 在 Ⅲ~Ⅳ 级中的频率分别为 7.% 和 8.8%, 两者相比差异无统计学意义, 犘 >0.05 结论 :mir 靶基因 IL A3 UTR 区插入 / 缺失多态性 (rs ) 与脑胶质瘤发病相关 关键词 微小 RNA ; 白细胞介素 A; 多态性 ; 脑胶质瘤 中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犃狊狅犮犻犪狋犻狅狀犫犲狋狑犲犲狀犪狀犻狀狊犲狉狋犻狅狀 / 犱犲犾犲狋犻狅狀狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿犪狋犿犻犚犖犃 犫犻狀犱犻狀犵狊犻狋犲犻狀狋犺犲 3 狌狀狋狉犪狀狊犾犪狋犲犱狉犲犵犻狅狀狅犳犻狀狋犲狉犾犲狌犽犻狀 犃犪狀犱狉犻狊犽狅犳犵犾犻狅犿犪 犛犐犕犃犡犻狌 狋犻犪狀, 犔犐犝犎犪狅, 犢犃犖犌犢犪狀 狑狌, 犣犎犗犝犘犲犻 狕犺犻, 犎犝犡犻狀, 犢犗犝犆犺犪狅犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犖犲狌狉狅狊狌狉犵犲狉狔, 犠犲狊狋犆犺犻狀犪犎狅狊狆犻狋犪犾, 犛犻犮犺狌犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犆犺犲狀犵犱狌 6004, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Toinvestigatetheassociationbetweenaninsertion/deletionpolymorphism (rs )at mirna bindingsiteinthe3 untranslatedregion (3 UTR)ofinterleukin A (IL A)andriskofglioma. 犕犈犜犎 犗犇犛 :Thers polymorphism wasgenotypedin6patientswithgliomaand06healthycontrolsusingpolymerase chainreactionassay. 犚犈犛犝犔犜犛 :Thefrequenciesofdel/del,ins/del,andins/insgenotypesofrs were37.9%, 48.% and4.%incontrols;and47.8%,44.7% and7.5%inpatientswithglioma,respectively.theins/insgenotype wasassociatedwithasignificantlydecreasedriskofgliomacompared withthedel/delgenotype (OR=0.4,95%CI: , χ = 5.45, 犘 =0.0).Thefrequenciesofdelandinsalelesofrs were6.9% and38.% incon trols;and70.% and9.8%inpatientswithglioma,respectively.theinsalelewasassociatedwithasignificantlyre ducedriskofgliomacomparedwiththedelalele(or=0.69,95%ci: , χ =5.50, 犘 =0.09).Whenstratifi cationanalysisaccordingtopathologicalgrade,thefrequenciesofinsanddelalelewere69.5% and30.5%ingradesⅠ- Ⅱ,and7.% and8.8% ingrades Ⅲ - Ⅳ.Nosignificantassociationwasobservedbetweenthers polymor phismandpathologicalgrade( 犘 >0.05). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :Theinsertion/deletionpolymorphism (rs )atmirna bindingsiteinthe3 UTRofIL Aisrelatedtothedevelopmentofglioma. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] MiR ;interleukin A;polymorphism;glioma 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(8): 中图分类号 R739.9 文献标识码 A 文章编号 (03) 第一作者简介 司马秀田, 男, 吉林白城人, 博士, 主治医师, 主要从事神经外科学的临床研究工作 Tel: E mail:simaxiutian@63.com 通讯作者简介 游潮, 男, 四川南部人, 教授, 博士生导师, 主要从事神经外科学的临床研究工作 Tel: E mail:youchao977@63.com

8 中华肿瘤防治杂志 03 年 4 月第 0 卷第 8 期 CHINJCANCERPREV TREAT,April03,Vol.0 No 实验研究 / 论著 犞犈犌犉 犆基因沉默对裸鼠移植乳腺癌淋巴管和血管生成影响的观察 吴雪芹岑洪谭晓虹李蓉郭宝平何莎 广西医科大学附属肿瘤医院化疗三科, 广西南宁 5300 摘要 目的 : 探讨血管内皮生长因子 C(VEGF C) 基因沉默对裸鼠移植乳腺癌淋巴管和血管生成的影响 方法 : 构建 VEGF C 小分子干扰 RNA(VEGF C/SiRNA) 慢病毒载体, 转染靶细胞 MCF 7,Real timepcr 检测 VEGF C 敲减效率, 将其接种于裸小鼠背部皮下 (KD 组 ), 并设置 MCF 7 细胞对照组 (CON 组 ) 及空载体对照组 (NC 组 ), 观察裸小鼠的成瘤情况, 通过免疫组化检测 VEGF C 表达 微血管密度 (MVD) 及微淋巴管密度 (LVD) 结果 :VEGF C/SiRNA 转染 MCF 7 细胞后, 与对照组相比,VEGF C 表达显著降低, 敲减效率为 49.%, 犘 =0.07 接种后各组细胞均能成瘤,KD 组 6 只,NC 组 7 只,CON 组 8 只, 成瘤情况差异无统计学意义, 犘 =0.63 HE 染色结果显示,KD 组可见肿瘤细胞明显减少, 出现较多凋亡和坏死细胞 免疫组化检测显示,CON 组 VEGF C 蛋白表达 (+) 只,(++) 只,(+++)4 只 ;NC 组表达 (++) 只,(+++)5 只 ;KD 组表达 (+)5 只,(++) 只,KD 组移植瘤 VEGF C 蛋白表达显著低于对照组, 犘 = 0.0 肿瘤组织内 LVD 计数,KD 组 5.33±.63,CON 组 8.50±.05,NC 组 8.7±.83,KD 组显著低于 NC 组和 CON 组, 差异有统计学意义, 犘 =0.005;MVD 计数,KD 组 8.83±.7,CON 组.0±.4,NC 组.7±.48,KD 组 MVD 略低于 CON 组及 NC 组, 但差异无统计学意义, 犘 =0.097 结论 : 慢病毒介导的 VEGF C/siRNA 可有效敲减 VEGF C 表达, 显著减少乳腺癌组织的淋巴管生成, 但对血管生成无显著影响 关键词 乳腺肿瘤 ; 血管内皮生长因子 C; 微血管密度 ; 微淋巴管密度 ; 裸, 小鼠 中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犈犳犲犮狋狊狅犳犞犈犌犉 犆犽狀狅犮犽犱狅狑狀狅狀犿犻犮狉狅狏犲狊狊犲犾犱犲狀狊犻狋狔犪狀犱犾狔犿狆犺犪狋犻犮犿犻犮狉狅狏犲狊犲犾犱犲狀狊犻狋狔狅犳狀狌犱犲犿犻犮犲狋狉犪狀狊狆犾犪狀狋犫狉犲犪狊狋犮犪狀犮犲狉 犠犝犡狌犲 狇犻狀, 犆犈犖犎狅狀犵, 犜犃犖犡犻犪狅 犺狅狀犵, 犔犐犚狅狀犵, 犌犝犗犅犪狅 狆犻狀犵, 犎犈犛犺犪犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犆犺犲犿狅狋犺犲狉犪狆狔 Ⅲ, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犆犪狀犮犲狉犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犌狌犪狀犵狓犻犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犖犪狀狀犻狀犵 5300, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToestablishthenudemousemodelwithbreastcancerMCF 7celsinwhichVEGF C was interferedwithlentivirus MediatedSmalInterferingRNA(VEGF C/siRNA),andinvestigatetherelationshipbetween VEGF Cexpressionandmicrovesseldensity (MVD)andlymphaticmicrovesseldensity (LVD). 犕犈犜犎犗犇犛 :VEGF C/ sirnavectorswereconstructedandtransductedintomcf 7breastcancercels,andrea timepcrwasperformedtode tectthemrnaexpressionofvegf C.The MCF 7celswhichtransfectedwithsiRNA Vectorswereinjectedintothe nudemouse,andthevolumeoftumorwasmeasured.thevegf Cexpression,MVDandLVDintransplanttumorswere detectedbyimmunohistochemistry. 犚犈犛犝犔犜犛 :VEGF Cgeneexpressionwasdown regulatedsignificantlyin VEGF C/ sirnainterfered MCF 7celsby49.%( 犘 =0.07).Thetransplanttumorcouldgrowin3groupsofnudemice,6inKD group,7inncgroup,8incongroup.celnumberoftransplanttumorinkdgroupdecreased,andapoptosisandnecro siswereobservedinmanycancercelswithhestaining.theimmunohistochemicalresultsshowedthatvegf Cprotein expressioninkdgroupwasdecreasedsignificantly(congroup:+,++,4+++;ncgroup:++,5+++;kdgroup: 5+,++, 犘 =0.0).LVD were5.33±.63,8.7±.83,and8.50±.05inkdgroup,ncgroupandcongroup,re spectively.lvdinkdgroupwaslowersignificantly( 犘 =0.005).TherewasnotdiferenceofMVDinKDgroup(8.83±.7),NCgroup (.7±.48)andCONgroup (.0±.4, 犘 =0.097). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :TheVEGF Cexpression canbesuccessfulyknockeddownwithvegf C/siRNALentivirus,VEGF Ccanstimulatetumorlymphangiogenesisand havenoefectontumorangiogenesis. 第一作者简介 吴雪芹, 女, 湖北宜昌人, 硕士, 主要从事肿瘤侵袭转移机制的研究工作 Tel: E mail:59397@qq.com 通讯作者简介 岑洪, 男, 广西南宁人, 博士, 主任医师, 硕士生导师, 主要从事肿瘤内科治疗及肿瘤发病分子机制的研究工作 Tel: E mail:cen_hong@63.com

9 588 闫蔚, 等 Lg 诱导人胃癌细胞系 BGC 83 凋亡作用及机制的探讨 实验研究 / 论著 犔犵 诱导人胃癌细胞系犅犌犆 83 凋亡作用及机制的探讨 闫蔚, 吕同德 惠玲 王美亮 贾庆华 王晓辉 马明仁. 青海大学医学院, 青海西宁 兰州军区兰州总医院医学实验中心 甘肃省干细胞与基因药物重点实验室, 甘肃兰州 摘要 目的 : 研究新鬼臼毒素衍生物 4β 4 脱氧 氮取代的异亮氨酸 (5 FU 基 ) 戊醇酯 4 去甲表鬼臼 (Lg ) 对人胃癌细胞系 BGC 83 的诱导凋亡作用及机制 方法 : 噻唑蓝 (MTT) 流式细胞术和 Hoechs3358 染色分别检测 Lg 对 BGC 83 细胞增殖 细胞周期及凋亡的影响 荧光定量 RT PCR(qRT PCR) 检测药物处理后对 BGC 83 细胞凋亡相关基因 p53 Bax Bcl p 和 Caspase 3 表达的影响 结果 :Lg 对 BGC 83 细胞增殖具有明显剂量和时间依赖的抑制作用, 随药物浓度增加, 抑制效应增强, 药物浓度为 和 0μmol/L 时,Lg 对 BGC 83 的抑制率分别为 3.5% 30.8% 3.4% 和 5.%, 与依托泊苷 (Vp 6) 处理组 (3.5% 8.7% 0.9% 和.3%) 比较差异有统计学意义, 犘均 <0.0 随时间延长, 抑制作用逐渐增强,~60hLg 处理组对 BGC 83 的抑制率与 Vp 6 处理组比较差异有统计学意义,h 抑制率分别为 9.8% 和 8.0%, 犘 =0.00;4h 分别为.6% 和 9.0%, 犘 =0.0;36h 分别为 9.4% 和 6.%, 犘 =0.04;48h 分别为 44.% 和 4.%, 犘 =0.048;60h 分别为 65.4% 和 50.%, 犘 =0.00 细胞周期检测显示,Lg 作用 和 4h 后,G/M 期的细胞含量分别为 39.37% 和 74.36%, 与对照组及 Vp 6 组比较均明显增加, 而 G0/G 期细胞含量分别为 0.06% 和.5%, 较对照组及 Vp 6 组显著减少 Hoechst3358 染色显示,Lg 处理组细胞核固缩 碎裂 凋亡样改变, 药物处理后 Bcl mrna 的表达呈降低趋势,Vp 6 处理组 Bcl mrna 表达量为 0.748, Lg 处理组为 0.45, 而 p53 Bax p 和 Caspase 3 mrna 的表达呈增高趋势,Vp 6 处理组 mrna 表达量分别为 和.9,Lg 处理组分别为 和 3.097, 且 Lg 处理组作用优于 Vp 6 处理组 结论 :Lg 可抑制胃癌细胞增殖, 使细胞阻滞在 G/M 期, 该过程可能与其上调 p53 Bax p Caspase 3 表达和下调 Bcl 基因的表达有关 关键词 胃肿瘤 ; 鬼臼毒素 ; 细胞周期 ; 细胞凋亡 犐狀犱狌犮犻狀犵犲犳犲犮狋狅犳犔犵 狅狀犪狆狅狆狋狅狊犻狊狅犳犺狌犿犪狀犵犪狊狋狉犻犮犮犪狀犮犲狉犮犲犾犪狀犱犻狋狊犿犲犮犺犪狀犻狊犿 中华肿瘤防治杂志,03,0(8):588-59, 犢犃犖犠犲犻, 犔犝犜狅狀犵 犱犲, 犎犝犐犔犻狀犵, 犠犃犖犌犕犲犻 犾犻犪狀犵, 犑犐犃犙犻狀犵 犺狌犪, 犠犃犖犌犡犻犪狅 犺狌犻, 犕犃犕犻狀犵 狉犲狀. 犕犲犱犻犮犪犾犆狅犾犲犵犲狅犳犙犻狀犵犺犪犻犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犡犻狀犻狀犵 8000, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犈狓狆犲狉犻狀犲狀狋犪犾犆犲狀狋犲狉狅犳犕犲犱犻犮犻狀犲, 犌犲狀犲狉犪犾犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犔犪狀狕犺狅狌犕犻犾犻狋犪狉狔犆狅犿犿犪狀犱, 犓犲狔犔犪犫狅犳犛狋犲犿犆犲犾狊犪狀犱犌犲狀犲犇狉狌犵狊狅犳犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犲, 犔犪狀狕犺狅狌 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Tostudytheapoptosisinducingefectandits mechanism of4β N substituted isoleucine 5 FU pentylester 4 demethylepipodophylotoxin(lg )inhumangastriccancercellinebgc 83. 犕犈犜犎犗犇犛 :The efectoflg onbgc 83wasobservedbyMTT,flowcytometryandHoechs3358staining.Theapoptosisrelatedgenes p53,bax,bcl,pandcaspase 3expressionweredetectedbyfluorescentquantitativeRT PCR (qrt PCR). 犚犈犛犝犔犜犛 : Lg wasdemonstratedtoexertantiproliferativeactivityinadose andtime dependence.withtheincreaseofdrugconcen tration,depressantefectstrengthengradualy,drugconcentrationof0.0,0.,and0μmol/l,lg inhibitoryrateof BGC 83were3.5%,30.8%,3.4% and5.%,andtheinhibitionofdrugtreatmentgrouphadsignificantdiferenceto Vp 6treatmentgroup3.5%,8.7% 0.9% and.3% ( 犘 <0.0).Inaddition,theinhibitionhadpositivecorrelationto timeextend,fromto60hoflg inhibitoryrateofbgc 83were9.8%,.6%,9.4%,44.% and65.4%.italso 基金项目 兰州军区医药卫生科研计划项目 (CLZJB04); 甘肃省干细胞与基因药物重点实验室开放基金 (SG00) 第一作者简介 闫蔚, 女, 陕西西安人, 硕士, 主要从事基因与肿瘤治疗方面的研究工作 Tel: E mail:yanwei9867@yahoo.com 通讯作者简介 惠玲, 女, 陕西蒲城人, 博士, 副教授, 主要从事抗肿瘤药物及肿瘤相关基因功能的研究工作 Tel: E mail:zyhuil@hotmail.com

10 中华肿瘤防治杂志 03 年 4 月第 0 卷第 8 期 CHINJCANCERPREV TREAT,April03,Vol.0 No hadsignificantdiferencebetweenlg treatmentgroup (8.0%,9.0%,6.% and4.%)andvp 6treatmentgroup afterhto60h(h, 犘 =0.00;4h, 犘 =0.0;36h, 犘 =0.04;48h, 犘 =0.048;60h, 犘 =0.00).Theproportionof celsing0/gphasedecreasedwhiletheproportionofcelsing/m phaseincreasedafterand4hourstreatedwith Lg,and4hG/M phaseofthecelcontentswere39.37% and74.36%,g0/g phasecelcontentswere0.06% and.5%.nuclearchromatincondensationsandnuclearfragmentswerealsoobservedinlg groupcels.theex pressionofbcl mrnadecreased,theexpressionofbcl mrnain Vp 6treatmentgroupwas0.748,andLg was 0.45.whilep53,Bax,p,Caspase 3mRNAexpressionwereincreasedfolowingLg treatment,themrnaexpressions invp 6treatedgroupswere.074,.3,.88and.9;Lg groupswere.903,.393,.9and 犆犗犖犆犔犝 犛犐犗犖 :Lg showsobviousanticanceractivitybyinducingcelcyclearrestandregulatingtheexpressionofapoptosicrelat edgene. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] stomachneoplasms;podophylotoxin;celcycle;apoptosis 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(8): 中图分类号 R735. 文献标识码 A 文章编号 (03) 鬼臼毒素主要来源于小檗科的鬼臼属 八角莲属和山荷叶属等, 它具有显著的细胞毒性和抗肿瘤作 [] 用 目前临床上应用较为广泛的依托泊苷(Vp 6) 和替尼泊苷 (VM 6) 均为半合成鬼臼毒素衍生物, 对小细胞肺癌 睾丸癌 急性白血病 胶质瘤以及恶性淋 [] 巴肿瘤等均有良好的疗效 但两者仍存在耐药性 水溶性差, 严重的骨髓抑制以及口服效果差等缺点 为此, 学者们还在以鬼臼毒素为先导化合物进行结构 [3 4] 修饰和优化, 以期获得更加高效低毒的抗肿瘤药物 4β 4 脱氧 氮取代的异亮氨酸 (5 FU 基 ) 戊醇酯 4 去甲表鬼臼 (Lg ) 为新合成的一种鬼臼毒素衍生 [5] 物, 前期研究表明,Lg 有较好的抗肿瘤活性 本研究以胃腺癌 BGC 83 为研究对象, 研究新鬼臼毒素衍生物 Lg 对胃癌细胞生长 凋亡的影响及机制 材料与方法. 材料 Lg 由兰州大学化学化工学院提供, 相对分子质量为 7. 0, 纯度 95% 二甲基亚砜(DMSO) 配置成 0.00 mol/l 原液, 置 - 0 冻存备用 BGC 83 胃癌细胞株由兰州军区总医院医学实验室提供 RPMI640 DMSO 和噻唑蓝 (MTT) 购自美国 Sigma 公司, 胎牛血清购自杭州四季青公司,Ho echst3358 染色试剂盒购自碧云天公司, 逆转录试剂盒为大连 Takara 公司产品 RT PCR 引物由大连宝生物工程有限公司合成 :p53 上游序列 :5 CGTGTG GAGTATTTGGATGACAGA 3, 下游序列 :5 TG TAGTGGATGGTGGTACAGTCAGA 3 Bax 上游序列 :5 GCCAGCAAACTGGTGCTCAA 3, 下游序列 :5 ATGTCCAGCCCATGATGGTTC 3 Bcl 引物上游序列 :5 TGTGTGTGGAGAGCGTCAAC C 3, 下游序列 :5 TTCAGAGACAGCCAGGAGA AATC 3 p 引物上游序列 :5 CAGGGGACAGC AGAGGAAGA 3, 下游序列 :5 TTAGGGCTTCCT CTTGGAGAA 3 Caspase 3 引物上游序列 :5 GA CTCTGGAATATCCCTGGACAACA 3, 下游序列 : 5 AGGTTTGCTGCATCGACATCTG 3 β actin 引物上游序列 :5 GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 3, 下游序列 :5 GAAGATGGTGATGGGATTC 3. 方法.. 细胞培养 BGC 83 细胞培养于含 0% 的胎牛血清 00U/mL 青霉素 00 U/mL 链霉素的 RP MI640 培养基中, 置 37 5% CO 培养箱常规培养, 取对数生长期细胞进行试验.. Lg 对 BGC 83 细胞体外增殖抑制作用的检测在 96 孔培养板内接种 6000 个 / 孔细胞培养过夜, 次日加入终浓度分别为 和 0μmol/L 的 Lg 及 Vp 6, 另设空白对照组 ( 只加 BGC 83 细胞 ) 及调零组 ( 只加 RPMI640 培养基 ), 每组 5 个复孔, 继续培养 48h; 同上接种细胞于 96 孔板, 加入终浓度为 0μmol/L 的 Lg 及 Vp 6, 分别培养 和 60h, 在上述时间点, 吸去培养基, 加入含 5mg/mL 的 MTT 培养基 00μL,37 孵育 4h, 弃上清, 加入 50 μl 的 DMSO, 轻微震荡 0 min, 于 490nm 波长处用酶标仪测定各孔吸光度 (A) 值, 计算增殖抑制率 实验组增殖抑制率 A 值 (%)=(- 对照组 A 值 ) 00%..3 细胞周期和凋亡的检测接种 BGC 83 细胞于培养瓶, 贴壁后加入终浓度为 0μmol/L 的 Lg, 分别培养 和 4h, 胰酶消化收集细胞,800r/min 离心 5min(r=0cm),PBS 洗 次, 加入预冷的 70% 乙醇 4 固定 h;800r/min 离心 5min(r=0cm), 弃上清, ml PBS 重悬细胞,400 目筛网过滤, 800r/min 离心 5 min(r=0 cm) 弃上清, 加入 50μg/mL 的 PI 染色液, 混匀,4 避光染色 30 min,

11 中华肿瘤防治杂志 03 年 4 月第 0 卷第 8 期 CHINJCANCERPREV TREAT,April03,Vol.0 No 实验研究 / 论著 曲妥珠单抗对犎犈犚 高表达胃癌细胞珠抑制作用观察 韩真真 袁胜利 丁明翠 姚如勇. 青岛大学医学院附属青岛市市立医院肿瘤科, 山东青岛 660. 青岛大学医学院附属医院中心实验室, 山东青岛 摘要 目的 : 观察曲妥珠单抗对 HER 高表达人胃癌 NCI N87 细胞株的抑制作用 方法 : 免疫组化法检测 HER 蛋白在 NCI N87 细胞中的表达 荧光免疫杂交法 (FISH) 检测 HER 基因在 NCI N87 细胞中的扩增情况 根据是否应用曲妥珠单抗分为对照组与药物组, 其中药物组浓度分别为 0. 0 和 00μg/mL, 作用 7h 后以 CCK8 法测定曲妥珠单抗对 NCI N87 细胞的生长抑制作用 结果 : 免疫组化法检测显示,HER 蛋白在 NCI N87 细胞中的表达以细胞膜分布为主, 呈棕褐色颗粒状,HER 蛋白为可疑阳性表达 (++) 荧光免疫杂交法检测显示,NCI N87 细胞 HER / CEP7>, 存在 HER 基因扩增 CCK8 实验显示, 曲妥珠单抗浓度为 0. 0 和 00μg/mL 时细胞存活率分别为 (84.7±.70)% (8.±3.94)% (83.65±.48)% 和 (80.59±4.5)%, 四组间比较差异无统计学意义, 犘 >0.05; 与对照组 (00%) 相比, 差异有统计学意义, 犘 =0.000 结论: 曲妥珠单抗对 HER 高表达人胃癌 NCI N87 细胞具有一定的生长抑制作用 ; 曲妥珠单抗浓度在 0.~00μg/mL 对 NCI N87 细胞的抑制作用相似 关键词 曲妥珠单抗 ; 胃肿瘤 / 药物疗法 ; 受体, 表皮生长因子 ; 免疫组织化学 中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犗犫狊犲狉狏犪狋犻狅狀狅犳犻狀犺犻犫犻狋狅狉狔犲犳犳犲犮狋狅犳狋狉犪狊狋狌狕狌犿犪犫狅狀犎犈犚 狅狏犲狉犲狓狆狉犲狊犲犱犵犪狊狋狉犻犮犮犪狀犮犲狉犾犻狀犲 犎犃犖犣犺犲狀 狕犺犲狀, 犢犝犃犖犛犺犲狀犵 犾犻, 犇犐犖犌犕犻狀犵 犮狌犻, 犢犃犗犚狌 狉狅狀犵. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗狀犮狅犾狅犵狔, 犙犻狀犵犱犪狅犕狌狀犻犮犻狆犪犾犎狅狊狆犻狋犪犾, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犙犻狀犵犱犪狅犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犙犻狀犵犱犪狅 660, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犆犲狀狋狉犪犾犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犕犲犱犻犮犪犾犆狅犾犲犵犲, 犙犻狀犵犱犪狅犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犙犻狀犵犱犪狅 66003, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToobservetheinhibitoryefectoftrastuzumabonHER overexpressedgastriccancercel NCI N87. 犕犈犜犎犗犇犛 :ToidentifytheexpressionofHER ingastriccancercelwithimmunohistochemical(ihc)method andthefluorescenceinsituhybridization(fish)method.acorrdingtotheusetrastuzumab,groupsweredividedintothe controlandthetreatmentgroup.thetreatmentgroupwasgiventrastuzumabtomakefinalconcentrationreachingto0.,,0and00μg/ml.cck8 methodwasusedtodetectcelinhibitoryrate7haftertrastuzumabwasprocessed. 犚犈 犛犝犔犜犛 :HER proteinthatmainlydistributedincelmembranewas ++.ThenumberofHER /CEP7 was>,so NCI N87celwastheHER overexpressingcel.comparedtothecontrolgroup,celsurvivalratesoftreatmentgroups were0.μg/ml (84.7±.70)%,μg/mL(8.±3.94)%,0μg/mL (83.65±.48)%,and00μg/mL(80.59± 4.5)% ( 犘 =0.000);fourgroupswerenotstatisticalydiferent( 犘 >0.05). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :Trastuzumabhastheinhibi toryefectonher overexpressedgastriccancer;trastuzumabinhibitsthegrowthataboutequaleficacyfrom0.to 00μg/mL. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] trastuzumab;stomachneoplasms/drugtherapy;receptor,epidermalgrowthfactor;immunohistochemistry 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(8): 中图分类号 R735. 文献标识码 A 文章编号 (03) 第一作者简介 韩真真, 女, 山东枣庄人, 硕士, 主要从事肿瘤综合治疗的研究工作 Tel: E mail:hanbingzhenzhen@6.com 通讯作者简介 袁胜利, 男, 山东青岛人, 硕士, 副主任医师, 硕士生导师, 主要从事肿瘤放化疗等综合治疗的研究工作 Tel: E mail: @qq.com 曲妥珠单抗 (Trastuzumab, 商品名 Herceptin) 是针对 HER 原癌基因产物的人源化单克隆抗体, 已有报道证实在 HER 过表达的乳腺癌细胞中,Hercep [] tin 具有放疗增敏的作用, 其在胃癌中的放疗增敏鲜见相关报道 本研究通过体外实验进一步探讨 Her ceptin 单药对 HER 过表达胃癌细胞的抑制作用, 以

12 596 朱红波, 等姜黄素对 Raji 细胞凋亡及 bfgf 表达影响的观察 实验研究 / 论著 姜黄素对犚犪犼犻细胞凋亡及犫犉犌犉表达影响的观察 朱红波周丽泰山医学院附属医院血液内科, 山东泰安 7000 摘要 目的 : 探讨抗血管生成药物姜黄素对人非霍奇金淋巴瘤 (NHL)Raji 细胞凋亡及碱性成纤维细胞生长因子 (bf GF) 表达的影响, 为临床抗血管新生治疗 NHL 提供理论依据 方法 : 不同浓度 (5 0 5 和 50μmol/L) 姜黄素作用 Raji 细胞不同时间后, 倒置相差显微镜下观察 Raji 细胞形态及生长情况 ;AnnexinV FITC 双标流式细胞术检测姜黄素对细胞凋亡的作用 ;ELISA 检测姜黄素对 Raji 细胞上清中 bfgf 含量的影响 结果 : 显微镜下可见, 随姜黄素浓度的增加, Raji 细胞由成团生长变为单个散在, 细胞数明显减少, 细胞体积变小, 折光性减弱, 有的细胞膜破裂, 可见细胞碎片 ; 流式细胞术检测结果显示, 作用 4 48 和 7h 后 0μmol/L 姜黄素组细胞凋亡率分别为 (.±.05)% (4.74±0.46)% 和 (5.±.43)%,5μmol/L 姜黄素组分别为 (5.07±5.40)% (33.50±5.89)% 和 (55.98±7.4)%, 均高于对照组凋亡率 (.75±0.8)% (.5±0.9)% 和 (.77±0.6)%, 差异有统计学意义, 犘 <0.0 ELISA 法检测结果显示, 作用 4 48 和 7h 对照组上清液中 bfgf 浓度分别为 (643.4±57.) (73.6±60.9) 和 (93.7±8.04) ρ g/ml; 0μmol/L 姜黄素处理组分别为 (.76±0.07) (73.3±4.76) 和 (07.±.37) ρ g/ml;5μmol/l 姜黄素处理组分别为 (95.3±.59) (7.4±0.03) 和 (36.4±7.58) ρ g/ml;raji 细胞经 0 5μmol/L 姜黄素作用 4 48 和 7h 后,bFGF 表达水平明显低于对照组, 在 3 个时间点的表达量与对照组相比, 差异有统计学意义, 犘 <0.0; 不同浓度姜黄素处理组上清液中 bfgf 含量差异亦有统计学意义, 犘 <0.05 结论 : 姜黄素对 Raji 细胞凋亡具有促进作用, 能够抑制 Raji 细胞分泌 bfgf, 其抑制作用具有浓度 时间依赖性, 提示姜黄素可能有抑制血管新生的作用 关键词 姜黄素 / 药理学 ; 流式细胞术 ; 淋巴瘤, 非霍奇金 ; 细胞凋亡 / 药物作用中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犈犳犲犮狋狅犳犮狌狉犮狌犿犻狀狅狀犪狆狅狆狋狅狊犻狊犪狀犱犫犉犌犉犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犾狔犿狆犺狅犿犪犚犪犼犻犮犲犾狊 犣犎犝犎狅狀犵 犫狅, 犣犎犗犝犔犻犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犎犲犿犪狋狅犾狅犵狔, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犜犪犻狊犺犪狀犕犲犱犻犮犪犾犆狅犾犲犵犲, 犜犪犻犪狀 7000, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :TodetecttheefectsofcurcuminonapoptosisandbFGFs expressioninrajicels,andpro videatheoryevidencefortherapyofanti vesselneogenesis. 犕犈犜犎犗犇犛 :AfterRajicelsweretreatedwithcurcuminatdif ferentconcentrationsanddiferenttime,themorphologicalchangesofcelswereobservedbyinvertedphasecontrastmi croscope,andthecelapoptosiswastestedbyflowcytometry;thechangeofbfgfcontentsinculturedsupernatantsof RajicelstreatedwithdiferentconcentratinsofcurcuminweremeasuredbyELISA. 犚犈犛犝犔犜犛 :Themorphologicalchan gesofcelswereobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope,therajicelsturnedintodisorderfromconglobation,the celpopulationobviouslywasdecreasedandthecelvolumeshrinked,therefractionweakened,thecelmembrancedisrup ted,celdebrisexisted.theapoptosisrateofrajicelswasincreasedastheconcentrationofcurcuminandactiontime wereincreased.whencurcuminconcentrationswere0and5μmol/l,theapoptosisrateofrajicelswere (.±.05)%,(5.07±5.40)% after4h,(4.74±0.46)%,(33.50±5.89)% after48hand (5.±.43)%,(55.98± 7.4)% after7h,whichwerehigherthanthatofcontrolgroup [(.75±0.8)%,(.5±0.9)%,(.77±0.6)%] andtherewasasignificantdiference( 犘 <0.0).ThechangeofbFGFcontentsinculturedsupernatantsofRajicelstrea tedwithdiferentconcentratinsofcurcumin(0,5μmol/l),indiferenttime(4,48,7h)weremeasuredbyelisa,the 0μmol/LcurcumingrouplevelsofbFGFwere(.76±0.07),(73.3±4.76)and (07.±.37) ρ g/ml;the 5μmol/LcurcumingrouplevelsofbFGFwere(95.3±.59),(7.4±0.03)and (36.4±7.58) ρ g/ml,signifi cantlylowerthanthatofthecontrolgroups(643.4±57.),(73.6±60.9)and (93.7±8.04) ρ g/ml. 犆犗犖 犆犔犝犛犐犗犖犛 :CurcumincanpromotetheRajicelsapoptosis,inhibitbFGFsecretionofRajicelsandthisfunctionisrelied 第一作者简介 朱红波, 女, 山东海阳人, 硕士, 主治医师, 主要从事血液病的研究工作 Tel: E mail:zhuhongbo79@sina.com 通讯作者简介 周丽, 女, 山东文登人, 主任医师, 教授, 硕士生导师, 主要从事血液病的研究工作 Tel: E mail:lizhou955@yahoo.com.cn

13 中华肿瘤防治杂志 03 年 4 月第 0 卷第 8 期 CHINJCANCERPREV TREAT,April03,Vol.0 No onconcentrationsandtimes.theseresultssuggestthatcurcuminmaybeanti vesselneogenesis. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] curcumin/pharmacology;flowcytometry;lymphoma,non hodgkin;apoptosis/drugefects 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(8): 中图分类号 R73-3 文献标识码 A 文章编号 (03) 姜黄是姜科姜黄属植物的根茎 姜黄素是姜黄的一种酚类色素, 具有抗感染 抗肿瘤和抗突变等生物活 [ 3] 性, 未见明显毒副作用的报道 近年来对姜黄素抗肿瘤作用的相关研究表明, 姜黄素具有抑制细胞增殖 [4 5] 诱导凋亡 抑制细胞黏附和血管新生等药理作用 本研究通过姜黄素对人非霍奇金淋巴瘤 (NHL)Raji 细胞凋亡及 (basicfibroblastgrowthfactor,bfgf) 表达的影响, 为临床抗血管新生治疗 NHL 提供理论依据 材料与方法. 实验材料人 Raji 细胞株购于南京凯基生物科技发展有限公司, 姜黄素 ( 纯度为 99%) 购于 Sigma 公司,RP MI640( 不含 HEPES) 胎牛血清均为 Gibco 公司, AnnexinV FITC 试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司,bFGF ELISA 试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司 (R&D 公司, 进口分装 ). 细胞增养及配制将 Raji 细胞接种于含 0% 胎牛血清的 RP MI640 培养液 ( 不含 HEPES) 中, 在 95% 湿度 37 5% CO 培养箱中培养,~3d 传代 次,Raji 细胞悬浮聚集成团生长, 实验所用细胞保持在对数生长期 称取 8.4mg 姜黄素, 加入 0 mldmso 中溶解, 浓度即为 μmol/l, 分装,-0 保存, 用前解冻 (DMSO 终浓度 <0.%, 预实验显示终浓度为 0.% 的 DMSO 在实验中对 Raji 细胞的生长没有明显影响 ).3 实验分组姜黄素组 : 细胞培养基中加入姜黄素, 终浓度分别为 和 50μmol/L DMSO 对照组 : 细胞培养基中加入与实验组等体积 DMSO 阴性对照组: 加入含 0% 胎牛血清的 RPMI 640 培养液.4 镜下观察细胞形态收集对数生长期细胞, 调整细胞数为 0 5 ml -, 接种于 4 孔培养板, 设立实验组 DMSO 对照组和阴性对照组, 实验组加入不同浓度姜黄素 (5 0 5 和 50μmol/L), 分别于培养 4h 后在倒置显微镜下观察细胞形态.5 细胞凋亡检测 AnnexinⅤ FITC 双标流式术检测姜黄素对细胞 凋亡的影响 调整细胞浓度为 0 6 ml -, 分别接种于 孔培养板, 姜黄素浓度分别为 0 和 5μmol/L, 同设阴性对照组, 分别作用 4 48 和 7h; 分别收集悬浮细胞离心 (000r/min,r=0cm)5 min, 去上清, 收集细胞 ;PBS 洗涤细胞 次 (000r/min,r=0cm) 5min, 收集 (~5) 0 5 细胞 ; 加入 500μL Binding Bufer 悬浮细胞 ; 加入 5μL Annexin V FITC 混匀后, 再加入 5μLPropidiumIodide 混匀 ; 室温 避光 反应 5~5min 后进行流式细胞仪检测.6 犫犉犌犉含量的检测 取对数生长期 Raji 细胞, 调整细胞浓度为 0 5 ml -, 接种于 96 孔板, 实验组调整姜黄素终浓度为 0 和 5μmol/L, 每组设 6 个平行孔, 同时设细胞悬液阴性对照组, 作用 4h 后, 收集上清液, 按照 ELISA 试剂盒说明书进行 bfgf 含量检测.7 统计学方法 应用 SPSS6.0 进行统计学分析, 数据以狓 - ± 狊 表示, 两组数据比较用狋检验, 多组数据比较用单因素方差分析 检验水准 α=0.05 结果. 对犚犪犼犻细胞形态的影响 阴性对照组及 0.% DMSO 对照组细胞呈圆形 大小一致 成团生长 折光性强 ; 姜黄素处理组细胞形态不规则 大小不一 折光性减弱 生长缓慢, 细胞团体积减小 分散生长 甚至细胞膜破裂, 可见细胞碎片, 细胞形态的改变与姜黄素浓度正相关, 以 50μmol/L 姜黄素组最为明显 ( 图 ). 对犚犪犼犻细胞凋亡的促进作用 流式细胞术检测结果显示, 随姜黄素作用浓度及时间的增加, 细胞凋亡率随之增加 ( 图 ) 作用 4 48 和 7h 后 0μmol/L 姜黄素组细胞凋亡率 ( 早期与晚期凋亡率之和 ) 分别为 (.±.05)% (4.74± 0.46)% 和 (5.±.43)%,5μmol/L 姜黄素组分别为 (5.07±5.40)% (33.50±5.89)% 和 (55.98± 7.4)%, 均高于对照组凋亡率 (.75±0.8)% (.5±0.9)% 和 (.77±0.6)%, 差异有统计学意义, 犘 <0.0 不同浓度姜黄素组间比较, 差异亦有统计学意义, 犘 <0.05( 根据细胞形态学表现, 只选取 0 和 5μmol/L 个浓度检测 )

14 600 王亚力, 等 PI3K/AKT 信号通路相关蛋白表达与乳腺癌淋巴转移相关性分析 犘犐 3 犓 / 犃犓犜信号通路相关蛋白表达与乳腺癌淋巴转移相关性分析 王亚力李湘奇党相国 泰山医学院附属医院普外科, 山东泰安 7000 临床基础研究 / 论著 摘要 目的 : 探讨磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI3K) 丝苏氨酸蛋白激酶 B(AKT) 和血管内皮生长因子受体 3(VEGFR 3) 在人乳腺癌组织中的表达及其在淋巴转移中的作用 方法 : 选取 60 例乳腺癌组织, 应用免疫组织化学 SP 法检测 PI3K AKT 和 VEGFR 3 蛋白的表达,RT PCR 检测 PI3K AKT 和 VEGFR 3mRNA 的表达, 并分析其相关性 结果 :PI3K 在有淋巴结转移组的阳性表达率为 78.3%, 明显高于无淋巴结转移组 53.57%, χ =4.053, 犘 =0.044;AKT 在有淋巴结转移组的阳性表达率 7.88%, 明显高于无淋巴结转移组 50.00%, χ =4.090, 犘 =0.0447;VEGFR 3 在有淋巴结转移组的阳性表达率为 96.89%, 明显高于无淋巴结转移组 75.00%, χ =4.4357, 犘 = 例新鲜标本中,PI3K AKT 和 VEGFR 3mRNA 在有淋巴结转移的乳腺癌组织中相对表达量分别为 0.39± ±0.8 和 0.4±0.5, 明显高于无淋巴结转移组 0.3± ±0.3 和 0.3±0., 组间比较差异有统计学意义, 犘值分别为 和 经直线相关分析,PI3K 阳性表达组中 VEGFR 3 的表达为 95.00%,PI3K 阴性表达组中 VEGFR 3 表达为 70.00%;AKT 阳性表达组中 VEGFR 3 的表达为 94.59%,AKT 阴性表达组中 VEGFR 3 的表达为 73.9%, 在乳腺癌组织中 PI3K 与 VEGFR 3 表达呈正相关, 狉 =0.3685, 犘 =0.0038;AKT 与 VEGFR 3 表达也呈正相关, 狉 =0.45 4, 犘 =0.00 结论:PI3K AKT 和 VEGFR 3 在乳腺癌组织中的表达呈正相关,PI3K 和 AKT 的表达上调可能促使乳腺癌细胞 VEGFR 3 过表达, 诱导淋巴管生成, 促进淋巴转移的发生 关键词 乳腺肿瘤 ; 淋巴转移 ; 淋巴管生成 ; 磷脂酰肌醇 3 激酶 / 丝苏氨酸蛋白激酶 B; 血管内皮生长因子受体 3 中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犚犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀狋犺犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犘犐 3 犓 / 犃犓犜狊犻犵狀犪犾狆犪狋犺狑犪狔狉犲犾犪狋犲犱狆狉狅狋犲犻狀犪狀犱犫狉犲犪狊狋犮犪狀犮犲狉犾狔犿狆犺犪狋犻犮犿犲狋犪狊狋犪狊犲狊 犠犃犖犌犢犪 犾犻, 犔犐犡犻犪狀犵 狇犻, 犇犃犖犌犡犻犪狀犵 犵狌狅犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犌犲狀犲狉犪犾犛狌狉犵犲狉狔, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犜犪犻狊犺犪狀犕犲犱犻犮犪犾犆狅犾犲犵犲, 犜犪犻 犪狀 7000, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToexploretheexpressionofPI3K,AKTandVEGFR 3inhumanbreastcancertissuesand itsroleinlymphatic metastases. 犕犈犜犎犗犇犛 :Totaly60casesofbreastcancertissueswereselected,theexpressionof PI3K,AKTandVEGFR 3proteinwasdetectedbyusingimmunohistochemistrySPmethod,andtheexpressionofPI3K, AKTandVEGFR 3mRNA wasdetectedbyusingrt PCRmethod,anditscorrelationwasanalyzed. 犚犈犛犝犔犜犛 :Theex pressionrateofpi3kinlymphnodepositivegroupwas78.3%,significantlyhigherthantheexpressionrateoflymph nodenegativegroup53.57% ( χ =4.053, 犘 =0.044);TheexpressionrateofAKTinlymphnodepositivegroupwas 7.88%,whichwassignificantlyhigherthanthatoflymphnodenegativegroup50.00%, χ =4.090, 犘 =0.0447;The expressionrateofvegfr 3inlymphnodepositivegroupwas96.89%,whichwassignificantlyhigherthantheexpres sionrateoflymphnodenegativegroup75.00% ( χ =4.4357, 犘 =0.035).Inthe60casesoffreshbreastcancertissue specimen,therelativeexpressionofpi3k,aktand VEGFR 3mRNAinlymphnodepositivegroup were0.39±0.7, 0.48±0.8and0.4±0.5,which wassignificantlyhigherthantherelativeexpressionoflymphnodenegativegroup 0.3±0.3,0.9±0.3and0.3±0..Therewasasignificantdiferencebetweenthetwogroups, 犘 were0.0475, and0.0364respectively.Throughthelinearcorrelationanalysis,theexpressionrateofVEGFR 3inPI3Kposi tivegroupwas95.00%,theexpressionrateofvegfr 3inPI3K negativegroup was70.00%,theexpressionrateof VEGFR 3inAKTpositivegroupwas94.59%,theexpressionrateofVEGFR 3inAKTnegativegroupwas73.9%,and 基金项目 山东省自然科学基金 (ZR009CM039); 山东省医药卫生科技发展计划 (0HW084) 第一作者简介 王亚力, 男, 山东泰安人, 副主任医师, 主要从事普外科的临床研究工作 Tel: E mail:drlixqi@6.com 通讯作者简介 李湘奇, 男, 山东滕州人, 博士, 教授, 主要从事乳腺和甲状腺肿瘤的临床研究工作 Tel: E mail:drlixqi@yahoo.com.cn

15 中华肿瘤防治杂志 03 年 4 月第 0 卷第 8 期 CHINJCANCERPREV TREAT,April03,Vol.0 No.8 60 therewaspositivelycorrelationbetweenpi3kandvegfr 3inbreastcancertissues ( 狉 =0.3685, 犘 =0.0038).There wasapositivelycorrelatedbetweenaktandvegfr 3inbreastcancertissuetoo ( 狉 =0.454, 犘 =0.00). 犆犗犖犆犔犝 犛犐犗犖犛 :TheexpressionofPI3K,AKTandVEGFR 3inbreastcancertissuesispositivecorrelation.Therisingexpression ofpi3kandakt maypromotetheoverexpressionofvegfr 3inbreastcancercels,inducethelymphaticgeneration, andpromotetheoccurrenceoflymphaticmetastases. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] breastcancer;lymphaticmetastases;lymphaticgeneration;pi3k/aktsignalpathway;vegfr 3 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(8): 中图分类号 R737.9 文献标识码 A 文章编号 (03) 临床实验表明, 诱导淋巴管生成的关键蛋白是血管内皮生长因子受体 3(VEGFR 3), 它被血管内皮生长因子 C 和 D(VEGF C 和 VEGF D) 激活, 为淋巴管生成创 [] 建一个新的有利环境 磷脂酰肌醇 3 激酶 / 丝苏氨酸蛋白激酶 B(PI3K/AKT) 信号转导通路在绝大多数人类肿瘤中表达失调, 调节着肿瘤细胞的增殖和凋亡, 并参与 IGF 诱导的 VEGF C 的上调, 是乳腺癌淋巴转移过 [] 程中的重要角色 但是 PI3K/AKT 在乳腺癌组织中的表达与淋巴转移的相互作用机制尚不完全明确, 本研究通过检测乳腺癌组织 PI3K/AKT 蛋白和基因的表达情况, 分析其与 VEGFR 3 的关系, 探讨其表达对乳腺癌淋巴转移的作用 材料与方法. 标本来源选取泰山医学院附属医院乳腺和甲状腺外科 经病理确诊的乳腺浸润性导管癌术后标本 60 例, 均为女性, 年龄 7~66 岁, 平均年龄 (43.6±.) 岁, 中位年龄 44 岁 其中有淋巴结转移 3 例, 无淋巴结转移 8 例 标本收集经泰山医学院附属医院医学道德伦理委员会批准, 所有患者术前均未接受放疗或化疗, 参照 00 年国际抗癌联盟 (UICC) 和美国癌症联合会 (AJCC) 合作制定的肿瘤 TNM 分期,Ⅰ 期 例,Ⅱ 期 38 例,Ⅲ 期 例 根据实验需要, 每例切取新鲜标本约.0cm.0cm.0cm 装入冻存管, 置于 -80 冰箱内保存, 其余标本以甲醛固定, 石蜡包埋常规制片. 主要试剂兔抗人 PI3K(PI3K p85) 多克隆抗体 兔抗人 AKT 多克隆抗体 兔抗人 VEGFR 3(flt 4) 多克隆抗体 胰蛋白酶 链霉卵白素 过氧化物酶 (SP) 试剂盒 (sp 900) 及浓缩型 DAB 显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司, 一步法 RT PCR 试剂盒购于北京天根生化科技有限公司, 化学发光剂购于 Santa Cruz 公司, 预染色的蛋白 Marker 购自 solarbio 公司, Trizol 试剂购于 Invitrogen 公司,RT PCR 引物由 In vitrogen( 上海 ) 公司合成.3 犘犐 3 犓和犃犓犜与犞犈犌犉犚 3 蛋白的检测 60 例标本石蜡包埋, 切片厚 4μm, 采用免疫组织化学 SP 法, 切片常规脱蜡水化后, 用过氧化酶阻断溶液消除内源性过氧化物酶, 高温高压抗原修复, 山羊血清封闭非特异性抗原, 加一抗室温下孵育, 加生物素标记二抗, 每次实验以已知的 PI3K 和 AKT 阳性切片 ( 由试剂公司提供 ) 作为阳性对照, 以 PBS 代替一抗作为阴性对照 经 DAB 显色, 苏木精对比染色后封片, 于 48h 内光学显微镜下阅片.4 结果判定标准 PI3K 和 AKT 表达定位于细胞质, 为黄色至棕黄色颗粒 ;VEGFR 3 阳性细胞为胞质或者胞膜出现棕黄色颗粒者, 由 名病理专业医生分别对实验结果进行双盲法评估, 每张切片随机选择 3 个视野, 在显微镜 ( 400) 下计数每个视野 00 个肿瘤细胞中阳性细胞的比例, 取 3 个视野的平均百分数为判定结果 评分标准参照文献 [3] 修改,) 按染色强度评分 : 无显色为 0 分, 浅黄色为 分, 棕黄色为 分, 棕褐色为 3 分 ;) 按阳性细胞的百分率评分 : 阳性细胞 <5% 为 0 分 ;5%~50% 为 分 ;>50%~75% 为 分 ;>75% 为 3 分, 最后以两者乘积作为判定标准 免疫组织化学结果,0 分为 (-);~ 分为 (+);3 分为 (++); 4 分为 (+++).5 犘犐 3 犓和犃犓犜与犞犈犌犉犚 3 犿犚犖犃的检测采用 TRIzol 法提取组织总 RNA, 每例取总 RNA μg, 然后进行逆转录聚合酶链反应, 同时扩增 BM (bet microglobulin) 作为内参照, 每个标本至少重复 3 遍 经 GeneBank 检索, 利用 Primer5.0 软件设计目的基因 PI3K AKT VEGFR 3 和内参基因 BM 引物, 由上海 Invitrogen 生物工程技术有限公司合成,BM 引物序列 F:5 GGCTATCCAGCGTACTCCAAA 3,R:5 CG GCAGGCATACTCATCTTTT 3, 产物长度 377 bp; VEGFR 3 引物序列 F:5 TGTGGAGGGAAAGAATA AGAC 3,R:5 CCTCTAGTAGCTCCTCGGAT 3, 产物长度 8bp;PI3K 引物序列 F:5 CATCACTTCCTC CTGCTCTAT 3,R:5 CAGTTGTTGGCAATCTTCT TC 3, 产物长度 46bp;AKT 引物序列 F:5 GCG ACGTGGCTATTGTGA 3,R:5 CAGTCTGGATGG

16 604 刘梅, 等 MiR 9a 与宫颈癌同步放化疗敏感相关性研究 临床基础研究 / 论著 犕犻犚 9 犪与宫颈癌同步放化疗敏感相关性研究 刘梅安菊生 黄曼妮胡金龙涂彬彬朱红霞吴令英徐宁志中国医学科学院肿瘤医院 ( 肿瘤研究所细胞与分子生物学研究室 : 刘梅, 朱红霞, 徐宁志 ; 妇瘤科 : 安菊生, 黄曼妮, 胡金龙, 涂彬彬, 吴令英 ), 北京 000 摘要 目的 : 探讨 mir 9a 与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性的相关性及可能作用机制 方法 : 收集行同步放化疗治疗的 ⅡB~ⅢB 期宫颈鳞状细胞癌患者 0 例, 根据其治疗后 6 个月的近期治疗效果分为治疗敏感组和抗拒组, 每组各 0 例, 治疗前收集宫颈肿瘤组织并提取总 RNA; 利用 TaqManReal timepcr 法检测 mir 9a 在两组间的表达情况, 统计分析其与同步放化疗敏感性的相关性 结果 : 敏感组随访 0~0 个月, 截止末次随访均未发现肿瘤复发 抗拒组治疗中肿瘤进展 例, 治疗结束 6 个月内肿瘤残存或出现新发病灶者 8 例 两组患者在临床分期 年龄 组织分级 淋巴结转移 局部肿瘤大小 Scc Ag 水平和治疗时间各个临床因素差异无统计学意义, 犘值均 >0.05;miR 9a 在治疗抗拒组中的表达水平约为.0±0, 敏感组为 4.80±.5, 两组比较差异有统计学意义, 犘 <0.05 结论:miR 9a 与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性相关, 可能成为预测宫颈肿瘤内在放化疗敏感性的标志, 对尽早施行个体化治疗以改善预后有重要意义 关键词 宫颈肿瘤 / 治疗 ;mir 9a; 随访研究 ; 预后中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犆狅狉狉犲犾犪狋犻狅狀狅犳犕犻犚 9 犪狑犻狋犺犮犺犲犿狅狉犪犱犻狅狋犺犲狉犪狆狔狊犲狀狊犻犫犻犾犻狋狔犻狀犺狌犿犪狀犮犲狉狏犻犮犪犾犮犪狀犮犲狉 犔犐犝犕犲犻, 犃犖犑狌 狊犺犲狀犵, 犎犝犃犖犌犕犪狀 狀犻, 犎犝犑犻狀 犾狅狀犵, 犜犝犅犻狀 犫犻狀, 犣犎犝犎狅狀犵 狓犻犪, 犠犝犔犻狀犵 狔犻狀犵, 犡犝犖犻狀犵 狕犺犻犆犪狀犮犲狉犐狀狊狋犻狋狌狋犲牔犆犪狀犮犲狉犎狅狊狆犻狋犪犾, 犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊, 犅犲犻犼犻狀犵 000, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToinvestigatemiR 9athatrelatedtotheconcomitantchemoradiotherapysensitivityinad vanceduterinecervicalsquamouscelcarcinomasuterine (UCSCC),andfindamarkertoidentifycervicalcancerpatients whoareresistanttotheconcomitantchemoradiotherapy. 犕犈犜犎犗犇犛 :TheUCSCCpatientsinFIGOstage ⅡBor ⅢB weretreatedwithplatinumbasedconcomitantchemoradiotherapy.patientswithprogressivediseaseduringfirstlineplati numbasedchemotherapyorthosewhosuferedrecurrentdiseasewithin6 monthsofcompletingfirstlinetherapywere termedresistant.patientwithnorecurrenceorwithrecurrencesbeyond6 monthsweretermedsensitive.altumortis suesbiopsieswerecolectedbeforetreatmentwithstandardchemoradiation.totalrnaswereisolatedusingamirvana RNAisolationkit(Ambion)accordingtothemanufacturer sprotocol.theexpressionlevelofmir 9awasexaminedby usingtaqmanreal timepcrin0cervixbiopsiessamples,including0resistantsamplesand0sensitivesamples. 犚犈 犛犝犔犜犛 :Thefolow uptimeofsensitivesampleswas0-0months,andnorecurrencepatientwasfound.inresistance samples,therewerecaseswithcancerprocessing,and8caseswithnewlesions.therewerenodiferenceofclinicalstag ing,age,histologydegree,lymphnodemetastasis,tumorsize,scc Aglevelandtreatmenttimebetweensensitivesamples andresistantsamples( 犘 >0.05).TheexpressionofmiR 9ainresistancesampleswas.0±0,and4.80±.5insensi tivesamples( 犘 >0.05). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖犛 :mir 9amaybeamarkertoidentifycervicalcancerpatientswhoarelikelyto failconcomitantchemoradiotherapy,inordertoapplyindividualizedtherapy.itisworthytoverifyroleofmir 9aincer vicalcancercelsandworthyoffurtherinvestigation. 本研究中与第一作者贡献相同 基金项目 中央级公益性科研院所基本科研业务费 (JK009B07) 第一作者简介 刘梅, 女, 山西大同人, 博士, 助理研究员, 主要从事 microrna 与肿瘤发生发展的研究工作 Tel: E mail:meier05@hotmail.com 第一作者简介 安菊生, 女, 河北张家口人, 博士, 主治医师, 主要从事妇科常见良恶性肿瘤诊治的研究工作 Tel: E mail:anmanman_0@6.com 通讯作者简介 吴令英, 女, 湖南岳阳人, 博士, 主任医师, 博士生导师, 主要从事各种妇科肿瘤的临床研究工作 Tel: E mail:wulingying@csco.org.cn 通讯作者简介 徐宁志, 男, 湖南邵阳人, 硕士, 研究员, 教授, 博士生导师, 主要从事细胞癌变的分子生物学机理和信号传导通路等研究工作 Tel: E mail:xningzhi@public.bta.net.cn

17 中华肿瘤防治杂志 03 年 4 月第 0 卷第 8 期 CHINJCANCERPREV TREAT,April03,Vol.0 No 脑间变性星形细胞瘤术后调强放疗同期替莫唑胺化疗临床观察 郑瑞锋, 樊锐太 文海英 罗俊波 王彦威. 郑州大学第一附属医院放疗科, 河南郑州 武警河南总队医院肿瘤科, 河南郑州 临床应用研究 / 论著 摘要 目的 : 评价间变性星形细胞瘤术后调强放疗同期联合替莫唑胺 (TMZ) 化疗的疗效及毒副作用 方法 :57 例间变性星形细胞瘤术后患者随机分成调强放疗同期 TMZ 化疗组和单纯调强放疗组, 观察两组患者 3 年生存率和无进展生存期及毒副作用 对有病灶残留者观察近期疗效 Kaplan Meier 法计算生存率及 χ 检验 结果 : 随访截止 0 0 0, 例失访, 随访率 96.5%(55/57) 放化疗同期组和单纯放疗组 年生存率分别为 8.%(3/8) 和 69.0% (0/9), 差异无统计学意义, χ =.98, 犘 =0.060; 年生存率分别为 67.9%(9/8) 和 58.6%(7/9), 差异有统计学意义, χ =3.95, 犘 =0.039;3 年生存率分别为 46.4%(3/8) 和 34.5%(0/9), χ =4.8, 犘 =0.033 放化疗同期组中位生存期 3.6 个月, 单纯放疗组 4.5 个月, 差异有统计学意义, χ =3.89, 犘 =0.04 放化疗同期组和单纯放疗组患者 年无进展生存率分别为 78.6%(/8) 和 65.5%(9/9), 差异无统计学意义, χ =3.0, 犘 =0.058; 年无进展生存率为 57.% (6/8) 和 4.4%(/9), 差异有统计学意义, χ =4.3, 犘 =0.03;3 年无进展生存率为 3.%(9/8) 和 4.%(7/9), 两组比较差异有统计学意义, χ =4.8, 犘 =0.04 有病灶残留者近期有效率放化疗同期组为 70.0%(4/0), 单纯放疗组为 59.%(3/), 差异有统计学意义, χ =4.79, 犘 =0.08 毒副作用较低, 均为 Ⅰ/Ⅱ 级, 主要表现为恶心 呕吐, 白细胞 血小板下降, 对症治疗后缓解 结论 : 间变性星形细胞瘤术后调强放疗同期联合 TMZ 化疗较单纯放疗能明显提高局部控制率 3 年总生存率和无进展生存率, 且毒副作用较小 关键词 脑肿瘤 / 放射疗法 ; 星形细胞癌 / 治疗 ; 替莫唑胺 / 药物疗法 ; 预后 中华肿瘤防治杂志,03,0(8): 犘狅狊狋狅狆犲狉犪狋犻狏犲犻狀狋犲狀狊犻狋狔 犿狅犱狌犾犪狋犲犱狉犪犱犻犪狋犻狅狀狋犺犲狉犪狆狔犮狅犿犫犻狀犲犱狑犻狋犺犮狅狀犮狌狉狉犲狀狋犜犕犣犮犺犲犿狅狋犺犲狉犪狆狔犳狅狉狋狉犲犪狋犿犲狀狋狅犳犪狀犪狆犾犪狊狋犻犮犪狊狋狉狅犮狔狋狅犿犪, 犣犎犈犖犌犚狌犻 犳犲狀犵, 犉犃犖犚狌犻 狋犪犻, 犠犈犖犎犪犻 狔犻狀犵, 犔犝犗犑狌狀 犫狅, 犠犃犖犌犢犪狀 狑犲犻. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犚犪犱犻犪狋犻狅狀犜犺犲狉犪狆狔, 犉犻狉狊狋犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾, 犣犺犲狀犵狕犺狅狌犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犣犺犲狀犵狕犺狅狌 45005, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗狀犮狅犾狅犵狔, 犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犎犲犖犪狀犘狉狅狏犻狀犮犻犪犾犆狉狅狆狊犆犺犻狀犲狊犲犘犲狅狆犾犲 狊犃狉犿犲犱犘狅犾犻犮犲犉狅狉犮犲狊, 犣犺犲狀犵狕犺狅狌 45005, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Toevaluatetheeficacyandtoxicityefectoftheanaplasticastrocytomapostoperativeinten sity modulatedradiationtherapywithconcurrenttmzchemotherapy. 犕犈犜犎犗犇犛 :Totaly57casesofpostoperativepa tientswererandomlydividedintointensity modulatedradiationtherapywithconcurrenttmzchemotherapygroupandthe radiotherapyalonegroup.the,,3 yearos,pfs,andtoxicityefectofthetwogroupswereobservedandthecurative efectonpatientswithresiduallesionswerestudied.kaplan Meiermethod wasusedtocalculatsurvivalratesandchi squaretestwasusedforstatistics. 犚犈犛犝犔犜犛 :Folow upratewas96.5%(55/57)until0 0 0.The,,3 yearos rateofradiotherapyandchemotherapyoverthesameperiodgroupandradiotherapyalonegroupwere8.% (3/8), 67.9%(9/8),46.4%(3/8)and69.0%(0/9),58.6%(7/9),34.5%(0/9).Mediansurvivaltimeswere3.6 and4.5months( χ =3.89, 犘 =0.04).,,3 yearpfs were78.6% (/8),57.% (6/8),3.% (9/8)and 65.5%(9/9),4.4%(/9),4.%(7/9).Statisticaly: yearsurvivaland yearprogression freesurvivalrateof thetwogroupswasnotdiferent( χ =.98, 犘 =0.060; χ =3.0, 犘 =0.058).Twoand3yeartotalsurvivalrateofthe twogroupshadsignificantdiferences( χ =3.95, 犘 =0.039; χ =4.8, 犘 =0.033),and3yearprogression freesurvival rateofthetwogroupshadsignificantdiferences( χ =4.3, 犘 =0.03; χ =4.8, 犘 =0.04).Patientswithresidualle sions:theresponseratesofradiotherapyandchemotherapyalonegroup were70.0% (4/0)and59.% (3/) 通讯作者简介 郑瑞锋, 男, 河南淮阳人, 硕士, 主任医师, 主要从事头颈部及中枢神经肿瘤放疗及综合治疗的基础和临床研究工作 Tel: E mail:zrf986@hotmail.com

18 608 郑瑞锋, 等脑间变性星形细胞瘤术后调强放疗同期替莫唑胺化疗临床观察 respectively ( χ =4.79, 犘 =0.08).Thetoxicityofradiotherapyandchemotherapygroupwasless,mainlyincludingnau seaandvomiting,whitebloodcelsandplateletdecline. 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖犛 :Comparedtotheradiotherapyalonegroup,radio therapyandchemotherapygroupcansignificantlyimprovethelocalcontrolrateand,3yeartotalsurvivalratesaswelas progression freesurvivalrate. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] brainneoplasms/radiotherapy;astrocytoma/therapy;temozolomide/drugtherapy;prognosis 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,03,0(8): 中图分类号 R739.9 文献标识码 A 文章编号 (03) 脑间变性星形细胞瘤 (WHO Ⅲ 级 ) 是颅内最常见恶性胶质瘤之一, 约占脑恶性胶质瘤患者的 30% ~ 50% [], 脑恶性胶质瘤首选治疗方法为手术切除, 但单纯手术效果较差 研究表明, 脑恶性胶质瘤术后放疗 [ 3] 联合化疗能明显提高患者的总生存率, 但脑恶性胶质瘤患者中多形性胶质母细胞瘤 (WHO Ⅳ 级 ) 术后放疗联合替莫唑胺 (temozolomide,tmz) 化疗国内外文 [3 4] 献报道较多, 而脑间变性星形细胞瘤术后放疗联合 TMZ 化疗临床研究资料较少 本研究对间变性星形细胞瘤患者术后采取调强放疗 (intensity modulated radiotherapy,imrt) 同期联合 TMZ 化疗取得了较显著的疗效 对象与方法. 病例选择及一般资料 郑州大学第一附属医院放疗科 ( 例 ) 和武警河南总队医院肿瘤科 (36 例 ) 收治的经术后病理确诊的脑间变性星形细胞瘤 (007 年 WHO Ⅲ 级 ) 患者 57 例 男 38 例, 女 9 例 年龄 6~7 岁, 中位年龄 4.5 岁 将 57 例患者随机数字表法分为放化疗同期组 (8 例 ) 和单纯放疗组 (9 例 ) 放化疗同期组采用 IMRT 同步 TMZ 化疗加巩固化疗 ; 单纯放疗组采用 IMRT 放化疗同期组男 8 例, 女 0 例 ; 年龄 40 岁 5 例,>40 岁 3 例 ;KPS 评分 808 例,>800 例 ; 手术次全切 0 例, 全切 8 例 ; 肿瘤 5cm 例,>5cm6 例 ; 肿瘤位于幕上 5 例, 幕下 3 例 ; 手术后放疗 4 周 9 例,>4 周 9 例 单纯放疗组男 0 例, 女 9 例 ; 年龄 40 岁 6 例,>40 岁 3 例 ;KPS 评分 800 例,>809 例 ; 手术次全切 例, 全切 7 例 ; 肿瘤 5cm3 例,>5cm6 例 ; 肿瘤位于幕上 7 例, 幕下 例 ; 手术后放疗 4 周 例,>4 周 8 例 两组患者一般资料比较差异无统计学意义, 犘 >0.05. 放射治疗 采用 Primuse 医用直线加速器, 调强放疗采用 MLC 静态调强放疗技术, 定位前患者仰卧位, U 型热塑面膜固定体位, 平静呼吸状态下 CT 增强, 扫描范围从头顶至颅底部, 扫描层距 层厚 3 mm 将扫描图 像传输至 Topslane Venus 放疗计划系统工作站, 由放疗医师 影像科医师和物理师共同勾画靶区及脑干 眼球 神交叉 晶状体和垂体等危机器官及组织, 以 CT 和 MR 增强显示的肿瘤强化区或完全切除后残腔作为肿瘤靶区 (grosstumorvolume,gtv) 加上 MR Flair 像或 T 像上异常显示并外扩 cm 作为临床靶区 (clinical targetvolume,ctv), 外扩 3 mm 作为计划靶区 (planningtargetvolume,ptv) 第 个周期放疗缩野增量时 PTV 仅包括 MR 和 CT 增强后显示肿瘤强化区域或术后残腔外扩 3 mm, 图像经三维重建后, 在射野方向观设 5~6 个适形照射野, 根据正常组织的放疗耐受量预设目标函数, 逆向设计制定优化放疗方案 95% 等剂量包括 PTV,.8~.0Gy/ 次,5 次 / 周 放疗 40Gy 后缩野增量放疗至总量 60Gy.3 化疗方法 放射治疗的同时联合 TMZ 化疗 放疗期间 TMZ( 商品名 : 蒂清,50 mg/ 粒, 批号 :0070, 天津天士力公司 ; 泰道 :00 mg/ 粒, 批号 :78805; 0mg/ 粒, 批号 :784380, 美国默沙东公司 ) 75mg/(m d), 口服, 放疗结束 4 周后 TMZ 巩固化疗, 第 个周期 TMZ50 mg/(m d), 口服, 连服 5d,8d 为 个周期 若胃肠道及血液系统毒副作用 <Ⅱ 级, 第 个周期 TMZ00mg/(m d) 口服 若胃肠道及血液系统毒副作用 >Ⅲ 级,TMZ 剂量可以酌减 最低 00mg/(m d), 化疗共 6 个周期.4 观察指标 主要观察指标 :) 总生存期 ;) 无进展生存期 次要观察指标 :) 局部控制率 ;) 安全性 ( 常见不良反应情况 ) 对残留病灶治疗后近期放疗的评价, 根据 00 年 REST 实体瘤疗效评价标准分为完全缓解 (CR) 部分缓解 (RR) 稳定 (SD) 和进展 (PD) 远期放疗评价指标为中位生存期和生存率 不良反应按照美国国立癌症研究所常见毒副作用标准 NTCAE3.0 版进行评估 [3].5 随访 随访采用门诊或电话方式 治疗结束后 4 周开始复查,008 0 开始随访, 以后每 3~4 个月复查 次, 随访终点为患者死亡, 截止于 复查内