第 22 卷第 4 期 草业学报 2013 年 重金属胁迫蛋白组学研究技术 任何蛋白质实验的主要目的都是尽可能多地获得关于蛋白质组分定性 定量方面的信息 双向电泳 (two dimensionalelectrophoresis,2 DE) 和质谱分析 (massspectrometry,

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1 年 8 月 草业学报 ACTAPRATACULTURAESINICA 第 22 卷 第 4 期 Vol.22,No.4 植物响应重金属胁迫的蛋白质组学研究进展 薛亮, 刘建锋, 史胜青, 魏远, 常二梅, 高暝, 江泽平 ( 林木遗传育种国家重点实验室中国林业科学研究院林业研究所, 北京 ) 摘要 : 重金属对生态系统造成的污染已成为全球关注的问题 植物对重金属的摄取不仅影响其正常生长, 并能通过食物链来威胁人类及整个生态系统的健康 在 mrna 水平上的基因表达分析, 增强了人们对植物响应重金属的理解 然而, 关于相关功能基因组翻译方面的问题仍未得到有效解决 通过分析鉴定相关响应基因和功能蛋白, 获取翻译及翻译后水平上的信息, 能为植物响应重金属胁迫提供更深层次的理解 本研究分析比较了近年来重金属胁迫蛋白组学研究技术, 综述了植物响应重金属胁迫的蛋白组学研究进展, 探讨从亚细胞蛋白组学水平解析植物解毒重金属过程的可能性, 并提出未来该研究方向所面临的挑战及应对策略, 为揭示植物与重金属相互作用的分子机制提供有效方法 关键词 : 重金属 ; 胁迫 ; 响应 ; 亚细胞 ; 蛋白质组学中图分类号 :Q 文献标识码 :A 文章编号 : (2013) 犇犗犐 : /cyxb 近年来, 土壤有毒金属和准金属污染逐渐成为全世界普遍关注的问题 由于人类活动加剧 地球化学岩石风化及其他环境原因 ( 火山爆发 酸雨水和大陆粉尘 ), 土壤中金属镉 (Cd) 铜 (Cu) 铬 (Cr) 铝 (Al) 铅 (Pb) 汞 (Hg) 镍 (Ni) 及准金属砷 (As) 硼 (B) 等的含量急剧提升 据报道, 每年所有迁徙的有毒金属的毒性超过了所有 [1] 放射性废物和有机废物每年生产合并后的总毒性 有些重金属如铜 锌 锰等在一定水平时对植物没有毒害作用, 但当以高浓度出现在土壤中时, 它们也被视为植物细胞毒害物质, 其对许多生理生化过程具有潜在的抑制作用 植物一般对有毒金属高度敏感, 少量有毒金属胁迫即可使植物表现出不同的生理症状 然而, 也有一些植物 [2] 种类可以生长在含有某个特定元素的土壤中, 而土壤中该元素的浓度对其他植物有毒害作用 例如, 天蓝遏蓝 [3] 菜 ( 犜犺犾犪狊狆犻犮犪犲狉狌犾犲狊犮犲狀狊 ) 能在其生长与繁殖过程中吸收大量的有毒金属 准金属而被公认为是超富集植物 在植物响应重金属胁迫过程中, 对功能基因和相关蛋白质的识别可以促进富集重金属转基因植物的开发 [4 7] 在一些优秀的综述中, 将大量的生理生化分析作为主题来解析植物对重金属胁迫的响应 这些生理和生化分析为植物对重金属胁迫响应提供了一些见解, 但不能充分解释植物对重金属毒性响应的分子机制, 例如植物解毒和隔离重金属的过程 在过去十年中, 一些研究者通过转录组分析来研究植物在重金属胁迫下的基因表达方 [8 11] 式 这种在 mrna 水平的基因表达分析, 增强了对植物响应重金属的理解 然而, 转录组分析也存在一些缺陷 例如,mRNA 表达的变化与其相应蛋白质变化的相关性不明显 虽然,mRNA 和蛋白质之间的相关性已 [12] 被广泛关注, 但蛋白质表达的调控不仅体现在转录水平, 且在翻译及翻译后水平上均有体现 相比基因组预测的方法, 通过获取翻译和翻译后水平上的信息能为蛋白质的响应及功能上的相互作用提供更深层的理解 早期的蛋白质组学分析增强了对重金属胁迫下蛋白质丰度变化的了解, 但仍需要开展进一步的研究来确定具体的重金属生物标记, 以及相关生物转化和细胞区隔化研究 因此有必要讨论和关注最近的蛋白质组学实验设计和技术, 并从亚细胞水平揭示植物细胞内迁移 转化 排挤 封存以及参与重金属解毒的可能途径, 为认识蛋白质对重金属的响应提供更好的方法 本研究通过详细讨论植物重金属响应的蛋白组学相关研究, 试图为目前该领域的研究进展作一个全面的综述 收稿日期 : ; 改回日期 : 基金项目 : 国家科技支撑计划 (2011BAD38B0103), 国家科技支撑计划 (2012BAC09B03) 和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 (RIF ) 资助 作者简介 : 薛亮 (1984 ), 男, 浙江普陀人, 博士 E mail:linkeyuanxl@126.com 通讯作者 E mail:jiangzp@caf.ac.cn

2 第 22 卷第 4 期 草业学报 2013 年 重金属胁迫蛋白组学研究技术 任何蛋白质实验的主要目的都是尽可能多地获得关于蛋白质组分定性 定量方面的信息 双向电泳 (two dimensionalelectrophoresis,2 DE) 和质谱分析 (massspectrometry,ms) 作为蛋白组学研究的有效方法而被广泛 [13] 应用, 并为复杂生物功能蛋白网络的研究提供一个新的平台 蛋白质组学分析通常利用三氯乙酸或丙酮溶液 [14 17] 沉淀法提取组织或细胞的全蛋白质组 然而, 这些方法适用于植物新生组织蛋白的提取, 而不适用于复杂及 [18] 成熟的组织 1.1 Gel based 蛋白组学技术目前, 植物蛋白质组的分离主要是依据分子量大小 等电点 溶解度以及对配体的特异亲和力等的不同进行的, 具体方法主要有 2 DE 差异凝胶电泳 (diferencegelelectrophoresis,dige) 毛细管电泳 (capilaryelectro [19] phoresis,ce) 和高效液相色谱 (highperformanceliquidchromatography,hplc) 等技术 2 DE 是目前最基础和常用的方法, 它能够在一块胶上同时分离几千个蛋白质组分 2 DE 与 Edman 测序 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MAL) 或电喷雾电离串联质谱 (ESI MS/MS) 分析联用是用于有毒金属蛋白组学研究的最常用技术 此外, 单向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1 DESDS PAGE) 与反相高效液相色谱 (RP HPLC) 联用并结 [20] 合 MS 分析的方法, 也常被用于金属诱导的相关蛋白的鉴定 然而, 这种经典的方法具有一些缺陷, 例如分离的蛋白丰度低 膜蛋白被分离的难度大 因此, 通过在电泳分离前使用丙酮 三氯乙酸 异丙醇 硫酸铵 乙醇 氯 [21] 仿 甲醇, 聚乙烯乙二醇及亲和层析试剂等蛋白质富集试剂, 从而提高这些蛋白的可检测性 由于胶体间存在固有的变化性, 影响了 2 DE 双向电泳的复现性 针对此问题, 差异凝胶电泳技术 (difer encegelelectrophoresis,dige) 应运而生 在 DIGE 中, 不同样品被不同的荧光染料标记, 使得几个蛋白样品能在单一胶体中进行比较对照 荧光染色技术对蛋白质无固定作用, 与质谱兼容性好, 为蛋白质组学研究提供了很 [22] [23] 大的帮助 DIGE 荧光凝胶图谱是相对定量的, 凝胶斑点包含了表达存在差异的蛋白 DIGE 与传统的 2 DE 相比具有很大的优势, 但其在植物逆境蛋白组学研究中仍未得到广泛使用 BN(bluenative) 凝胶和 SDS PAGE 凝胶为分离细胞器蛋白组中的蛋白质复合物提供理想的方法 该方法通过将细胞器中的蛋白质复合物经溶解后, 运用染色剂 ( 如考马斯染料 ) 与孤立复合物结合, 并被 PAGE 分开 BN PAGE 使蛋白质在自然条件下有效溶解, 并能直接对给定蛋白组的差异变化进行定量评价 锰 (Mn) 的毒性诱导引起的叶片质外体蛋白组的变化已通过 BN SDS PAGE 和 2 DEBN/BNPAGE 被证明, 相关响应蛋白通过 [24,25] [26] nano LC MS/MS 方法被鉴定 最近,Fagioni 等使用 2 D BN SDS PAGE 结合 nano RP HPLC ESI MS/MS 的方法, 分析了菠菜 ( 犛狆犻狀犪犮犻犪狅犾犲狉犪犮犲犪 ) 叶片 Cd 胁迫下类囊体膜蛋白复合物的响应 为了更好地理解 [27] Cu 的运输 螯合及封存过程,Kung 等通过固定化金属亲和层析技术在拟南芥 ( 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 ) 根中筛选与 Cu 相互作用的蛋白 他们确定了共 35 种独特的蛋白, 包括 6 个可能与 Cu 结合的蛋白 1.2 Gel Free 蛋白组学技术尽管如此, 双向电泳 2 DE 依然是分析复杂蛋白质混合物最有效的方法, 它能够以高度重复的方式显示几百种蛋白质 ; 但是该技术不能满足分离鉴定在细胞器蛋白质组中可溶 不溶或具高度疏水性的多亚基复合物的核心组分 此问题可以通过使用 Gel Free( 非凝胶 ) 技术加以解决, 例如多维蛋白质鉴定技术 (multidimensionalpro teinidentificationtechnology,mudpit) 该方法首先从待研究样品中提取蛋白质, 将其酶解成肽段混合物后, [28] 采用强阳离子交换及反相色谱法进行层析分离 但是,MudPIT 技术由于不能进行蛋白质的定量表达分析而使它的应用受到很大的限制 在过去 10 年中, 几种基于蛋白或多肽标记的定量蛋白组学方法取得一定的发展 例如, 同位素编码亲和标记 (isotope codedafinitytag,icat) 氨基酸稳定同位素标记 (stable isotopelabelingbyaminoacids,silac) 同位素相对标记与绝对定量 (isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,itraqs) 同位素编码蛋白标记 [29 33] (isotope codedproteinlabel,icpl) 和 N 端标记 (N terminallabeling) 等 目前, 应用这些二代蛋白组学研 [34] 究技术开展重金属胁迫的相关研究较少 通过使用 itraqs 技术,Paterson 等进行耐 B 与不耐 B 大麦 ( 犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲 ) 品种间的蛋白组分析比较, 他们成功地从根部鉴定了大量蛋白 itraq 技术在胁迫响应蛋

3 302 ACTAPRATACULTURAESINICA(2013) Vol.22,No.4 白质的鉴别方面具有相当大的潜力, 尤其当该技术与分离群体分析方法结合使用时, 能提高人们对植物在胁迫条件下耐受力的理解 总之, 经典蛋白质组学技术是植物金属胁迫下研究蛋白质组变化最常用的方法之一 二代蛋白组学技术如 MudPIT ICATs itraqs SILAC 及 ICPL 技术正在不断发展, 但仍处于研究和应用的初始阶段 2 植物响应重金属胁迫蛋白组学研究植物在生长发育过程中往往会遭受旱涝 高温 低温及重金属等非生物胁迫, 植物在适应这些胁迫过程中产生了一系列从细胞到生理水平的应答反应 这些逆境胁迫可以引起大量蛋白质在种类和表达量上的变化, 蛋白质组学研究将有助于了解胁迫因子的伤害机制以及植物的适应机制 本研究综述了运用蛋白组学方法和技术, 研究拟南芥 水稻 ( 犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪 ) 大麦等模式植物以及天蓝遏蓝菜等超富集植物对重金属胁迫的响应机制 ( 表 1) 表 1 植物响应重金属胁迫蛋白组学研究相关文献 犜犪犫犾犲 1 犘狌犫犾犻犮犪狋犻狅狀狊狉犲犾犪狋犲犱狋狅狆狉狅狋犲狅犿犻犮犪狆狆狉狅犪犮犺犲狊犳狅狉狆犾犪狀狋狉犲狊狆狅狀狊犲狊狋狅犺犲犪狏狔犿犲狋犪犾狊 重金属 植物种类 材料 蛋白组学方法 主要结论 参考文献 Heavymetal Plantspecies Material Proteomicmethod Mainconclusion References Cd 水稻犗狉狔狕犪狊犪 根 Root 新陈代谢酶 ATP 活动相关调节蛋白受 Cd 诱导 Metabolicenzymeand [35] 狋犻狏犪 regulatoryproteinswasinducedbycd. 水稻犗狉狔狕犪狊犪 种子 Seed 抗氧化及 Cd 胁迫相关调节蛋白显著上调 Proteinssuchasantioxidant [36] 狋犻狏犪 proteinsinvolvedincdstresswereupregulatedsignificantly. 杨树犘狅狆狌犾狌狊 叶 Leaf 植物生长受到抑制的同时对光合同化物的需求降低 ; 线粒体的呼吸作用表 [37] 狋狉犲犿狌犾犪 达升高 Photoassimilateswerelessneededwithgrowthinhibition;mito chondrialrespirationwasupregulated. 秋茄犓犪狀犱犲犾犻犪 根 Root 大部分能量和物质代谢 蛋白质代谢 氨基酸转运及代谢 解毒及抗氧化作 [38] 犮犪狀犱犲犾 DI TOF/ 用及信号传导相关蛋白表达上升 Mostproteinsinvolvedin metabolism TOF MS ofenergy,materandprotein,aminoacidtransportand metabolism,de toxificationandantioxidation,andsignaltransductionwereupregulated. 单胞藻 细胞 Cel 光合作用 卡尔文循环和叶绿素合成相关蛋白质丰度降低, 谷胱甘肽生物 [39] 犆犺犾犪犿狔犱狅犿狅狀犪狊 合成 ATP 及氧胁迫响应相关蛋白质的丰度升高 Photosynthesis,calvin 狉犲犻狀犺犪狉犱狋犻 cycleandchlorophylsynthesisrelatedproteinsdecreasedinabundance,gsh biosynthesis,atpandoxidativestressrelatedproteinsincreasedinabundance. 天蓝遏蓝菜 根 枝 2 DE 植物不同品种间的蛋白质表达存在差异 Proteinexpressionsweredifer [40] 犜犺犾犪狊狆犻犮犪犲狉狌犾犲狊犮犲狀狊 Root,shoot entbetweendiferentplantaccessions. 垂序商陆犘犺狔 枝 Shoot MALDI 蛋白质表达的变化主要发生在光合途径 硫及谷胱甘肽相关代谢过程中 [41] 狋狅犾犪犮犮犪犪犿犲狉犻 TOF/TOF Proteinexpressionschangedmainlyinphotosyntheticpathway,sulfur,and 犮犪狀犪 MS glutathionerelatedmetabolicprocess. 东南景天犛犲 叶 根 蛋白合成 信号传导 光合作用等相关蛋白表达发生变化 Proteinsin [42] 犱狌犿犪犾犳狉犲犱犻 Leaf,root, volvedin proteinsynthesis,signaltransductionand photosynthesisex ESI MS presseddiferently. As 玉米犣犲犪犿犪狔狊 枝 Shoot 氧化胁迫在 As 对植物毒害过程中起主要作用 Oxidativestressplaya mainroleinarsenicphytotoxicity. [43] 水稻犗狉狔狕犪狊犪 根 Root SAMS GSTs CS GST tau 及 TSPP 的表达水平在 As 诱导下显著上升 [44] 狋犻狏犪 TheexpressionsofSAMS,GSTs,CS,GST tauandtsppwereupregulat edsignificantlyinducedbyas.

4 第 22 卷第 4 期 草业学报 2013 年 303 续表 1 Continued 重金属 植物种类 材料 蛋白组学方法 主要结论 参考文献 Heavymetal Plantspecies Material Proteomicmethod Mainconclusion References 细弱剪股颖 叶 Leaf 几种参与光合作用的蛋白含量随着 As 胁迫浓度的升高而降低 Several [45] 犃犵狉狅狊狋犻狊狋犲狀狌犻狊 proteinsinvolvedinphotosynthesisdecreasedinabundanceasthein creaseofarsenicconcentration. Cr 玉米犣犲犪犿犪狔狊 根 Root CE,2 DE, MALDI TOF/TOF MS 金属硫蛋白相应增加 ; 抗氧化系统在 Cr 胁迫下首先被激活 ; 与糖代谢相关的 ATP 合成酶上调 Relevantincreasein metalothionein,antioxi dantsystem wasfirstlyactivatedunderthecrstress,atpsynthasere latedtoglucosemetabolism wereupregulated. [46] 以月牙犘狊犲狌犱狅犽犻狉犮犺 细胞 Cel 2 DE,LC 光合作用及代谢相关蛋白受 Cr 诱导 Proteinsinvolvedinphotosynthe [47] 狀犲狉犻犲犾犪狊狌犫犮犪狆犻狋犪狋犪 ESI MS/MS sisandmetabolism wereinducedbycr. 芒犕犻狊犮犪狀狋犺狌狊狊犻狀犲狀狊犻狊 根 Root MALDI TOF/TOF MS,2 DE 离子运输 能量及氮代谢相关蛋白和氧胁迫相关调节蛋白受 Cr 诱导 Proteinsinvolvediniontransport,energyandnitrogen metabolismand oxidativestressregulationwereinducedbycr. 与线粒体氧化磷酸化相关蛋白显著降低 ; 泛素 蛋白水解酶复合体通路猕猴桃犃犮狋犻狀犻犱犻犪花粉 2 DE,LC 均受到影响 Proteinsinvolvedin mitochondrialoxidativephosphoryla 犮犺犻狀犲狀狊犻狊 Polen ESI MS/MS tion decreased significantly,ubiquitin proteasome pathway was dis turbed. Cu 水稻犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪 叶 Leaf 2 DE 许多参与植物光合作用的蛋白受 Cu 诱导, 造成植物正常的光合途径受 到严重影响 ProteinsinvolvedinphotosynthesiswereinducedbyCu, [48] [49] [50] resultinsevereefectioninphotosyntheticpathway. 拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊幼苗 Seed RLC MS/MS 几种 GSTs 基因表达量上升 SeveralgenesGSTswereupregulated. [51] 海州香薷犈犾狊犺狅 根 叶 2 DE,MALDI 根细胞代谢途径的改变及氧化还原反应的内平衡可能是解毒 Cu 的重要 [52] 犾狋狕犻犪狊狆犾犲狀犱犲狀狊 Root,leaf TOFMS,LTQ 机制 Transformationofmetabolicpathwayinrootcelandredoxho ESI MS/MS meostasismightbeimportantsurvivalmechanismsuponcustress. Al 番茄犛狅犾犪狀狌犿犾狔 根 Root DIGE SDS 诱导蛋白作用于调节体内抗氧化系统 解毒机制 有机酸代谢及甲基循 [53] 犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 MALDI TOF 环 Proteinsinvolvedinregulatingantioxidantsystem,detoxification TOF MS mechanism,organicacidmetabolismandmethylcyclewereinduced. Pb 长春花 叶 Leaf 三羧基酸循环 糖酵解 莽草酸运输 植物螯合肽合成 氧化还原平衡及 [54] 犆犪狋犺犪狉犪狀狋犺狌狊 信号传导相关蛋白受 Pb 诱导 Proteinsinvolvedinthreecarboxylicacid 狉狅狊犲狌狊 circulation,glycolysis,shikimicacidtransportation,phytochelatinsyn thesis,redoxbalanceandsignaltransductionwereinducedbypb. Hg 扁枝衣犈狏犲狉狀犻犪 细胞 Cel 2 DE 叶绿体光系统 Ⅰ 作用中心的 Ⅱ 亚基 ATP 合成酶 β 亚基及氧化作用相关 [55] 狆狉狌狀犪狊狋狉犻 蛋白受 Hg 诱导 ProteinsinvolvedinchloroplasticphotosystemⅠreaction centersubunitⅡ,atpsynthaseβ subunitandoxidationwereinducedbyhg. B 大麦犎狅狉犱犲狌犿 叶 根 itraq, 铁载体合成相关的 3 种蛋白缺铁敏感蛋白 IDS2 IDS3 及甲硫基核糖激 [56] 狏狌犾犵犪狉犲 Root,leaf ESI MS/MS 酶上调 Threeenzymesinvolvedinsiderophoreproduction [IronDeficiency Sensitive2(IDS2),IDS3andmethylthio ribosekinase]wereupregulated. Ni 庭芥犃犾狔狊狌犿犾犲狊 根 枝 2 DE,MS Ni 诱导下硫代谢 活性氧防御及热激响应相关蛋白表达量发生变化 [57] 犫犻犪犮狌犿 Root,shoot Proteinsinvolvedinsulphurmetabolism,reactiveoxygenspeciesdefense andheat shockresponsewereinducedbyni.

5 304 ACTAPRATACULTURAESINICA(2013) Vol.22,No 镉在所有重金属中, 镉 (Cd) 是最受关注的元素之一 Cd 对植物具有极强的毒害作用, 它的阳离子能被植物根 [58] [35] 系迅速吸收 Aina 等分析了高浓度 Cd 条件下水稻蛋白质组响应及某些生理生化参数 通过根组织的蛋白质组分析表明, 高浓度 Cd 能强烈诱导 ER1 like 接受器酶 细胞分裂氧化酶及如肉桂醇脱氢酶等新陈代谢酶调节蛋白的表达, 而参与 ATP 活动的蛋白质在 Cd 胁迫响应过程中减少 植物对金属的敏感性及金属对植物的毒 [59] [36] 性不仅与有毒物类型和浓度有关, 也受植物所处的发育阶段影响 Ahsan 等研究经过 4d 萌发的水稻种子在高浓度 Cd 胁迫下的蛋白质组响应, 发现抗氧化及其胁迫相关调节蛋白显著上调 该研究表明, 这些蛋白在发 [37] 芽阶段参与了响应 Cd 胁迫新的动态平衡的建立 Kiefer 等通过对杨树 ( 犘狅狆狌犾狌狊狋狉犲犿狌犾犪 ) 无性系叶片在 Cd 胁迫下的全蛋白质组分析发现, 植物生长受到抑制的同时对光合同化物的需求降低 同时, 线粒体的呼吸作用表 [38] 达升高, 为植物响应 Cd 胁迫提供能量需求 翁兆霞以秋茄 ( 犓犪狀犱犲犾犻犪犮犪狀犱犲犾 ) 为材料, 分离鉴定 Cd 胁迫下差异表达的蛋白, 发现大部分能量和物质代谢 蛋白质代谢 氨基酸转运及代谢 解毒及抗氧化作用及信号传导相关蛋白表达量上升 除了高等植物以外, 低等植物及金属超富集植物蛋白质 Cd 胁迫响应的研究工作也取得一定进展 Gilet [39] 等在单胞藻 ( 犆犺犾犪犿狔犱狅犿狅狀犪狊狉犲犻狀犺犪狉犱狋犻 ) 中发现, 一些光合作用 卡尔文循环和叶绿素合成相关蛋白质丰度在 Cd 胁迫下显著降低, 而谷胱甘肽生物合成,ATP 及氧胁迫响应相关蛋白质的丰度则有所增加 为了研究遏蓝 [40] 菜等植物的金属超积累机制,Tuomainen 等对不同种源的天蓝遏蓝菜进行了比较蛋白质组学研究 研究结果表明, 尽管 Cd 胁迫对每种植物的蛋白质组影响较小, 但植物间的蛋白质组存在显著差异 这几种天蓝遏蓝菜植物根部的 267 个蛋白点和枝条的 246 个蛋白点存在极显著差异 此外, 根部的 68 个蛋白点 枝条的 17 个蛋白点在种间的差异较金属间的差异显著, 表明物种是造成这些差别的主要因素 同时, 一些抗氧化相关蛋白质的丰度在耐重金属植物体内显著增加, 这表明抗氧化相关蛋白质可能参与提高天蓝遏蓝菜对重金属的耐受力 Zhao [41] 等对 Cd 胁迫下垂序商陆 ( 犘犺狔狋狅犾犪犮犮犪犪犿犲狉犻犮犪狀犪 ) 幼苗叶片进行蛋白质组分析, 以揭示其耐 Cd 的分子机理 通过 MALDI TOF/TOF 质谱分析结合蛋白质数据库检索, 共发现 14 个上调基因,11 个下调基因 蛋白质表达的变化主要发生在光合途径以及硫和谷胱甘肽的相关代谢过程中 1/3 的上调蛋白为转录 翻译相关蛋白及包括一个钙网蛋白在内的分子伴侣 其他蛋白质主要包括抗氧化酶, 如 :2 半胱氨酸 过氧化物酶 氧化还原酶等 [42] 金晓芬以 Cd 超积累植物东南景天 ( 犛犲犱狌犿犪犾犳狉犲犱犻 ) 为材料, 分析 Cd 胁迫下不同生态型蛋白质 组差异及蛋白质表达, 初步鉴定了 49 个可能与 Cd 耐性或积累相关的蛋白质, 这些蛋白功能涉及蛋白合成 信号传导 转录 初级代谢 光合作用 细胞结构 转运子 蛋白储存等 2.2 砷砷 (As) 在土壤和地表水中的溶解度很高, 对植物和动物都是非必需元素, 是主要的有害准金属之一 砷对植物的毒性作用在生理 生化方面分析较多, 从蛋白质组水平上开展植物对砷胁迫的响应研究较少 Requejo 和 Tena [43] 首先将蛋白组学应用于 As 对植物毒害的研究, 他们发现在用 As(Ⅴ) 或 As(Ⅲ) 处理的玉米 ( 犣犲犪犿犪狔狊 ) 中, 约 15% 的蛋白质表达发生变化, 共鉴定了 7 种蛋白, 这些蛋白主要是与细胞氧化相关, 说明 [44] 氧化胁迫在 As 对植物毒害过程中起主要作用 Ahsan 等通过对砷诱导下的水稻根进行比较蛋白质组分析发现, 根部的脂类过氧化反应 GSH 及 H 2O 2 含量和 As 的累积随着 As 胁迫浓度的提升而增加 同时, 根部的蛋白质组也发生极大的变化,SAMS GSTs CS GST tau 及 TSPP 的表达水平在 As 诱导下显著上升 Duquesnoy [45] 等通过对细弱剪股颖 ( 犃犵狉狅狊狋犻狊狋犲狀狌犻狊 ) 的叶片蛋白组分析表明, 几种光合作用相关的蛋白表达明显受到 As 的抑制, 导致植物叶片诱发变色病 2.3 铬铬 (Cr) 在地层中的储量位居第 7 在自然界中主要以 Cr 3+ 和 Cr 6+ 两种价态存在, 均能对植物的器官和组织 [60] 造成伤害 铬的植物毒性可以抑制种子萌发 降低色素含量 扰乱体内养分平衡及活性氧的产生 Labra [46] 等首先将蛋白质组学应用于植物对 Cr 胁迫响应的研究 他们通过毛细管电泳发现随着 Cr 胁迫浓度的增加, 玉米幼苗根部的金属硫蛋白相应增加 通过对差异蛋白鉴定分析发现, 玉米的抗氧化系统在 Cr 胁迫下首先被激

6 第 22 卷第 4 期 草业学报 2013 年 305 活, 相关抗氧化酶包括 : 超氧化物歧化酶 半胱氨酸过氧化还原酶和乙二醛酶 此外, 还发现与糖代谢相关的 [47] ATP 合成酶在 Cr 胁迫下上调 Vannini 等通过对以月牙藻 ( 犘狊犲狌犱狅犽犻狉犮犺狀犲狉犻犲犾犪狊狌犫犮犪狆犻狋犪狋犪 ) 在 Cr 胁迫下的蛋白质表达谱进行分析, 共发现 16 种受 Cr 诱导的蛋白质 其中, 与光合作用相关蛋白包括 1,5 二磷酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶 (RuBisCO) 1,5 二磷酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶活化酶 (RuBisCOactivase) 光合叶绿素 a/b 蛋白质及胁迫相关的叶绿素 a/b 结合蛋白 同时, 与氨基酸 谷胱甘肽 精氨酸及蛋氨酸代谢相关蛋白也受到 Cr 的诱 [48] 导 Sharmin 等研究了 Cr 诱导下芒 ( 犕犻狊犮犪狀狋犺狌狊狊犻狀犲狀狊犻狊 ) 根部的蛋白表达差异, 共鉴定出 36 种蛋白质 其中大多数为离子运输 能量及氮代谢相关蛋白和氧胁迫相关调节蛋白, 它们在 Cr 胁迫下通过协同作用以建立一种 [49] 新的体内平衡 Vannini 等研究了 Cr 3+ Cr 6+ 处理后发芽猕猴桃 ( 犃犮狋犻狀犻犱犻犪犮犺犻狀犲狀狊犻狊 ) 花粉蛋白组的变化, 发现与线粒体氧化磷酸化相关的 2 种蛋白在 2 种 Cr 胁迫下显著降低, 泛素 蛋白水解酶复合通路均受到影响 实验结果同时表明, 错误折叠或受损蛋白的间接积累是 Cr 3+ 对花粉造成毒害的重要分子机制之一 2.4 铜铜 (Cu) 是植物生长和发育过程中所必需的微量元素, 主要以 Cu + 和 Cu 2+ 形式存在 由于其独特的氧化还原属性, 它在细胞的生化和生理过程中起到非常关键的作用 例如,Cu 是光合作用 线粒体呼吸作用 氧胁迫响应及乙烯信号传导过程中重要的辅助因子 然而, 高浓度的铜对植物具有毒性 例如,Cu 催化发生的 Haber [61] Weiss 和 Fenton 反应能促使植物产生过氧化物, 通过破坏植物体细胞组分影响其内养分循环和代谢 [50] 用蛋白组学方法研究 Cu 对植物的毒理作用已有不少报道 Hajduch 等首先研究了 Cu 胁迫对水稻叶片蛋白质的影响, 结果发现许多参与植物光合作用的蛋白受 Cu 诱导, 造成植物正常的光合途径受到严重影响 此 [51] 外,Smith 等研究了拟南芥中 GSTs 响应 Cu 胁迫的蛋白组学分析 通过反液相色谱与质谱联用 (RLC MS/ MS) 分析发现,Cu 处理样品的 GSTs 基因 ( 犃狋犌犛犜犉 2, 犃狋犌犛犜犉 6, 犃狋犌犛犜犉 7, 犃狋犌犛犜犉 8) 的表达水平提高, 表明 [52] 这 4 类 GSTs 可能在缓解 Cu 对植物细胞毒害过程中发挥着某种特殊的作用 Li 等研究了 Cu 胁迫下海州香薷 ( 犈犾狊犺狅犾狋狕犻犪狊狆犾犲狀犱犲狀狊 ) 根和叶的蛋白组学特性, 发现其叶片中 RuBisCo 光合作用及抗氧化相关蛋白上调, 并提出根细胞代谢途径的改变及氧化还原反应的内平衡可能是解毒 Cu 的重要机制 2.5 其他重金属相比以上几种重金属,Al Pb Hg B Ni 等元素诱导的植物逆境蛋白组学研究工作也取得了一定进展 [53] Zhou 等分析 Al 处理下番茄 ( 犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 ) 根组织蛋白组的变化, 共鉴定 49 个差异表达蛋白 这些 [54] 蛋白作用于调节体内抗氧化系统 解毒机制 有机酸代谢及甲基循环 Kumar 等对 Pb 胁迫下长春花 ( 犆犪狋犺犪 狉犪狀狋犺狌狊狉狅狊犲狌狊 ) 的差异表达蛋白进行分析, 发现三羧基酸循环 糖酵解 莽草酸运输 植物螯合肽合成 氧化还原 [55] 平衡及信号传导相关蛋白在植物抗氧化胁迫过程中起了关键作用 Nicolardi 等发现在恒定浓度 Hg 胁迫下, 地衣 (lichen) 体内与光合途径相关的蛋白质发生变化, 包括叶绿体光系统 Ⅰ 作用中心的 Ⅱ 亚基 ATP 合成酶 β 亚 [56] 基及氧化作用相关蛋白 这表明, 光合作用是 Hg 对植物造成毒害的主要途径之一 John 等运用 itraq 技术, 鉴定了 B 胁迫下大麦与铁载体合成相关的 3 种上调蛋白 ( 缺铁敏感蛋白 IDS2 IDS3 及甲硫基核糖激酶 ) In [57] gle 等从蛋白组学水平上研究了超富集植物庭芥 ( 犃犾狔狊狌犿犾犲狊犫犻犪犮狌犿 ) 耐 Ni 的分子机制, 发现 Ni 诱导下与硫代谢 活性氧防御及热激响应相关蛋白表达量发生变化 3 植物解毒重金属的亚细胞蛋白组学研究 [62] 植物细胞内对重金属的累积及解毒场所主要包括细胞壁 细胞膜 胞液及液泡隔室 相关研究表明, 植物对重金属的解毒作用主要依靠一系列特殊的细胞途径, 包括金属通过与细胞壁结合而进入细胞, 经细胞膜的跨膜运输进入胞液, 最后在氨基酸 多肽及有机酸作用下被输送及储存在液泡中 应用高通量的蛋白质组学方法, 从亚细胞水平研究植物解毒重金属机理, 为深入理解植物细胞对重金属的解毒及生物转化过程提供有效方法 3.1 细胞壁植物根部的细胞壁最先与土壤重金属接触 细胞壁除了维持细胞形状 大小及硬度外, 通过分泌多肽或改变 [63,64] 细胞壁蛋白的丰度, 为植物抵抗重金属胁迫提供防护屏障 在 Al 胁迫条件下, 一些耐 Al 植物根部分泌的 [65] 柠檬酸 草酸及苹果酸能与 Al 形成稳定复合物, 从而降低其对植物根的伤害 在 Cd 胁迫下, 亚麻 ( 犔犻狀狌犿狌狊

7 306 ACTAPRATACULTURAESINICA(2013) Vol.22,No.4 [66] itatisimum) 幼苗细胞壁出现增厚, 果胶结构发生明显变化 Douchiche 等研究发现, 亚麻通过调节同型半乳 [67] 糖醛酸聚糖的甲基酯化模式, 以适应 Cd 胁迫下皮层组织细胞壁结构的变化 此外,Xiong 等研究发现, 水稻在 Cd 胁迫下, 氮氧化物的外源应用使根细胞壁中果胶及半纤维素的含量增加, 从而提高其对 Cd 的耐受性 Jiang 和 Liu [64] 研究了 Pb 胁迫下, 大蒜 ( 犃犾犻狌犿狊犪狋犻狏狌犿 ) 根细胞壁超微结构的改变及富含半胱氨酸蛋白的合成及分布情况 实验结果表明, 细胞壁中富含半胱氨酸蛋白与 Pb 离子相互作用而将其固定 目前, 仅在玉米 小麦 ( 犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿 ) 大豆 ( 犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓 ) 等农作物中开展过水分胁迫下的细胞壁蛋白组学研究, 对重金属胁 [68 70] 迫下植物细胞壁蛋白质响应分析未见报道 3.2 细胞膜膜蛋白在许多细胞过程中起到非常重要的作用, 如不同信号传导途径的调节 植物细胞拥有许多转运蛋白, 包括阳离子转运促进蛋白 锌铁调控蛋白 (Zrt andirt likeproteins,zips) 阳离子交换蛋白 Cu 转运蛋白 重金属 P 型 ATP 酶 (heavy metalp typeatpases,hmas) 自然抗性相关巨噬细胞蛋白 ATP 结合盒转运蛋白 (ATP bindingcassetetransporters,abc) 目前, 只有少量的重金属转运蛋白被鉴定, 其中绝大多数受多基因家族编码 例如, 在拟南芥中, 共有 15 个 ZIP 基因 12 个耐重金属蛋白基因及 8 个与金属转运相关的 HMA 基 [71,72] 因 细胞膜是细胞阻止重金属在体内扩散的最初活性屏障 通过鉴定受基因编码的金属渗入及迁移相关膜蛋白, 有助于深入理解植物细胞对重金属的解毒过程 然而, 关于细胞膜控制金属渗入及迁移的机制研究仍处于初级阶段 3.3 细胞基质细胞基质中的蛋白不直接参与重金属的解毒过程, 而多种信号传导途径中的蛋白在金属胁迫下表达发生变化 GSH PCs 有机酸及类黄酮等代谢物普遍都在细胞基质中合成 在重金属胁迫下, 这些代谢物能与重金属 [73,74] 结合而起到解毒作用 在这些代谢物合成途径中, 相关的基因和蛋白主要位于细胞基质中 因此, 通过细胞基质蛋白组学分析, 有助于更好地理解植物细胞对重金属的解毒过程 研究表明, 乙烯合成相关蛋白 S 腺苷甲硫氨酸合成酶 (S adenosyl L methioninesynthetase,sams) 在 Cd [75,76,44] Al 和 As 等重金属胁迫后上调 L 蛋氨酸和 ATP 在 SAMS 的催化作用下, 经过硫化反应合成 SAM SAM 同时也能作为 GSH 的前体物, 而 GSH 在金属运输 存储及代谢过程中起着非常重要的作用 茉莉酸 (jas [77] monicacid,ja) 是植物生长的重要调节物质 Rodríguez Serrano 等研究发现 JA 水平及其合成相关蛋白的表达量在重金属胁迫下增加 据此,JA 被认为可能直接涉及重金属的解毒机制或者间接调节 GSH 生物合成途径 此外, 与 GSH 和 PCs 合成相关蛋白也能直接参与重金属的解毒过程 在重金属解毒相关蛋白中, 半胱氨酸合成酶 (cysteinesynthase,cs) 和谷胱甘肽巯基转移酶 (glutathiones transferase,gst) 是 2 种最普遍的参与重 [78] 金属响应的蛋白质 CS 是半胱氨酸 (cysteine,cys) 合成途径中最主要的酶, 而 Cys 是 GSH 和 PCs 生物合成途径中主要的前体之一 例如, 在拟南芥中 8 种 GST 蛋白 (GSTF2,GSTFs6 10,GSTU19 和 GSTU20) 在 Cu 胁 [51] 迫下表达发生变化 此外, 对水稻进行砷酸盐胁迫发现, 根部细胞中包含 Omega 基因的 GST 表达量在处理下显著上升, 而在其他重金属如亚砷酸盐 Cu 及 Al 的诱导下没有发生变化 结果表明,GST Omega 基因可能涉及 As 的生物转化和新陈代谢 总之, 许多与重金属解毒过程相关的细胞基质蛋白还未被认识, 这些蛋白可能直接或通过几个不同途径间接地发挥作用 3.4 液泡 [79] 液泡是植物细胞实现重金属内平衡及解毒重金属的主要场所 例如,Ni 超富集植物天蓝遏蓝菜通过将 [80] 叶片细胞内的大量 Ni 封存到液泡内以提高植物对该金属的耐受性 此外, 一些液泡重金属转运蛋白通过生物膜, 将细胞基质内的自由或结合态金属运输到液泡中 例如 P 型 ATP 酶 ATP 结合盒转运蛋白 (ATP bind ingcassetetransporters,abc) 和阳离子交换转运蛋白 (cationexchangertransporters,cax) [81 83] 然而, 由于分离高纯度的液泡难度大, 液泡调解重金属毒性的相关蛋白及分子机制尚未深入研究 目前, 仅在拟南芥, 水稻, 大麦及花椰菜 ( 犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪 ) 等少量植物中进行过液泡或液泡膜的蛋白组分

8 第 22 卷第 4 期 草业学报 2013 年 307 [84 87] 析 最近, 一种定量蛋白组学方法被用于研究大麦液泡中的 Cd 调控蛋白, 最终鉴定出一些与 Cd 解毒过程 [82] 直接相关的转运蛋白, 包括 CAX1a MRP3 like 蛋白和 γ 液泡膜内在蛋白 尽可能多地阐明液泡转运蛋白的特性和功能, 有助于更完整地理解细胞基质在金属胁迫下的平衡机制 以超富集与非超富集植物为研究对象, 开展金属胁迫下的比较蛋白组学研究, 有利于明确液泡蛋白质在金属沉积及积累中所起的作用 4 问题与展望蛋白质是生物功能的执行者和主要体现者 从蛋白组学水平开展植物对重金属胁迫的响应研究, 能为深入揭示其对植物生命活动规律及重要生理 病理现象提供重要方法 但蛋白质组学在该领域应用过程中仍面临许多挑战 1) 蛋白质组学研究的相关技术有待进一步提升 例如, 样品制备中蛋白质提取 纯化的制约因素较多, 低丰度植物蛋白的鉴定难度较大 因此, 有必要开展样本制备新技术的研究, 包括不受金属与蛋白相互作用影响的蛋白萃取 重金属作用产生的特殊分子途径以及重金属毒性生物标记的鉴定方法 此外, 通过在蛋白质电泳分离前率先提高蛋白质丰度是解决该问题的一种策略 2) 从亚细胞水平开展植物重金属响应蛋白组学研究较少 植物解毒及忍耐重金属的主要细胞器为细胞壁 细胞膜 细胞基质及液泡 因此, 应更多地开展植物细胞器蛋白组学研究, 例如, 鉴定将重金属从细胞膜运输到液泡的转运蛋白, 揭示金属转运蛋白与其他蛋白或代谢物的相互作用, 建立耐性植物解毒特定重金属的完整蛋白网络, 并运用比较蛋白组方法分析超富集与非超富集植物细胞器解毒重金属的差异, 为深入理解植物细胞对重金属的解毒及生物转化过程提供有效方法 3) 植物解毒重金属过程中的蛋白间相互作用尚未深入研究 尽管一些关于将重金属从细胞质膜运输到液泡的转运蛋白被成功鉴定, 但植物在重金属胁迫下, 通过翻译后修饰 ( 例如, 磷酸化作用 脱磷酸作用及谷胱甘肽修饰作用等 ) 使其蛋白质发生变化 该信息不仅有利于蛋白丰度变化的确定, 还能够判断一种亚型蛋白是否通过翻译后修饰被激活或去活化 因此, 通过分析翻译后修饰蛋白及氧化还原蛋白质组, 能为深入了解植物响应重金属胁迫提供一种潜在的方法 总之, 关于植物响应重金属蛋白质组学方面的研究有待进一步深入 通过发展蛋白质组学研究新技术, 剔除蛋白质样品制备的制约因素, 并提高低丰度蛋白的鉴定率 通过对植物解毒重金属过程中的组织特异性蛋白质组或基于器官亚细胞的蛋白质组进行分析, 尝试建立植物解毒各种重金属的完整蛋白质网络 此外, 运用比较蛋白组学方法, 分析超富集植物和非超富集植物响应重金属胁迫途径中的差异, 为深入阐明植物解毒及积累重金属的机制提供有效方法 参考文献 : [1] NriaguJO,PacynaJM.Quantitativeassessmentofworldwidecontaminationofair,waterandsoilswithtracemetals[J]. Nature,1998,333: [2] 张树金, 李廷轩, 邹同静, 等. 铅锌尾矿区优势草本植物体内铅及氮 磷 钾含量变化特征 [J]. 草业学报,2012,21(1): [3] RigolaD,FiersM,VurroE, 犲狋犪犾.Theheavymetalhyperaccumulator 犜犺犾犪狊狆犻犮犪犲狉狌犾犲狊犮犲狀狊 expressesmanyspecies specific genes,asidentifiedbycomparativeexpressedsequencetaganalysis[j].newphytologist,2006,170: [4] LasatM M.Phytoextractionoftoxicmetals:Areviewofbiologicalmechanisms[J].JournalofEnvironmentalQuality,2002, 31: [5] CobbetCS.Phytochelatinsandtheirrolesinheavymetaldetoxification[J].PlantPhysiology,2000,123: [6] KüpperH,ParameswaranA,LeitenmaierB, 犲狋犪犾.Cadmium inducedinhibitionofphotosynthesisandlong termacclimation tocadmiumstressinthehyperaccumulator 犜犺犾犪狊狆犻犮犪犲狉狌犾犲狊犮犲狀狊 [J].NewPhytologist,2007,175: [7] HeckathornSA,MuelerJK,LaquidiceS, 犲狋犪犾.Chloroplastsmalheat shockproteinsprotectphotosynthesisduringheavy metalstress[j].americanjournalofbotany,2004,91:

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