9 期冷勇等 : 猪传染性胃肠炎病毒犕狊犕基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装 1433 morphologicalysimilartovirionoftgev.diameterofvlpisvariablefrom61nmto101nm. Thisstudyprovidesthefounda

Size: px

Start display at page:

Download "9 期冷勇等 : 猪传染性胃肠炎病毒犕狊犕基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装 1433 morphologicalysimilartovirionoftgev.diameterofvlpisvariablefrom61nmto101nm. Thisstudyprovidesthefounda"

誉耄刁
7 years ago
Views:

1 畜牧兽医学报 2013,44(9): 犃犮狋犪犞犲狋犲狉犻狀犪狉犻犪犲狋犣狅狅狋犲犮犺狀犻犮犪犛犻狀犻犮犪 doi: /j.issn 猪传染性胃肠炎病毒犕狊犕基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装冷勇 1, 宋振辉 1,2, 卿家超 1, 翟少华 2, 买买提艾孜子 2 (1. 西南大学荣昌校区动物医学系, 重庆 ;2. 新疆农业大学动物医学学院, 乌鲁木齐 ) 摘要 : 利用 RT PCR 方法扩增猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)M 和 sm 结构蛋白基因, 将其分别克隆入载体 pfastbac TM Dual, 获得转移质粒 pfastbac TM Dual M 和 pfastbac TM Dual M sm, 将重组质粒转化至 DH10Bac 感受态细胞, 经抗性与蓝白斑筛选, 获得杆状病毒重组质粒 Bacmid M 和 Bacmid M sm, 在 Celfection 作用下, 将杆状病毒重组质粒转染昆虫细胞 sf9, 获得重组杆状病毒 rbac M 和 rbac M sm 通过 WesternBlot 间接免疫荧光试验 (IFA) 进行检测, 结果显示 : 重组蛋白在杆状病毒感染的 sf9 昆虫细胞中获得正确表达将重组杆状病毒 rbac M 和 rbac M sm 分别感染 sf9 昆虫细胞, 进行 TGEV 病毒样颗粒 (VLPs) 的体外组装试验结果表明,M 蛋白在 sf9 细胞内单独表达,M 蛋白和 sm 在 sf9 细胞内共同表达, 都可形成 TGEV 病毒样颗粒, 而且病毒粒子大小不等, 直径在 61~101nm 试验结果为进一步研究 TGEV 结构蛋白在病毒装配过程中的作用提供了理论依据关键词 : 猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV); 犕基因 ; 狊犕基因 ;sf9 细胞 ; 病毒样颗粒中图分类号 :S 文献标志码 :A 文章编号 : (2013) 犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犕犌犲狀犲犪狀犱狊犕犌犲狀犲狅犳犘狅狉犮犻狀犲犜狉犪狀狊犿犻狊犻犫犾犲犌犪狊狋狉狅犲狀狋犲狉犻狋犻狊犞犻狉狌狊犫狔犅犪犮狌犾狅狏犻狉狌狊犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犛狔狊狋犲犿犪狀犱犞犔犘狊犃狊狊犿犫犾狔狅犳犜犌犈犞 LENGYong 1,SONGZhen hui 1,2,QINGJia chao 1,ZHAIShao hua 2,MAIMAITI Aizizi 2 (1. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲, 犚狅狀犵犮犺犪狀犵犆犪犿狆狌狊, 犛狅狌狋犺狑犲狊狋犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犆犺狅狀犵狇犻狀犵 , 犆犺犻狀犪 ;2. 犆狅犾犲犵犲狅犳犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲, 犡犻狀犼犻犪狀犵犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犝狉狌犿狇犻 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Recombinantbaculoviruscontaining 犕 and 狊犕 geneoftransmissiblegastroenteritisvi rus(tgev)wereconstructedusingbac To BacBaculovirusexpressionsystem,andrecombinant M,sMproteinswereexpressedbyinfectingthesf9celwithrecombinantbaculovirus.Firstly, 犕 geneand 狊犕 geneoftgev wereamplified,then wereclonedandinsertedintodonorplasmid pfastbac TM Dualtoobtainrecombinantdonorplamid,pFastBac TM Dual MandpFastBac TM Dual M sm.plasmid pfastbac TM Dual M and pfastbac TM Dual M sm weretransformedinto 犈. 犮狅犾犻 DH10Bacrespectively.RecombinantbaculovirusrBac MandrBac M sm wereobtainedbytrans fectionofthesf9celswithbacmid MandBacmid M sm.westernblotandindirectimmunofluo rescenceassay(ifa)wereconducted,andtheresultsshowedthatrecombinantmproteinandsm proteinwasexpressedsuccessfuly,twoproteinshadapositivereactionwithantiserum. 犐狀狏犻狋狉狅 experimentsofvirus likeparticles(vlp)assemblyoftgevwasperformedbyinfectionofinsect celwithrbac MandrBac M sm.itisshowedthattheexpressedmproteinsaloneandco expres sionofmandsmproteinsininsectcelsf9infectedbyrecombinantbaculoviruscouldform VLPs 收稿日期 : 基金项目 : 中央高校基本科研业务基金 (XDJK2010C094); 重庆自然科学基金 (2008BB5243); 乌鲁木齐市科技计划项目 (Y ) 作者简介 : 冷勇 (1986 ), 男, 四川遂宁人, 硕士研究生, 主要从事动物微生物学与免疫学研究通信作者 : 宋振辉 (1976 ), 男, 内蒙古通辽人, 副教授, 博士, 主要从事动物微生物学与免疫学研究,E mail:szh7678@126.com

2 9 期冷勇等 : 猪传染性胃肠炎病毒犕狊犕基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装 1433 morphologicalysimilartovirionoftgev.diameterofvlpisvariablefrom61nmto101nm. ThisstudyprovidesthefoundationforresearchingtheVLPassemblyofTGEV. 犓犲狔狑狅狉犱狊 :porcinetransmissiblegastroenteritisvirus(tgev); 犕 gene; 狊犕 gene;sf9cels;vlps 猪传染性胃肠炎 (porcinetransmissiblegastro enteritis) 是由猪传染性胃肠炎病毒 (porcinetrans missiblegastroenteritisvirus,tgev) 引起的一种以严重腹泻呕吐和脱水为临床症状的高度传染性疾病, 尤其对 2 周龄以内的仔猪有很高的致死率, 死亡率据报道可达 100% [1] 该病最早发现于美国 (1933 年 ), 目前呈世界性分布, 给各国养猪业均造成了不同程度的损失 TGEV 属冠状病毒科冠状病毒属基因组不分节段的单股正链 RNA, 长约 bp 其主要包括 4 种结构蛋白 :M 蛋白 sm 蛋白 S 蛋白和 N [2] 蛋白目前国内外研究相对集中于犛和犖基 [3 5] 因, 而对犕和狊犕基因的研究相对较少犕基因是 TGEV 一个重要的编码基因, 全长 789bp, 可编码 262 个氨基酸, 不同毒株间 M 蛋白具有高度保守性, 该蛋白从 N 端到 C 端可分为信号肽膜外区跨膜区歧性区及突出于病毒粒子的 C 端区 5 个功能域, 主要包埋在病毒脂质囊膜中, 在病毒颗粒装配过程将核衣壳连接到囊膜上, 决定病毒粒子的装配 [6] 位点, 病毒成熟和出芽位点 sm 蛋白是一种小囊膜蛋白, 具有 C 末端的抗原位点, 研究发现,sM 蛋白在 TGEV 病毒颗粒形成及释放过程具有重要 [7] 作用, 但其功能机制尚未阐明病毒样颗粒 (vi rus likeparticles,vlps) 是在体外同时表达某种病毒的若干结构蛋白, 通过结构蛋白相互作用装配成在形态上类似于真正病毒的空心颗粒,VLPs 内部没有核酸, 本身不能复制, 通过对病毒 VLPs 形成机制的研究, 有助于了解病毒装配过程中主要结构蛋白质的作用及病毒粒子装配机制笔者利用昆虫细胞 / 杆状病毒系统, 构建单独表达 TGEV M 蛋白和共表达 M/sM 蛋白的重组杆状病毒, 转染昆虫细胞 sf9, 体外进行 TGEV 病毒样颗粒 (VLPs) 的组装试验, 为进一步研究 TGEV 结构蛋白在病毒装配过程中的作用提供理论依据和基础材料 1 材料与方法 1.1 材料 TGEVCQ 毒株由本实验室从重庆发病猪场腹泻病料中分离保存 ( 文章待发表 ); 昆虫细胞 sf9 购自中国典型培养物保藏中心 ; 大肠杆菌 DH5α 由本实验室保存 ; 兔抗 TGEV M 蛋白多克隆抗体和兔抗 TGEV 的阳性血清由本实验室制备并保存 pfastbac TM Dual DH10Bac 菌株 Sf 900Ⅱ SFM 无血清培养基 Celfection Reagent 转染试剂 Pure Link TM HiPurePlasmid MiniprepKit 购自 Invitro gen 公司限制性内切酶犅犪犿 HⅠ 犈犮狅 RⅠ 犛犿犪 Ⅰ 犓狆狀 Ⅰ T4 DNA 连接酶 DNA Marker DL 2000 DNA Markerλ EcoT14Ⅰ PCR 试剂盒购自大连宝生物工程有限公司, 荧光素 (FITC) 标记的羊抗兔 IgG 购自 Sigma 公司,Plasmid MidiKit 购自 QIAGEN 公司, 胶回收试剂盒购自上海生工生物技术有限公司 1.2 引物的设计与合成根据 GenBank 已发表的序列设计 2 对引物, 扩增 TGEV 犕和狊犕基因犕上游引物 :5 GGG 犌犌犃犜犆犆 CCACCAT GAAGATTTTGTTAAT 3, 其 5 端下划线部分设计有犅犪犿 H Ⅰ 位点 ; 犕下游引物 :5 GGGGAAT TCTTATACCATATGTAATAATTTTTCTTG 3, 其 5 端下划线部分设计有犈犮狅 RⅠ 位点狊犕上游引物 : 5 GGGCCCGGGATGACGTTTCCTAGGGCAT TG 3, 其 5 端下划线部分设计含有犛犿犪 Ⅰ 酶切位点 ; 狊犕下游引物 5 GGGGGTACCTCAAGCAAG GAGTGCTCCATC 3, 其 5 端下划线部分设计含有犓狆狀 Ⅰ 位点引物由大连宝生物工程有限公司 (TaKaRa) 合成 1.3 犕和狊犕基因的扩增收获 37 培养 48h 的细胞毒, 利用 Trizol 方法提取细胞总 RNA, 按照以下体系进行扩增 RT:MgCl 2 2μL 10 RTBufer1μL RNase FreedH 2O4.75μL dntp Mixture1μL RNase Ihibitor0.25μL AMV ReverseTranscriptase0.5 μl Random9mers0.5μL RNA 模板 1μL 反应条件为 min,42 30 min,99 5 min,5 5min PCR: 上下游引物各 1μL Ex 犜犪狇 DNAPoly merase0.5μl 10 Ex 犜犪狇 Bufer5μL dntp Mixture4μL 模板 0.5μL, 用 ddh 2O 补至 50μL

3 1434 畜牧兽医学报 44 卷反应条件为 94 2min;94 30s, s, 72 1min,30 个循环 ;72 延伸 10min 反应结束后取 5μLPCR 产物用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳 1.4 重组转移载体的构建将回收的犕基因和 pfastbac TM Dual 质粒经犅犪犿 HⅠ 和犈犮狅 RⅠ 双酶切后连接, 犕基因定向克隆于 pfastbac TM Dual 的 P10 启动子下游, 构建重组转移载体 pfastbac TM Dual M, 转化 DH5α, 经 PCR 和酶切鉴定, 再将回收的狊犕基因和 pfastbac TM Dual M 质粒经犛犿犪 Ⅰ 和犓狆狀 Ⅰ 双酶切后连接, 狊犕基因定向克隆于 pfastbac TM Dual M 的 Ph 启动子下游, 构建重组转移载体 pfastbac TM Dual M sm, 初步鉴定为阳性的质粒送大连宝生物工程有限公司进行测序, 用 DNAStar 软件分析插入片段的正确性 1.5 重组犅犪犮犿犻犱质粒的构建与鉴定分别取 0.5μL 重组供体质粒 pfastbac TM Dual M 和 pfastbac TM Dual M sm, 将其转化入犈. 犮狅犾犻 DH10Bac 感受态细胞, 在含卡那霉素 (50μg ml -1 ) 庆大霉素 (7μg ml -1 ) 四环素 (10μg ml -1 ) X gal(100μg ml -1 ) 和 IPTG(40μg ml -1 ) 的 LB 琼脂培养基上,37 避光培养 24~48h, 挑选重组的白色菌落, 培养 18h, 提取 DNA, 经 PCR 鉴定后, 将阳性重组穿梭载体分别命名为 Bacmid M 和 min,pbst 洗涤,DAB 试剂盒显色检测用同样的方法处理野生杆状病毒感染的 sf9 细胞作为阴性对照 1.8 间接免疫荧光鉴定狉犅犪犮犕狊犕的表达将 rbac M sm 毒液接种 sf9 细胞, 感染 72h 后, 用预冷的无水乙醇固定 20 min, 自然干燥, 加兔抗 TGEV 的阳性血清, 置湿盒中 37 孵育 90min, 用 PBST 洗涤 3 次, 加入 FITC 标记的羊抗兔 IgG, 置湿盒中 37 孵育 60min, 用 PBST 洗涤 3 次, 置荧光显微镜下观察, 出现特异性绿色荧光的判定为阳性用同样方法处理正常 sf9 细胞作为阴性对照 1.9 犜犌犈犞病毒样颗粒 ( 犞犔犘狊 ) 的组装为研究 TGEV M 蛋白和 sm 蛋白在形成 TGEV 病毒样颗粒过程中的作用, 利用 100 MOI 的 rbac M 和 rbac M sm 分别感染 sf9 细胞,72h 后收集病变细胞, 反复冻融后取上清, 经磷钨酸负染后, 电镜观察 VLPs 的组装情况 2 结果 2.1 犕基因和狊犕基因的扩增 RT PCR 产物经 1% 琼脂糖电泳检测, 扩增出 800bp 的犕基因 260bp 的狊犕基因, 与预期结果相符 ( 见图 1 2) Bacmid M sm 按照 PureLink TM HiPurePlasmid MiniprepKit 的操作手册提取重组穿梭质粒 DNA, 用于转染 sf9 细胞 1.6 重组杆状病毒的获得及鉴定将鉴定为阳性的 Bacmid M 和 Bacmid M sm 利用 CelfectionReagent 分别转染 sf9 昆虫细胞,27 培养 72h, 直至出现病变, 收获细胞上清, 将上清液在 sf9 昆虫细胞盲传 3 代, 重组病毒命名为 rbac M 和 rbac M sm 1.7 犛犇犛犘犃犌犈和犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋鉴定狉犅犪犮犕的表达将 rbac M 毒液按 1/5 的量接种 sf9 细胞, 培养 72h 后, 收集感染细胞 2000r min -1 离心 5 min, 弃上清, 用原液 1/10 体积的 PBS 重悬, 反复冻融 3 次, 离心后取上清进行 SDS PAGE 电泳将 SDS PAGE 电泳产物转移至硝酸纤维素膜上,50g L -1 脱脂乳封闭, 以兔抗 TGEV M 蛋白的多克隆血清 1 50 稀释作为一抗,37 孵育 90 min,pbst (0.05% Tween20) 洗涤, 以辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的抗兔 IgG 稀释作为二抗,37 孵育 60 M.DNA 相对分子质量标准 ;1 2. 犕基因 PCR 产物 M.DL2000marker;1,2.PCRproductof 犕 gene 图 1 犕基因扩增片段电泳图犉犻犵.1 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犕犵犲狀犲犳狉犪犵犿犲狀狋 2.2 重组供体质粒的构建分别将重组阳性质粒 pfastbac TM Dual M pfastbac TM Dual M sm, 转化犈. 犮狅犾犻 DH10Bac, 提取基因组 DNA, 利用 M13 通用引物进行 PCR 鉴定, 阳性质粒分别扩增出约 3.4 和 3.6kb 的目的片段 ( 图 3 图 4), 表明重组穿梭质粒 Bacmid M 和 Bacmid M sm 构建正确

4 9 期冷勇等 : 猪传染性胃肠炎病毒犕狊犕基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装 1435 ( 图 5) WesternBlot 检测结果表明, 所表达的目的蛋白能与兔抗 TGEV M 蛋白多克隆抗体发生明显的阳性反应 ( 图 6) M.DNA 相对分子质量标准 ;1 2. 狊犕基因 PCR 产物 M.DL2000marker;1,2.PCRproductof 狊犕 gene 图 2 狊犕基因扩增片段电泳图犉犻犵.2 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳狊犕犵犲狀犲犳狉犪犵犿犲狀狋 M. 蛋白质相对分子质量标准 ;1. 感染重组杆状病毒 rbacm 的 sf9 细胞裂解物 ;2. 感染野生型杆状病毒的 sf9 细胞裂解物 M.Proteinmarker;1.Lysateproductfromsf9celsin fectedbyrbacm;2.lysateproductfromsf9celsinfec tedbybacmid 图 5 犛犇犛犘犃犌犈检测犕蛋白的表达犉犻犵.5 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犕狆狉狅狋犲犻狀犫狔犛犇犛犘犃犌犈 M.λ ECOT 14DNA 相对分子质量标准 ;1.PCR 扩增产物 M.λ ECOT 14DNA marker;1.pcrproduct 图 3 重组穿梭质粒犅犪犮犿犻犱犕的犘犆犚鉴定犉犻犵.3 犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋犫犪犮犿犻犱犅犪犮犿犻犱犕 M. 蛋白质相对分子质量标准 ;1. 重组 M 蛋白 ;2. 感染野生型杆状病毒的 sf9 细胞裂解物对照 M.Proteinmarker;1.TheM protein;2.lysateprod uctfromsf9celsinfectedbybacmid 图 6 犕蛋白的犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋检测犉犻犵.6 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犕狆狉狅狋犲犻狀犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋犪狀犪犾狔狊犻狊 M.λ ECOT 14DNA 相对分子质量标准 ;1.PCR 扩增产物 M.λ ECOT 14DNA marker;1.pcrproduct 图 4 重组穿梭质粒犅犪犮犿犻犱犕狊犕的犘犆犚鉴定犉犻犵.4 犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋犫犪犮犿犻犱犅犪犮犿犻犱犕狊犕 2.3 犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋鉴定狉犅犪犮犕的表达将含有重组病毒的细胞上清连续盲传 3 代后, 细胞病变逐渐明显, 收集感染细胞进行 SDS PAGE 检测, 结果显示, 在重组病毒感染 sf9 细胞样品中有一大小为 32ku 的特异性条带, 大小与预期结果相符, 而野生杆状病毒感染的细胞中没有该条带出现 2.4 犐犉犃鉴定狉犅犪犮犕狊犕的表达将重组病毒液接种 sf9 细胞后, 进行间接免疫荧光检测, 观察结果显示 : 荧光下重组杆状病毒感染的 sf9 细胞出现绿色荧光, 而正常的 sf9 细胞没有出现荧光, 表明重组蛋白在杆状病毒表达系统中获得了表达 ( 图 7) 2.5 犜犌犈犞犞犔犘狊的装配将重组杆状病毒 rbac M 和 rbac M sm 分别感染 sf9 昆虫细胞, 进行 TGEV 病毒样颗粒 (VLPs) 的体外组装试验结果表明,M 蛋白在 sf9 细胞内单独表达, 可形成 TGEV 病毒样颗粒, 颗粒大小不均一, 直径在 61~101nm,M sm 蛋白在 sf9 细胞内共同表达形成的 VLPs 与 M 蛋白表达形成的 VLPs 在形态学上相似, 病毒粒子大小不等, 部分病毒粒子可见典型的囊膜样结构 ( 图 8)

5 1436 畜牧兽医学报 44 卷 A. 正常 sf9 细胞 ;B. 重组杆状病毒感染的 sf9 细胞 A.Normalsf9insectcels;B.sf9insectcelsinfectedby rbac M sm 图 7 重组杆状病毒狉犅犪犮犕狊犕感染狊犳 9 昆虫细胞的间接免疫荧光检测 (200 ) 犉犻犵.7 犐犉犃狅犳狊犳 9 犮犲犾狊犻狀犳犲犮狋犲犱犫狔狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋犫犪犮狌犾狅狏犻狉狌狊狉犅犪犮犕狊犕 (200 ) A. 细胞内共表达 M sm 蛋白形成的 VLPs 负染电镜观察 ;B. 细胞内表达 M 蛋白形成的 VLPs 负染电镜观察 A.Negativestainingelectromicroscopyofvirus likepar ticlesformedbyco expressionofrecombinantm/sm;b. Negativestainingelectromicroscopyofvirus likeparticles formedbyexpressionofrecombinantm 图 8 犜犌犈犞犕蛋白表达和犕 / 狊犕共表达形成的犞犔犘狊犉犻犵.8 犃狊犲犿犫犾狔狅犳狏犻狉狌狊犾犻犽犲狆犪狉狋犻犮犾犲狊犫狔犲狓狆狉犲狊犻狅狀狅犳犕狆狉狅狋犲犻狀犪狀犱犮狅犲狓狆狉犲狊犻狅狀狅犳犕 / 狊犕狆狉狅狋犲犻狀狊狅犳犜犌犈犞 3 讨论对 TGEV M 和 sm 蛋白的原核表达已有报 [8 9] 道, 原核表达系统具有表达量高操作简单等优点, 但该系统表达的蛋白存在非糖基化方式和非天然状态折叠等缺陷, 这使得表达的蛋白失去天然结构, 从而可能影响重组蛋白的活性昆虫细胞 / 杆状病毒表达系统的基因操作是在大肠杆菌中进行, 得到的重组子可以直接感染培养的昆虫细胞, 大大提高了工作效率, 是一种快速高效便捷的新型表达系统, 该表达系统能够生产具有翻译后修饰的蛋白产物, 接近于天然蛋白结构, 具有较高的生物学活性, 从而发挥其应有的功能由于杆状病毒属于昆虫病毒, 具有高度特异的宿主范围, 对脊椎动物和植物均无致病性, 因而此表达系统具有相当好的生物安全性本研究利用 Bac to Bac 杆状病毒表达系统在昆虫细胞中成功表达了 TGEV M 蛋白和 sm 蛋白, WesternBlot 和 IFA 结果显示, 杆状病毒表达的外源蛋白能够被特异性阳性血清识别, 表明用杆状病毒表达的 M 蛋白和 sm 蛋白具有较好的反应原性, 为进一步研究 TGEV M 蛋白和 sm 蛋白的功能打下基础 M 蛋白主要包埋在病毒脂质囊膜中, 其生物学功能类似于弹状病毒正黏病毒以及副黏病毒的非糖基化膜蛋白, 该蛋白携带了一条富含甘露糖天冬酰胺连接的侧链, 在病毒装配期间将核衣壳链接到囊膜上, 在病毒颗粒构建中起重要作用, 影响病毒粒子的装配位点出芽位点以及病毒的变异 sm 蛋白可能调控病毒的装配和释放, 也是 TGEV 有效复制的必需成分 M sm 蛋白在病毒的形态发生学过程中具有基础核心结构作用, 哺乳动物细胞内单纯表达 M 与 sm 蛋白质就可以形成冠状病毒样颗 [10] 粒目前, 有关冠状病毒 MHV IBV TGEV [11 14] SARSV 的形态发生学已有报道, 研究表明,M 蛋白在冠状病毒形态发生过程中具有关键作用, 该蛋白 N 末端和 C 末端的点突变将会明显影响病毒粒子的组装, 特别是 C 末端最后氨基酸残基的突变缺失将会导致 M 蛋白无法参与组装 VLPs, 但 M 蛋白 C 末端的突变并不影响完整病毒粒子的稳定性在研究 IBV 和 MHV 病毒颗粒组装过程中, 单独表达 M 或 sm 蛋白在细胞内不能产生 VLPs, 只能在细胞内观察到类似冠状病毒样结构的囊膜泡结 [15 16] 构 M 蛋白质是构成冠状病毒 TGEV 核心结构的重要成分,C 末端对于 TGEV 病毒核心结构的 [17] 稳定非常重要 P.Baudoux 等研究表明, 体外

6 9 期冷勇等 : 猪传染性胃肠炎病毒犕狊犕基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装 1437 共表达 M sm 蛋白可形成 TGEV VLPs, 且病毒粒子被释放到细胞培养液中,M 蛋白与 sm 蛋白形成的 VLPs 能诱导产生 IFN α, 具有防御 TGEV 感染的作用本研究利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中单独表达了 TGEV M 蛋白和共表达了 M sm 蛋白, 体外组装病毒样颗粒试验表明,M 蛋白在 sf9 细胞内单独表达,M 蛋白和 sm 在 sf9 细胞内共同表达, 都可形成与天然病毒形态相似的病毒样颗粒, 且 VLPs 大小不等与其他冠状病毒有所不同的是, TGEV M 蛋白在体外自身表达就可组装成 VLPs, 这可能由于 TGEV M 蛋白与其他冠状病毒 ( 如 IBV 和 MHV) 的 M 蛋白在病毒颗粒组装过程中的作用有所差异, 至于 sm 蛋白及 TGEV 其他结构蛋白对病毒形态发生的影响还有待进一步验证 4 结论本试验利用 RT PCR 方法扩增 TGEV M 和 sm 结构蛋白基因, 成功构建了转移质粒 pfast Bac TM Dual M 和 pfastbac TM Dual M sm, 将重组杆状病毒 rbac M 和 rbac M sm 分别感染 sf9 昆虫细胞, 进行 TGEV 病毒样颗粒 (VLPs) 的体外组装试验, 结果显示,M 蛋白在 sf9 细胞内单独表达,M 和 sm 蛋白在 sf9 细胞内共同表达, 都可形成 TGEV 病毒样颗粒, 为进一步研究 TGEV 结构蛋白在病毒装配过程中的作用提供了理论依据参考文献 : [1] 吴国平, 尹燕博, 吴时有. 猪传染性胃肠炎的研究进展 [J]. 中国兽医杂志,2003,39(2): [2] 殷震, 刘景华. 动物病毒学 [M].2 版. 北京 : 科学出版社,1997: [3] ABID N B,CHUPINSA,BJADOVSKAYA O P,et al.molecularstudyofporcinetransmissiblegastroenteri tisvirusafterserialanimalpassagesrevealedpointmuta tionsinsprotein[j]. 犞犻狉狌狊犌犲狀,2011,42(2): [4] ELIA G,DECARO N,MARTELLA V,etal.An ELISAbasedonrecombinantspikeproteinSforthe detectionofantibodiestotransmissiblegastroenteritis virusofswine likecaninecoronaviruses[j]. 犑犞犻狉狅犾犕犲狋犺狅犱狊,2010,163(2): [5] LIG,RENX.Diferentiationofporcinereproductive andrespiratorysyndromevirusnproteinusingavi rus basedelisa[j]. 犎狔犫狉犻犱狅犿犪 ( 犔犪狉犮犺犿狋 ),2011, 30(2): [6] ESCORSD,ORTEGOJ,ENJUANESL.Themem branemproteinofthetransmissiblegastroenteritiscoro navirusbindstotheinternalcorethroughthecarboxy terminus[j]. 犃犱狏犈狓狆犕犲犱犅犻狅犾,2001,494: [7] GODET G,HARIDON R L,VAUTEROTJF,et al.tgev coronavirus ORF4 encodesa membrane proteinthatisincorporatedinto virus[j]. 犞犻狉狅犾, 1992,188(2): [8] REN X F,SUO S,JANG Y S.Developmentofa porcine epidemic diarrhea virus M protein based ELISAforvirusdetection[J]. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾犔犲狋,2011, 33(2): [9] 吴凌, 李一经, 吴心镇. 猪传染性胃肠炎病毒 TH 98 株 M 蛋白基因的克隆及原核表达 [J]. 中国兽医科技,2005,35(11): [10] DEHC,VENNEMA H,ROTTIERPJ.Coronavir usenvelopeassemblyissensitivetochangesinthe terminalregionsoftheviralm protein[j]. 犃犱狏犈狓狆犕犲犱犅犻狅犾,1998,440: [11] VENNEMA H,GODEKEGJ,ROSSENJW,etal. Nucleocapsid independent assembly of coronavirus likeparticlesbyco expressionofvirusenvelopepro teingenes[j]. 犈犕犅犗犑,1996,15(8): [12] BOST A G,PRENTICEE,DENISON M R.Mouse hepatitisvirusreplicaseproteincomplexesaretrans locatedtositesofm proteinaccumulationintheer GICatlatetimesofinfectinon[J]. 犞犻狉狅犾狅犵狔,2001, 285(20): [13] ESCORSD,CAMAFEITA E,ORTEGOJ,etal.Or ganizationoftwotransmissiblegastroenteritiscoronavirus membraneproteintopologieswithinthevirionandcore [J]. 犑犞犻狉狅犾,2001,75(24): [14] TRIPET B,HOWARD M W,JOBLING M,etal. Structuralcharacterization ofthe SARS coronavirus spikesfusionproteincore[j]. 犅犻狅犾犆犺犲犿,2004, 279: [15] MAEDA J, MAEDA A, MAKINO S.Releaseof coronaviruseproteinin membranevesiclesfrom vi rus infectedcelsandeprotein expressingcels[j]. 犞犻狉狅犾狅犵狔,1999,263(2): [16] CORSE E,MACHAMER C E.Infectiousbrochitis viruseproteinistargetedtothegolgicomplexand directsreleaseofvirus likeparticles[j]. 犑犞犻狉狅犾, 2000,74(9): [17] BAUDOUXP,CARRAT C,BESNARDEAUL,etal. CoronaviruspseudoparticlesformedwithrecombinantM ande proteinsinduceαinterferonsynthesisbyleuko cytes[j]. 犑犞犻狉狅犾,1998,72(11): ( 编辑白永平 )

BuletinofSoiland WaterConservation Vol.38,No.3 Jun.,2018 & X R( + 1, 1, < 1,=> 3 (1. E^ IFTU ^,NO ; 2.NO\ ^,NO ;3.NO B`a -

$BuletinofSoiland WaterConservation Vol.38,No.3 Jun.,2018 & X R( + 1, 1, < 1,=> 3 (1. E^ IFTU ^,NO ; 2.NO\ ^,NO ;3.NO B`a -$ 383 0186 BuletinofSoiland WaterConservation Vol.38,No.3 Jun.,018 & X R( + 1, 1, < 1,=>,?@A 3 (1. E^ IFTU ^,NO 730070;.NO\ ^,NO 730070;3.NO B`a -[/H,NO 730000) -.:[# ] _D5 & % I /, + -. I P+- [ ] ( 犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿

9 期冷勇等 : 猪传染性胃肠炎病毒犕 狊犕基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装 1433 morphologicalysimilartovirionoftgev.diameterofvlpisvariablefrom61nmto101nm. Thisstudyprovidesthefounda

9 期冷勇等 : 猪传染性胃肠炎病毒犕狊犕基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装 1433 morphologicalysimilartovirionoftgev.diameterofvlpisvariablefrom61nmto101nm. Thisstudyprovidesthefounda