第 11 期 光谱学与光谱分析 1835 用犌犛犎和犌犛犛犌标准品按表 1 程序中的犅 和犆 操作, 加入犗犘犃 30 犿犻狀后, 利用日本岛津犚犉 5000 型荧光分光光 度计对样品进行全波长扫描, 以确定激发波 (λ ) 波长和发犲狓射波 (λ ) 波长 犲犿 犜犪犫犾犲 1 犃狊犪狔狆狉狅狋狅

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1 第 25 卷, 第 11 期光谱学与光谱分析犞狅犾 25, 犖狅 11, 狆狆 年 11 月犛狆犲犮狋狉狅狊犮狅狆狔犪狀犱犛狆犲犮狋狉犪犾犃狀犪犾狔狊犻狊犖狅狏犲犿犫犲狉, 2005 血浆中游离还原型及氧化型谷胱甘肽的荧光测定法 王秋林 1,2, 王浩毅 1, 丁怡 1, 乔小蓉 3, 彭克军 1, 林霞 4, 王树人 1 1 四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学教研室, 四川成都 成都医学院第一附属医院内一科, 四川成都 四川大学分析测试中心, 四川成都 四川大学华西基础医学与法医学院法医病理教研室, 四川成都 摘要文章建立了快速 可同时检测血浆中游离的还原型和氧化型谷胱甘肽 ( 即犌犛犎和犌犛犛犌 ) 的方法, 并评价了血浆中犌犛犎? 犌犛犛犌的氧化还原状态 利用二硫苏糖醇将犌犛犛犌还原成两分子的犌犛犎, 使犌犛犎在狆犎 8 0 时与邻苯二甲醛 ( 犗犘犃 ) 结合生成荧光产物犌犛犎 犗犘犃, 用荧光分光光度仪测定其荧光值, 从而对犌犛犎和 犌犛犛犌进行定量分析 并运用此方法测量青年健康志愿者静脉血中的游离犌犛犎和犌犛犛犌 该法最低可检测出测定管中 11 4 狆犿狅犾 犔 犌犛犎以及 5 7 狆犿狅犾 犔 犌犛犛犌 测量犌犛犎批内和批间变异系数分别 4 6% 和 3 9%, 犌犛犛犌批内和批间变异系数分别为 3 5% 和 4 1%, 犌犛犎, 犌犛犛犌加标准品后的回收率分别为 (99 77± 5 70)% 和 (99 28±4 73)% 测定健康青年志愿者血浆中游离犌犛犎, 犌犛犛犌的含量分别为 (16 5±2 4) 狀犿狅犾 犿犔 和 (1 7±0 35) 狀犿狅犾 犿犔 主题词 血浆 ; 犌犛犎 ; 犌犛犛犌 ; 荧光测定法 中图分类号 : 犗 文献标识码 : 犃文章编号 : (2005) 引 言 谷胱甘肽 ( 犌犛犎 ) 是一种体内广泛存在的由谷氨酸 半胱氨酸和甘氨酸组成的含硫醇三肽化合物 犌犛犎作为细胞的一种还原剂, 参与多种重要的生理过程, 可保护细胞免遭氧化损伤, 解除药物代谢产物的毒性, 调节基因表达和细胞凋亡, 并与物质的跨膜转运相关 犌犛犎参与抗氧化作用后,2 分子的犌犛犎脱氢生成氧化型谷胱甘肽 ( 犌犛犛犌 ), 在犖犃犇犘犎以及谷胱甘肽还原酶的作用下犌犛犛犌又不断被还原为犌犛犎, 多余的犌犛犛犌则排出胞外, 以维持犌犛犎? 犌犛犛犌氧化还原对的正常氧化还原状态 血液中的犌犛犎主要由肝细胞分泌, 在肺 肾等组织中被利用分解, 水解后的氨基酸成分经血液循环被肝或其他器官摄取重新合成犌犛犎 研究显示血中犌犛犎及犌犛犛犌可用来反应机体氧化还原内稳态的改变 [1] 目前有多种方法可对犌犛犎以及犌犛犛犌进行测量, 但却因特异性不强或因仪器贵重而不易推广, 且目前尚无标准的方法对血浆中的犌犛犎以及犌犛犛犌进行定量 我们参考已有的测量方法, 建立了一种快速而简便的荧光测定法, 利用二硫苏糖醇 ( 犇犜犜 ) 将犌犛犛犌还原为犌犛犎, 以及在狆犎 8 0 时犌犛犎与邻苯二甲醛 ( 犗犘犃 ) 结合生成可发荧光的物质, 从而对血浆中的犌犛犎以 及犌犛犛犌进行定量测定 1 材料与方法 1 1 试剂 犖 乙基马来酰亚胺 ( 犖犈犕 ) 犇犜犜以及犗犘犃为瑞士犉犾狌 犽犪公司产品 ; 犌犛犎和犌犛犛犌标准品为犛犻犵犿犪公司产品 ; 其余均为国产分析纯试剂 偏磷酸 ( 犕犘犃 ): 用去离子双蒸水配成 10% 犕犘犃 ; 磷酸盐 缓冲液 ( 犘犅犛 ) 内含 0 1 犿狅犾 犔的磷酸氢二钠以及 犿狅犾 犔的犈犇犜犃 犖犪 ( 2 狆犎 8 3); 犇犜犜 : 用犘犅犛配成 5 犿犿狅犾 犔 ; 犖犈犕用犘犅犛配制成 40 犿犿狅犾 犔, 犗犘犃用甲醇配成 10 犿犿狅犾 犔 ; 犌犛犎以及犌犛犛犌标准储备液 : 将犌犛犎以及犌犛犛犌 用 10% 犕犘犃各配成 2 犿犿狅犾 犔,4 避光保存 犌犛犎及 犌犛犛犌标准工作液 : 将犌犛犎和犌犛犛犌用 10% 犕犘犃稀释为分 别含 200 狀犿狅犾 犿犔犌犛犎和 100 狀犿狅犾 犿犔犌犛犛犌的混合工作液 实验过程中所用水均为去离子双蒸水 1 2 仪器德国贺利氏低温离心机, 日本岛津犚犉 5000 型荧光分光光度计 1 3 荧光波长的确定 收稿日期 : , 修订日期 : 基金项目 : 四川省科技厅重点科技项目 (02 犛犢 ) 资助 作者简介 : 王秋林,1971 年生, 成都医学院第一附属医院讲师, 主治医师, 博士研究生 通讯联系人

2 第 11 期 光谱学与光谱分析 1835 用犌犛犎和犌犛犛犌标准品按表 1 程序中的犅 和犆 操作, 加入犗犘犃 30 犿犻狀后, 利用日本岛津犚犉 5000 型荧光分光光 度计对样品进行全波长扫描, 以确定激发波 (λ ) 波长和发犲狓射波 (λ ) 波长 犲犿 犜犪犫犾犲 1 犃狊犪狔狆狉狅狋狅犮狅犾狊犳狅狉犌犛犎犪狀犱犌犛犛犌 狊狋犪狀犱犪狉犱? 狊犪犿狆犾犲 犖犈犕 犘犅犛 犇犜犜 犘犅犛 犘犅犛 犗犘犃 犃 50μ 犔 50μ 犔 μ 犔 犃 μ 犔 100μ 犔 犅 50μ 犔 0 50μ 犔 0 150μ 犔 犅 μ 犔 100μ 犔 犆 50μ 犔 μ 犔 150μ 犔 犆 μ 犔 100μ 犔 犃狊犪狔狆狉狅狋狅犮狅犾狊犳狅狉犌犛犎犪狀犱犌犛犛犌 : 犚犲犪犵犲狀狋狊犪犱犱犻狋犻狅狀狊狊犺狅狌犾犱犫犲犿犪犱犲狊犲狇狌犲狀狋犻犪犾狔犪狊犳狅犾狅狑狊 : 狋犺犲狋犪犫犾犲犳狉狅犿犾犲犳狋狋狅狉犻犵犺狋. 犜犺犲 犿狅犾犪狉狇狌犪狀狋犻狋犻犲狊狅犳狋犺犲狉犲犵犲狀狋狊狌狊犲犱狑犲狉犲 2μ 犿狅犾犖犈犕,0 25μ 犿狅犾犇犜犜, 犪狀犱 1μ 犿狅犾犗犘犃. 犛狋犪狀犱犪狉犱? 狊犪犿狆犾犲 (50μ 犔 ) 狑犪狊犪犱犱犲犱 狋狅犃, 犅 犪狀犱犆 狋狌犫犲, 犳狅犾狅狑犲犱狑犻狋犺 50μ 犔犖犈犕, 犘犅犛, 犪狀犱犇犜犜狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔. 犜犺犲狀狋狌犫犲狑犪狊犪犱犱犲犱狑犻狋犺 150μ 犔犘犅犛, 犪狀犱 狋犺犲犿犻狓狋狌狉犲狊犻狀犃犪狀犱犅狋狌犫犲狑犲狉犲犻狀犮狌犫犪狋犲犱犳狅狉 30 犿犻狀犪狋狉狅狅犿狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲 (20~22 ), 狋犺犲犿犻狓狋狌狉犲狊犻狀犆狋狌犫犲犳狅狉 60 犿犻狀. 犉狅犾狅狑犻狀犵狋犺犲狊犲犻狀犮狌犫犪狋犻狅狀狊,100μ 犔犿犻狓狋狌狉犲狑犪狊狋狉犪狀狊犳犲狉犲犱犳狉狅犿犃, 犅 犪狀犱犆 狋狌犫犲狋狅犃, 犅犪狀犱犆狋狌犫犲狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔, 狋犺犲狀 1 300μ 犔犘犅犛犪狀犱 100μ 犔犗犘犃狑犲狉犲犪犱犱犲犱狋狅犪犾狋狌犫犲狊犪狀犱狋犺犲犿犻狓狋狌狉犲狊狑犲狉犲犻狀犮狌犫犪狋犲犱犳狅狉 30 犿犻狀犪狋狉狅狅犿狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲 (20~22 ). 犐犿犿犲犱犻犪狋犲犾狔犳狅犾狅狑犻狀犵狋犺犲狊犲犻狀犮狌犫犪狋犻狅狀狊, 狊犪犿狆犾犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲狑犪狊犱犲狋犲狉犿犻狀犲犱. 1 4 制作犌犛犎及犌犛犛犌的标准曲线将犌犛犎 + 犌犛犛犌混合工作液稀释为分别含 100,80,60, 40,20,10,5,2 5 狀犿狅犾 犿犔犌犛犎及 50,40,30,20,10, 5,2 5,1 25 狀犿狅犾 犿犔犌犛犛犌系列浓度混合液 使用组合的样品管 ( 分别用犃, 犅 和犆 以及犃, 犅, 犆标记 ), 按表 1 进行荧光测定 以 λ 犲狓 =334 4 狀犿,λ 犲犿 =424 狀犿,λ 犲狓及 λ 犲犿 的谱带宽 ( 带通 ) 均为 5 狀犿, 以犃管为空白管调零, 测试犅和 犆管的荧光值 ( 犉犝 ), 其中犅管的犉犝反映标准品中犌犛犎的含量, 犆管减去犅管的犉犝则反映标准品中犌犛犛犌的含量 分别以犅 和犆 管标准品中犌犛犎 犌犛犛犌的浓度为自变量, 相应的犉犝为因变量, 求直线回归方程 另将犌犛犎标准品测定管调至不同狆犎值并测试荧光值, 观察不同狆犎值对犌犛犎与 犗犘犃加合物荧光值测试的影响 1 5 样品处理 贮存对测定结果的影响新鲜采集的血样分别在采血后室温下 1,3,10 和 30 犿犻狀以及在冰浴条件下 3,10,20 和 30 犿犻狀制备血浆,1 倍体积冰冷的 10% 犕犘犃沉淀蛋白, 取上清液进行测试 另将新鲜制备的去蛋白血浆保存于 -80 条件下, 于采血后 1,3,7 和 14 犱解冻后按照新鲜标本测试步骤进行测量 1 6 回收及荧光强度稳定性试验在 5 份新鲜血浆中分别加入一定量的犌犛犎和犌犛犛犌标准品混合液, 按前述方法测定荧光值, 计算其回收率 ( 测量值? 预期值 100%) 样品管中加入不同量的犗犘犃后每隔 10 犿犻狀测定样品管的犉犝, 直到 90 犿犻狀停止测定, 观察其荧光强度的变化 1 7 血浆中犌犛犎及犌犛犛犌的测定选取 18~22 岁健康志愿者, 排除心 肺 肝 肾 血液等系统疾病, 男 女各 10 名 餐后至少 1 犺后采集肘静脉血, 收集 2 犿犔肝素钠抗凝血, 立即 4 条件下离心 (8000 狉 犿犻狀 1 5 犿犻狀 ) 制备血浆, 或将血液置于冰浴条件下, 在 30 犿犻狀内制备血浆 取血浆加入 1 倍体积冰冷的 10% 犕犘犃沉淀蛋白, 于 4 条件下静置 10 犿犻狀并离心 (10000 狉 犿犻狀 3 犿犻狀 ), 取 50μ 犔上清液, 按表 1 进行荧光测定 利用 犌犛犎, 犌犛犛犌的标准直线方程计算血浆中犌犛犎以及犌犛犛犌的 浓度 或将上清液置于 -80 冰箱保存, 以待测 1 8 统计学处理所有样品均用平行管, 取其均值作为该样品的测量值 组间的均值用狋检验, 所有统计分析均利用犛犘犛犛 11 0 软件进行处理 2 结果 2 1 测定条件的选择 激发光波长 发射光波长及其谱带宽的确定将等摩尔浓度的犌犛犎, 犌犛犛犌标准品分别按犅, 犆管进行处理后用荧光分光光度计进行全波长扫描, 显示各测定管的 λ 犲狓和 λ 犲犿均相等, 分别为 λ 犲狓 =334 4 狀犿,λ 犲犿 =424 狀犿, 见图 1 以谱带宽 ( 带通 )10 狀犿进行扫描时, 发现对犌犛犎 犗犘犜的敏感性非常高, 但检测的上限较低, 而选用 5 狀犿的谱带宽度则比较理想 因而在进行测量时, 选用 λ 犲狓 =334 4 狀犿, λ 犲犿 =424 狀犿以及 5 狀犿的谱带宽度 当标准品或样品浓度变 犉犻犵 1 犈狓犮犻狋犪狋犻狅狀犪狀犱犲犿犻狊犻狅狀狑犪狏犲犲狀犵狋犺狊犮犪狀狀犻狀犵犳狅狉犌犛犎 ( 犾犲犳狋 ) 犪狀犱犌犛犛犌 ( 狉犻犵犺狋 ) 狊狋犪狀犱犪狉犱

3 1836 光谱学与光谱分析第 25 卷 化时, 荧光光谱相位 ( 峰位 ) 不发生改变, 仅改变峰高 犗犘犃对荧光测量的影响加入犗犘犃后, 犉犝逐渐升高, 在 30~60 犿犻狀保持稳定, 此后犉犝有所下降,1 5 犺时降低约 20% 但避光 24 犺后犉犝无明显降低 犗犘犃的量较低时, 犉犝需要较长时间才稳定, 犗犘犃的量较高时, 犉犝达到并维持稳定所需时间较短, 但犉犝并不因犗犘犃量的增加而增高 最终确定用 100μ 犔 10 犿犿狅犾 犔犗犘犃甲醇溶液对犌犛犎进行衍生化 30 犿犻狀后测犉犝 狆犎对测试的影响 狆犎值 8 0~12 范围时可得到最强的荧光值, 在狆犎值 6 0~8 0 范围时, 荧光值缓慢下降, 在狆犎值低于 6 0 时, 犌犛犎的荧光值迅速降低, 狆犎值低于 4 5 时, 几乎无荧光产生 ( 见图 2), 这可能与犌犛犎的狆犐 =5 93 有关 犕犮犖犲犻犾和 [2] 犅犲犮犽报道犌犛犛犌可与犗犘犃反应生成发荧光的衍生物, 我们也发现在狆犎 11 时犌犛犛犌可与犗犘犃反应生成发荧光的产物, 并且发现其 λ 犲狓和 λ 犲犿与犌犛犎 犗犘犃加合物 ( 狆犎 8 0 时形成 ) 的波长一致 参照文献我们选用狆犎 8 3 的犘犅犛作为缓冲液进行测试, 一方面可降低样品中犌犛犛犌带来的干扰, 此外还可防止过碱性条件下对犖犈犕的破坏, 以使狆犎达到最佳而利于犗犘犃对犌犛犎的衍生化 出的最小分析信号值, μ 指平均空白信号值, 犽指与置信度有关的整数, 这里取犽 =3), 则犢犈 = = 13 44, 将其代入犌犛犎以及犌犛犛犌的标准曲线方程, 得犡犌犛犎 0 8 狀犿狅犾 犿犔, 犡犌犛犛犌 0 4 狀犿狅犾 犿犔, 经换算 ( 即标准品浓度 / ), 得测定管中的犌犛犎和犌犛犛犌的量分别为 16 和 8 狆犿狅犾, 此即为本方法的最低检出限 犉犻犵 2 犈犳犲犮狋狅犳狆犎狅狀狉犲犾犪狋犻狏犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犻狀狋犲狀狊犻狋狔 2 2 犌犛犎及犌犛犛犌的标准曲线标准品工作液, 各重复测定 3 次, 取均值, 以标准品浓度为自变量, 犉犝为因变量, 求直线方程并制作标准曲线, 见图 3 直线方程分别为 : 犢犌犛犎 = 犡 ( 狉 =0 997), 犢犌犛犛犌 = 犡 ( 狉 =0 999) 由标准曲线方程可知, 犌犛犛犌的标准曲线的斜率是犌犛犎标准曲线的斜率的 2 倍, 这与犇犜犜可将 1 分子犌犛犛犌还原产生 2 分子犌犛犎的预期一致 在测量犌犛犎及犌犛犛犌标准品时加入 50μ 犔去蛋白血浆上清, 测得的的荧光值仍呈线性分布, 并且与未加入样品时各自的标准曲线平行, 表明去蛋白血浆上清液对犌犛犎以及 犌犛犛犌的测量无干扰 2 3 线性范围 检测限 精密度和准确度 线性范围 : 犌犛犎标准品浓度在 100 狀犿狅犾 犿犔以内时与荧光强度有较好的线性关系, 犌犛犛犌标准品浓度在 50 狀犿狅犾 犿犔以内时与荧光强度有较好的线性关系 检测限 : 由标准直线方程可计算本检测方法的最低检测限 用本测试方法对空白管 ( 即犃管 ) 测定 10 次, 其荧光值 ( 珔狓 ± 狊 ) 为 6 81±2 21 据犢犈 =μ+ 犽 σ( 式中指可被检犢犈 犉犻犵 3 犛狋犪狀犱犪狉犱犮狌狉狏犲狊犳狅狉犌犛犎犪狀犱犌犛犛犌, 狑犻狋犺犪狀犱狑犻狋犺狅狌狋犪狆犾犪狊犿犪狊狆犻犽犲 ( 犜犺犲犪狊犪狔狆狉狅狋狅犮狅犾狊狑犲狉犲狌狊犲犱狋狅犵犲狀犲狉犪狋犲狋犺犲犌犛犎 ( 狌狆狆犪狀犲犾 ) 犪狀犱犌犛犛犌 ( 犱狅狑狀狆犪狀犲犾 ) 狊狋犪狀犱犪狉犱犮狌狉狏犲狊 ( 狅狆犲狀犲犱犮犻狉犮犾犲狊 ). 犅犾犪狀犽狏犪犾狌犲狊 ( 狋狌犫犲犃 ) 狑犲狉犲 6 81±2 21 犉犝. 犇犲狆狉狅狋犲犻狀犻狕犲犱狆犾犪狊犿犪狊狆犻犽犲狊狅犳 50μ 犔犳狅狉犌犛犎犪狀犱犌犛犛犌 ( 犮犾狅狊犲犱犮犻狉犮犾犲狊 ) 狑犲狉犲狌狊犲犱, 狊犻狀犮犲狋犺犲狊犲狑犲狉犲狋犺犲狉狅狌狋犻狀犲犪犿狅狌 狀狋狊犲犿狆犾狅狔犲犱犳狅狉犲犪犮犺狆狉狅狋狅犮狅犾. 犜犺犲犱犻犳犲狉犲狀犮犲犫犲狋狑犲犲狀狋犺犲狋狑狅犮狌狉狏犲狊犳狅狉犲犪犮犺狆犾狅狋 ( 犮犾狅狊犲犱狉犲犮狋犪狀犵犾犲狊 ) 狉犲狆狉犲狊犲狀狋狊狋犺犲狆犾犪狊犿犪犮狅狀狋狉犻犫狌狋犻狅狀狋狅犳犾狌 狅狉犲狊犮犲狀犮犲犻狀狋犺犲狆狉犲狊犲狀犮犲狅犳犻狀犮狉犲犪狊犻狀犵犵犾狌狋犪狋犺犻狅狀犲犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊. 犈犪犮犺狆狅犻狀狋狉犲狆狉犲狊犲狀狋狊狋犺犲犿犲犪狀 ± 犛犇 ( 狀 =3)) 精密度 : 对同一批 40 狀犿狅犾 犿犔 犌犛犎和 20 狀犿狅犾 犿犔 犌犛犛犌分别测定 5 次, 变异系数分别为 4 6% 和 3 5%, 对连 续 5 批 40 狀犿狅犾 犿犔犌犛犎和 20 狀犿狅犾 犿犔犌犛犛犌标准品进行测定, 变异系数分别为 3 9% 和 4 1% 准确度 : 取 5 份血浆样品, 向每 0 2 犿犔血浆中分别加入 5,10,20 狀犿狅犾犌犛犎, 其回收率分别为 :(97 06± 6 00)%,(103 50±5 00)% 和 (98 78±5 06)%, 总的回收率为 (99 77±5 70)% 向每 0 2 犿犔血浆中加入 1,2,4 狀犿狅犾犌犛犛犌, 其回收率分别为 :(95 64±4 40)%,(103 36± 3 26)% 和 (98 84±3 29)%, 总的回收率为 :(99 28± 4 73)%, 回收较完全 2 4 样品的处理 贮存对测定结果的影响文献中报道有用过氯酸 三氯醋酸 磺基水杨酸以及偏磷酸等来沉淀蛋白质, 我们在实验中发现用 10% 的偏磷酸来

4 第 11 期 光谱学与光谱分析 1837 沉淀蛋白最理想 取血后在不同时间点对样品进行测试, 发现在取血后 3 犿犻狀之内对犌犛犎及犌犛犛犌的测量无明显影响, 而 10 犿犻狀后测得的犌犛犎以及犌犛犛犌的含量降低, 犌犛犎的降低更明显 若将血液保存在冰浴条件下, 取血后 30 犿犻狀内测得的犌犛犎以及犌犛犛犌的含量无明显减低 因而在实验过程中, 采血后立即进行测定, 或将血液标本置于冰浴条件下 30 犿犻狀内完成血浆的制备并沉淀蛋白 此外将用 10% 犕犘犃去蛋白的血浆上清在 -80 冰箱保存两周, 对测试的结果无明显影响 应注意的是血浆中显示有溶血征象时, 测得样品中的犌犛犎的含量特别高, 这可能是红细胞的犌犛犎释放到血浆中所致, 因而在采血及制备血浆的过程中尽量避免可引起溶血的因素, 若血浆中有溶血征象, 则弃去此样品 2 5 样品测定运用本方法测得 18 例健康青年志愿者血浆 ( 去除两例有溶血征象的样品 ) 中犌犛犎以及犌犛犛犌的浓度分别为 (16 5± 2 4) 狀犿狅犾 犿犔和 (1 7±0 35) 狀犿狅犾 犿犔, 其中男女性别间无明显差异 3 讨论 犌犛犎是细胞中主要的含硫醇三肽化合物, 在体内分别以氧化型和还原型而存在, 即犌犛犛犌和犌犛犎, 其中犌犛犎具有抗氧化作用 细胞中的犌犛犎发挥抗氧化作用后转变为犌犛犛犌, 犌犛犛犌在谷胱甘肽还原酶以及犖犃犇犘犎作用下又可还原为 犌犛犎, 过量的犌犛犛犌可迅速被排出细胞, 以使犌犛犎? 犌犛犛犌维持正常的氧化还原状态 血浆中的犌犛犎主要由肝细胞分泌, 一部分与蛋白等结合为蛋白 犌犛犎二硫化物, 其余的则以 犌犛犎及犌犛犛犌两种形式游离存在 一些研究显示可用血中 犌犛犎? 犌犛犛犌氧化还原状态的改变来衡量体内的氧化应激状态 目前测量犌犛犎和犌犛犛犌的方法较多, 可分为紫外分光光 [3] 度法 荧光法以及犎犘犔犆法几大类 紫外分光光度法主要是利用犌犛犎与犇犜犅犃进行衍生化反应后进行检测, 但其检 测下限较高, 不能对较低浓度的犌犛犎进行检测, 且对犌犛犛犌进行定量时比较困难, 操作上特别繁琐, 实际上血浆中的 犌犛犎以及犌犛犛犌水平较低, 因而该法不适合于检测血浆中的 犌犛犎以及犌犛犛犌 犎犘犔犆法可对犌犛犎以及犌犛犛犌准确地进行同时测量, 但所需仪器设备昂贵, 而不利于广泛使用 荧光法主要是利用犌犛犎以及犌犛犛犌在不同的条件下与荧光试剂进行衍生化后测荧光值, 以此来对犌犛犎以及犌犛犛犌进行定量测定, 常用的荧光试剂主要有犿犅狉犅 [4] ( 犕狅狀狅犫狉狅犿狅犫犻犿犪狀犲 ) 以及犗犘犃, 犿犅狉犅可与生物样品中的所有生物硫醇反应, 且 犿犅狉犅本身也可产生荧光, 而犗犘犃本身无荧光产生, 在狆犎 8 0 时, 只与犌犛犎进行衍生化反应, 而不与其他硫醇物质如 犆狔狊等反应, 因而我们在实验中选用犗犘犃对犌犛犎进行衍生化处理 本方法测量血浆犌犛犎和犌犛犛犌的原理是基于犇犜犜在近中性条件下可将犌犛犛犌还原为犌犛犎, 以及在狆犎 8 0 时犌犛犎与犗犘犃结合生成可发荧光的物质 [5], 从而运用荧光分光光度仪对血浆中的犌犛犎以及犌犛犛犌进行定量测定 犌犛犎同时含有伯胺基和硫醇基, 可与犗犘犃的两个醛基缩合成可发强荧光的物质异吲哚 [6] [7] 这一反应最早是由犆狅犺狀和犔狔犾犲报道的, 自此这种检测方法就不断地被改进以对犌犛犎进行测量 因一些内源性成分也可与犗犘犃反应生成发荧光产物, 在我们的实验中, 犃管样品用犖犈犕来封闭犌犛犎与犗犘犃反应, 因而可以认为犃管中的荧光值是由非犌犛犎产生的, 并将犃管作为空白管进行调零 在血浆中同时存在有犌犛犎和 犌犛犛犌, 由于在狆犎 8 0 时, 犌犛犛犌几乎不与犗犘犃结合产生可发荧光物质, 因而犅管的犉犝反应血浆中犌犛犎的量 ; 而犆管减去犅管所得的犉犝则反应血浆中犌犛犛犌的量 测试结果显示犌犛犛犌标准曲线的斜率是犌犛犎标准曲线的 2 倍, 证实在本实验条件下, 犇犜犜可将 1 犿狅犾犌犛犛犌还原为 2 犿狅犾犌犛犎 回收实验显示本测定方法有较好的回收率, 此外测试犌犛犎和 犌犛犛犌的批内和批间变异系数都较小, 说明本测试方法有较好的重现性和准确性

5 1838 光谱学与光谱分析第 25 卷 参考文献 [1] 犛犿犻狋犺犆犞, 犑狅狀犲狊犇犘, 犌狌犲狀狋犺狀犲狉犜犕, 犲狋犪犾. 犜狅狓. 犃狆狆犾. 犘犺犪狉犿犪犮狅犾.,1996,140:1. [2] 犕犮犖犲犻犾犜犔, 犅犲犮犽犔犞. 犃狀犪犾狔狋犻犮犪犾犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔,1968,22:431. [3] 犆犲狉犲狊犲狉犆, 犌狌犻犮犺犪狉犱犑, 犇狉犪犻犑, 犲狋犪犾. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犆犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔犅,2001,752:123. [4] 犆狅狋犵狉犲犪狏犲犐犃, 犕狅犾犱 é 狌狊犘. 犑. 犅犻狅犮犺犲犿. 犅犻狅狆犺狔狊. 犕犲狋犺狅犱狊,1986,13(4 5):231. [5] 犆犺狅狀犵犆犢, 犎狌狓狋犪犫犾犲犚犑. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犆犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔犅,1995,672(2):217. [6] 犕狅狉犻狀犲犪狌犌, 犃狕狅狌犾犪狔犕, 犉狉犪狆狆犻犲狉犉. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犆犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔犃,1989,467(1):209. [7] 犆狅犺狀犞犎, 犔狔犾犲犑. 犃狀犪犾狔狋犻犮犪犾犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔,1966,14:434. 犃犖狅狏犲犾犉犾狌狅狉狅狆犺狅狋狅犿犲狋狉犻犮犕犲狋犺狅犱犳狅狉犃狊狊犪狔犻狀犵犉狉犲犲犌犾狌狋犪狋犺犻狅狀犲狅犳犅狅狋犺犚犲犱狌犮犲犱犪狀犱犗狓犻犱犻狕犲犱犻狀犘犾犪狊犿犪 1,2 犠犃犖犌犙犻狌 犾犻狀, 1 犠犃犖犌犎犪狅 狔犻, 1 犇犐犖犌犢犻, 3 犙犐犃犗犡犻犪狅 狉狅狀犵, 1 犘犈犖犌犓犲 犼狌狀, 4 1 犔犐犖犡犻犪, 犠犃犖犌犛犺狌 狉犲狀 1. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犘犪狋犺狅狆犺狔狊犻狅犾狅犵狔, 犠犲狊狋 犆犺犻狀犪犛犮犺狅狅犾狅犳犘狉犲犮犾犻狀犻犮犪犾犪狀犱犉狅狉犲狀狊犻犮犕犲犱犻犮犻狀犲, 犛犻犮犺狌犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犆犺犲狀犵犱狌 , 犆犺犻狀犪 2. 犜犺犲犉犻狉狊狋犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犐狀狋犲狉狀犪犾犕犲犱犻犮犻狀犲, 狋犺犲犉犻狉狊狋犎狅狊狆犻狋犪犾犃犳犻犾犻犪狋犲犱狋狅犆犺犲狀犵犱狌犕犲犱犻犮犪犾犆狅犾犲犵犲, 犆犺犲狀犵犱狌 , 犆犺犻狀犪 3. 犃狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱犜犲狊狋犻狀犵犆犲狀狋犲狉, 犛犻犮犺狌犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犆犺犲狀犵犱狌 , 犆犺犻狀犪 4. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犉狅狉犲狀狊犻犮犘犪狋犺狅犾狅犵狔, 犠犲狊狋 犆犺犻狀犪犛犮犺狅狅犾狅犳犘狉犲犮犾犻狀犻犮犪犾犪狀犱犉狅狉犲狀狊犻犮犕犲犱犻犮犻狀犲, 犛犻犮犺狌犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犆犺犲狀犵犱狌 , 犆犺犻狀犪 犃犫狊狋狉犪犮狋犜狅犻狀狏犲狊狋犻犵犪狋犲狋犺犲犿犲犪狊狌狉犲犿犲狀狋狅犳犳狉犲犲犵犾狌狋犪狋犺犻狅狀犲狅犳犫狅狋犺狉犲犱狌犮犲犱狅狉狅狓犻犱犻狕犲犱 ( 犻. 犲. 犌犛犎犪狀犱犌犛犛犌 ) 犻狀狆犾犪狊犿犪, 犪狀犱狋狅犲狏犪犾狌犪狋犲狋犺犲狉犲犱狅狓狊狋犪狋犲狅犳犌犌犛犎? 犌犛犛犌犻狀犺狌犿犪狀狆犾犪狊犿犪, 犫狅狋犺犌犛犎犪狀犱犌犛犛犌犻狀狆犾犪狊犿犪狑犲狉犲犿犲犪狊狌狉犲犱犫狔犳犾狌狅狉狅狆犺狅狋狅犿犲狋狉狔犫犪狊犲犱狅狀狋犺犲犳犪犮狋狊狋犺犪狋狅狀犲犿狅犾犪狉犌犛犛犌犮犪狀犫犲狉犲犱狌犮犲犱狋狅狋狑狅犿狅犾犪狉犌犛犎犫狔犱犻狋犺犻狅狋犺狉犲犻狋狅犾 ( 犇犜犜 ) 狌狀犱犲狉狋犺犲犮狅狀犱犻狋犻狅狀狅犳狋犺犲狆犎犫犲犻狀犵犪犫狅狌狋 6 0, 犪狀犱犌犛犎犮犪狀狆狉狅狏犻犱犲犫狅狋犺狆狉犻犿犪狉狔犪犿犻狀犲犪狀犱狋犺犻狅犾犵狉狅狌狆狊狋狅狉犲犪犮狋狑犻狋犺狋犺犲狋狑狅犮犪狉犫狅狀狔犾犵狉狅狌狆狊狅犳犗 狆犺狋犺犪犾犱犲犺狔犱犲 ( 犗犘犃 ) 狋狅犳狅狉犿犪犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋狋犲狉狀犪狉狔犻狊狅犻狀犱狅犾犲犮狅犿狆犾犲狓犪狋狆犎 8 0. 犜犺犻狊犿犲狋犺狅犱犮犪狀犪狋犾犲犪狊狋犿犲犪狊狌狉犲 16 狆犻犮狅犿狅犾犲犌犛犎犪狀犱 8 狆犻犮狅犿狅犾犲犌犛犛犌狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔犻狀狋犺犲狋狌犫犲. 犜犺犲狏犪狉犻犪狋犻狅狀犮狅犲犳犻犮犻犲狀狋 ( 犆犞 ) 犳狅狉犻狀狋狉犪 狊犪狔犪狀犱犻狀狋犲狉犪 狊犪狔犻狊犪犫狅狌狋 4.6% 犪狀犱 3 9% 犳狅狉犌犛犎犪狀犱 3 5% 犪狀犱 4 1% 犳狅狉犌犛犛犌狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔. 犜犺犲狉犲犮狅狏犲狉狔狅犳犌犛犎犪狀犱犌犛犛犌犪犱犱犲犱狋狅狋犺犲狆犾犪狊犿犪犻狊 (99 77%±5 70)% 犪狀犱 (99 28%± 4 73)% 狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔. 犜犺犲犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅犳犌犛犎犪狀犱犌犛犛犌犻狀狋犺犲狆犾犪狊犿犪狅犳狔狅狌狀犵犺犲犪犾狋犺狔狏狅犾狌狀狋犲犲狉犻狊 (16 5±2 4) 狀犿狅犾 犿犔犪狀犱 (1 7±0 35) 狀犿狅犾 犿犔狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔, 狑犻狋犺狅狌狋狊犻犵狀犻犳犻犮犪狀狋犱犻犳犲狉犲狀犮犲犫犲狋狑犲犲狀犿犪犾犲犪狀犱犳犲犿犪犾犲. 犜犺犻狊犿犲犪狊狌狉犲犿犲狀狋犿犲狋犺狅犱犻狊狊犻犿狆犾犲狑犻狋犺犵狉犲犪狋狊犲狀狊犻狋犻狏犻狋狔犪狀犱狊犲犾犲犮狋犻狏犻狋狔犳狅狉狉犪狆犻犱犿犲犪狊狌狉犻狀犵犌犛犎犪狀犱犌犛犛犌犻狀犺狌犿犪狀狆犾犪狊犿犪狊犻犿狌犾狋犪狀犲狅狌狊犾狔. 犓犲狔狑狅狉犱狊犘犾犪狊犿犪 ; 犌犛犎 ; 犌犛犛犌 ; 犉犾狌狅狉狅狆犺狅狋狅犿犲狋狉狔 ( 犚犲犮犲犻狏犲犱犑狌狀.28,2004; 犪犮犮犲狆狋犲犱犛犲狆.8,2004) 犆狅狉犲狊狆狅狀犱犻狀犵犪狌狋犺狅狉

( ( (CIP ( /. 5 :,2014.1 ( ISBN978 7 5628 3719 0 Ⅰ.1... Ⅱ.1... Ⅲ.1 Ⅳ.1H314 CIP (2013263740 ( ( / / / / / : 130,200237 :(02164250306( (02164252710( :(02164252707 : 狆狉犲狊. 犲犮狌狊狋. 犲犱狌. 犮狀 / /787 犿犿 1092 犿犿

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BuletinofSoiland WaterConservation Vol.38,No.3 Jun.,2018 & X R( + 1, 1, < 1,=> 3 (1. E^ IFTU ^,NO ; 2.NO\ ^,NO ;3.NO B`a - 383 0186 BuletinofSoiland WaterConservation Vol.38,No.3 Jun.,018 & X R( + 1, 1, < 1,=>,?@A 3 (1. E^ IFTU ^,NO 730070;.NO\ ^,NO 730070;3.NO B`a -[/H,NO 730000) -.:[# ] _D5 & % I /, + -. I P+- [ ] ( 犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿

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