1672 畜牧兽医学报 39 卷 onnumberoffoliclesingilts( 犘 >0.05);cumulusexpansionandoocytematurationwerehigher forgiltsfedh ( 犘 < 0.05),energysourceshadnosignific

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令仑宁
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1 畜牧兽医学报 2008,39(12): 犃犮狋犪犞犲狋犲狉犻狀犪狉犻犪犲狋犣狅狅狋犲犮犺狀犻犮犪犛犻狀犻犮犪能量水平和来源对后备母猪卵母细胞质量及相关基因表达的影响王延忠, 吴德, 徐盛玉, 周东胜, 周平, 谭现义 ( 四川农业大学动物营养研究所教育部动物抗病营养重点实验室, 雅安 ) 摘要 : 选择初始体质量 (59±4.2)kg 的长白大白杂交母猪 54 头, 采用 3 2 试验设计, 研究日粮能量水平和来源对后备母猪卵泡发育和卵母细胞体外成熟以及排卵前卵丘卵母细胞复合物 (COCs) 中生长分化因子 9(GDF 9) 骨形态发生蛋白 15(BMP 15) 促黄体素受体 (LHR) 促卵泡素受体 (FSHR)mRNA 表达的影响 3 个能量水平分别为 NRC 推荐能量需要的 87.5% 100% 和 112.5%; 每个能量水平分别以淀粉和油脂为主要能量来源试验母猪在第 2 个发情期的第 19 天屠宰结果表明 : 随能量水平升高, 大卵泡数增多 ( 犘 <0.05), 能量来源对卵泡数量没有显著影响 ( 犘 >0.05); 高能量水平下卵丘扩散程度 ( 犘 <0.05) 和卵母细胞成熟的比例最高 ( 犘 <0.01), 能量来源对卵丘扩散程度影响差异不显著 ( 犘 >0.05), 淀粉组卵母细胞成熟的比例高于油脂组 ( 犘 <0.05); 基因分析表明, 饲喂低能量水平组的 GDF 9 和 BMP 15mRNA 的表达量最高 ( 犘 <0.05), 淀粉组上调 GDF 9mRNA 的表达 ( 犘 <0.05), 能量来源对 BMP 15mRNA 表达影响差异不显著 ; 各处理小卵泡的卵丘卵母细胞复合物中 GDF 9 和 BMP 15mRNA 表达量高于大卵泡 ( 犘 <0.01); 高能量水平组的 LHR 和 FSHR mrna 表达量最高 ( 犘 <0.05), 能量来源对大卵泡卵丘卵母细胞复合物中 FSHR mrna 表达无显著影响, 淀粉组上调 LHR mrna 表达 ( 犘 < 0.05) 研究表明, 提高日粮能量水平增加母猪排卵前大卵泡数量和卵母细胞成熟的比例, 以淀粉为能量来源对卵泡数量没有显著影响, 但提高了卵母细胞成熟的比例 ; 能量影响卵泡数量和卵母细胞成熟可能与 GDF 9 BMP 15 和 LHR FSHR mrna 表达有关关键词 : 能量水平 ; 能量来源 ; 后备母猪 ; 卵母细胞质量 ; 基因表达中图分类号 :S828.2 文献标识码 :A 文章编号 : (2008) 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犇犻犲狋犪狉狔犈狀犲狉犵狔犔犲狏犲犾犪狀犱犛狅狌狉犮犲狅狀犗狅犮狔狋犲犙狌犪犾犻狋狔犪狀犱犌犲狀犲犈狓狆狉犲狊犻狅狀犻狀犌犻犾狋狊 WANG Yan zhong,wu De,XUSheng yu,zhou Dong sheng,zhou Ping,TAN Xian yi ( 犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犳狅狉犃狀犻犿犪犾犇犻狊犲犪狊犲犚犲狊犻狊狋犪狀犮犲犖狌狋狉犻狋犻狅狀狅犳狋犺犲犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犈犱狌犮犪狋犻狅狀, 犃狀犻犿犪犾犖狌狋狉犻狋犻狅狀犐狀狊狋犻狋狌狋犲, 犛犻犮犺狌犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犢犪犪狀 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Fifty fourlandrace Yorkshirecrossbredgilts,withinitialbodyweightof(59±4.2) kg,werealotedto3 2factorialexperimenttostudytheefectsofdietaryenergyleveland sourceonfolicledevelopment,oocyte maturation 犻狀狏犻狋狉狅 andgrowthdiferentiationfactor9 (GDF 9),bone morphogeneticprotein 15 (BMP 15),LH receptor (LHR),FSH receptor (FSHR)mRNA expressionfrom cumulus oocytecomplexes (COCs)duringthepre ovulatory phase.threeenergylevelswere87.5% (L),100% (M)and112.5% (H)accountingforNRC (1998)recommendedenergyrequirement,respectively;twoenergysourcewerestarch(S)andfat (F).Giltswereslaughteredonday19aftersecondestrus.Theresultsshowedthatthenumber oflargefolicleswerehigherforgiltsfedh ( 犘 <0.05),energysourceshadnosignificantefect 收稿日期 : 基金项目 : 教育部创新团队计划 (IRT0555); 国家自然科学基金 ( ) 作者简介 : 王延忠 (1980 ), 男, 内蒙古根河市人, 硕士, 主要从事猪的营养与饲料科学方面的研究,E mail:yanzhongw@sina.com 通讯作者 : 吴德, 博士, 教授, 博士生导师,E mail:pig2pig@sina.com

2 1672 畜牧兽医学报 39 卷 onnumberoffoliclesingilts( 犘 >0.05);cumulusexpansionandoocytematurationwerehigher forgiltsfedh ( 犘 < 0.05),energysourceshadnosignificantefectoncumulusexpansion( 犘 > 0.05);oocytematurationwerehigherforgiltsfedSthanthatfedF ( 犘 < 0.05);Lenergylevel hadhighergdf 9andBMP 15 mrnaexpression ( 犘 <0.05),energysourceshadnoefecton BMP 15mRNAexpression,starchdietsupregulatedGDF 9mRNAexpression( 犘 <0.05).GDF 9andBMP 15mRNAexpressionwerehigherinCOCsfromsmalfoliclethanthatfromlargefol licleinaltreatments ( 犘 <0.01).LHRandFSHR mrna expression washigherin H ( 犘 < 0.05),energysourceshadnosignificantefectonFSHR mrnaexpression,however,starchdi etsincreasedlhr mrnaexpression ( 犘 <0.05).Theresultsofthisstudyindicatethathigher energylevelcouldincreasenumberoflargefolicleduringthepre ovulatoryphaseandoocyte maturation,althoughenergysourceshadnosignificantefectonnumberoffolicles,starchdiets increaseoocytesmaturation.theefectsofenergylevelandsourceonnumberoffolicleandoo cytematurationmaybemodulatedbygdf 9,BMP 15,LHRandFSHR mrna. 犓犲狔狑狅狉犱狊 :energylevel;energysource;gilts;oocytesquality;geneexpression 卵母细胞质量影响早期胚胎成活, 进而影响随 [1] 后胎儿的发育和最终的产仔数在卵泡发育过程中, 卵母细胞与颗粒细胞和膜细胞的信号交流是双向的, 卵母细胞在卵泡发育过程中起重要的调控作用生长分化因子 9(Growthdiferentiationfac tor 9,GDF 9) 骨形态发生蛋白 15(Bonemorpho geneticprotein 15,BMP 15) 是两种重要的卵母细胞分泌因子, 在卵泡发育过程中始终存在 GDF 9 基因敲除的小鼠, 尽管提高了 FSH 和 LH 的浓度, [2] 卵泡发育仍停止在初级卵母细胞阶段, 而直接向 [3] 母猪卵巢注射 GDF 9 基因则促进卵泡生长 BMP 15 基因敲除小鼠, 繁殖性能受到损害 [4] GDF 9 BMP 15 可促进卵泡颗粒细胞和卵泡膜增殖, 抑制 LH 和 FSH 受体表达, 阻止黄体化, 促进卵 [4 5] 泡发育而在卵母细胞成熟的过程中,LH 和 FSH 发挥重要作用, 其受体的表达反映了靶细胞对激素的敏感性然而, 有关营养对卵母细胞成熟和质量影响的报道仍较少能量作为大多数动物生产体系中的首要限制因素, 对母猪繁殖性能存在阶段性和长久性的影响在能量利用过程中, 动物总是优先保证维持生命所需的部分, 生殖系统在能量分配上不占有优势研究表明, 后备母猪配种前提高采食水平, 可促进排 [1] 卵, 但这是许多养分综合变化的结果, 能量水平和来源是否对卵母细胞成熟和质量有影响目前仍不清楚因此, 本研究探讨能量水平和来源对后备母猪卵母细胞体外成熟和卵丘卵母细胞复合物 (Cumu lus oocytecomplexes,cocs) 中 LHR FSHR 及卵母细胞分泌因子 GDF 9 BMP 15 表达的影响, 这不仅对后备母猪的饲养具有实践指导意义, 而且可为营养与繁殖的基础研究提供理论参考 1 材料与方法 1 1 试验设计试验采用 3(3 个能量水平 ) 2( 淀粉和油脂 ) 因子试验设计,3 个能量水平在 60~80kg 和 80kg 后分别为和倍维持能量需要 ( 维持能量需要为 460kJDE/kgBW 0.75 ), 中 (M) 能量水平参照 NRC(1998) 推荐量, 高 (H) 低 (L) 能量水平在此基础上增加和减少 12.5%; 每个能量水平下分别设置淀粉 ( 淀粉组,S, 玉米淀粉 ) 和油脂 ( 油脂组,F, 猪油与菜籽油等量混合 ) 组除能量外的其它营养成分每天摄入量相同, 参照 NRC (1998) 后备母猪营养需要的推荐量饲粮配方和营养成分见表试验动物及分组试验选用血缘相同, 日龄 (147±3)d 和体质量 (59±4.2)kg 相近的 54 头长白大白杂交母猪, 随机分配到 6 个处理中 ( 低能量淀粉组, 低淀 ; 中淀 ; 高淀 ; 低脂 ; 中脂 ; 高脂 ), 每个处理 9 个重复, 每个重复 1 头猪试验前将猪舍彻底清洗并消毒试验母猪单圈饲养, 每天在 08:30 和 14:30 饲喂 2 次, 自由饮水 1 3 卵母细胞收集母猪体质量达到 80kg 后, 每天观察发情表现 2 次, 以出现静立反射记为发情第 1 天根据每头母猪发情时间 (202~223 日龄 ), 在第 2 个发情期的第

3 12 期王延忠等 : 能量水平和来源对后备母猪卵母细胞质量及相关基因表达的影响 1673 表 1 试验日粮组成及营养含量犜犪犫犾犲 1 犐狀犵狉犲犱犻犲狀狋犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀犪狀犱狀狌狋狉犻犲狀狋犮狅狀狋犲狀狋狅犳犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾犱犻犲狋狊狅狀犳犲犱犫犪狊犻狊 g 60~80kg >80kg 低能量水平 L 中能量水平 M 高能量水平 H 低能量水平 L 中能量水平 M 高能量水平 H 淀粉组 S 脂肪组 F 淀粉组 S 脂肪组 F 淀粉组 S 脂肪组 F 淀粉组 S 脂肪组 F 淀粉组 S 脂肪组 F 淀粉组 S 脂肪组 F 原料 Ingredient 玉米 Corn 麸皮 Wheatbran 豆粕 Soybeanmeal 鱼粉 Fishmeal 磷酸氢钙 CaHPO 碳酸钙 CaCO 食盐 Salt 胆碱 Chlinechloride 复合多维 a Vitaminpremix 预混剂 b Mineralpremix 玉米淀粉 Cornstarch 混合油脂 Mixedfat 合计 Total 日摄入营养物质量 Dailyintakeofnutrients 消化能 DE/MJ 粗蛋白 CP 粗纤维 CF 钙 Ca 总磷 P 赖氨酸 Lys 粗脂肪 EE 淀粉 Starch a. 每 kg 复合多维含 VA IU;VD IU;VE25000IU;VK5000mg;VB12000mg;VB216000mg;VB1230mg; 烟酸 35000mg; 泛酸钙 25000mg; 叶酸 500mg b. 每 kg 微量元素预混剂含 Fe63.14g;Cu4.74g;Zn78.93g;Mn20.53g;Se0.24g;I0.22g a.thevitaminpremixperkginclude:va iu;vd iu;ve25000iu;vk5000mg;vb12000mg;vb216000mg;vb130mg;niacin:35000mg;pantothenicacid: 25000mg;folacin:500mg.b.Themineralpremixperkginclude:Fe63.14g;Cu4.74g;Zn78.93g;Mn20.53g;Se0.24g;I0.22g

4 1674 畜牧兽医学报 39 卷 19 天屠宰 (54 头母猪在 21d 内完成全部屠宰, 每个处理每次屠宰 4 头以上时, 卵巢用于细胞培养, 否则用于基因分析 ), 将卵巢放入装有灭菌 37 PBS 缓冲液的保温瓶中,1h 内带回实验室, 称重计数大 ( 直径大于 3 mm) 和小 ( 直径小于 3 mm) 卵泡数然后用 37 PBS 缓冲液冲洗 3 次, 用 20 ml 注射器,12 号针头分别抽取发情母猪卵巢上大小卵泡中 COCs, 用 PBS 缓冲液洗 2~3 次, 随即用于体外成熟培养每个处理取 4 头母猪大卵泡中的 COCs 用于体外成熟, 其余的大小卵泡中 COCs -80 保存, 用于基因测定 1 4 卵母细胞体外成熟每个处理分别抽取 4 头母猪卵巢上大卵泡中的 COCs120 个以上,COCs 在 PBS 冲洗过后, 用口吸管选取 90 个左右卵母细胞胞质均匀且卵丘细胞紧密的 COCs 转移至含有 25 mmol/l 的羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES,Sigma) 的 TCM 199(Gibco) 培养液中清洗 3 次, 然后分为 3 组, 每组 30 个左右卵母细胞, 随后立即转入含 500μL 成熟培养液的四孔培养板 (Nunc),38.5,5% CO 2 条件下培养 40~44 h, 不更换培养液成熟培养液组成 :TCM 199 (Gibco),0.1% 聚乙烯醇 (Sigma),3.05 mmol/ld 葡萄糖 (Sigma),0.91 mmol/l 丙酮酸钠 (Sigma), 10ng/mLEGF(Sigma),0.01U/mLLH( 宁波激素制品厂 ),0.01 U/mL FSH( 宁波激素制品厂 ) 和 10%(V V) 猪卵泡液 ( 从 4~6 mm 卵泡中吸取, 5000 g 离心 2 次,15 min/ 次,-80 保存 ) 培养 20~24h 后, 观察卵丘扩散, 按以下方法评分 :0 分, 卵丘细胞没有扩散 ;1 分 : 卵丘细胞最外层轻微扩散 ;2 分 : 外周 2~3 层卵丘细胞轻微扩散 ;3 分 : 50% 的卵丘细胞扩展 ;4 分 : 卵丘细胞完全扩散卵丘扩散程度按下式计算 :( 每个处理 COCs 得分总和 )/(COCs 数量 4) 100% [6] 培养 40~44h, 用 0.1% 的透明质酸酶除去 COCs 的卵丘细胞, 镜检, 排出第一极体 ( 达到第二次减数分裂中期,MI) 视为成熟 1 5 基因测定取每个处理大小卵泡中各 50 个 COCs, 常规方法提取总 RNA RT 反应体系 5 PrimescriptTM Bufer2μL,PrimescriptTM RT Enzyme MixI 0.5μL,OligodT Primer0.5μL,Random 6 mers 0.5μL,TotalRNA4μL,RNaseFreedH 2 O2.5 μl RT 程序 :37,15min;85,5s H2A 作为内参, 由大连宝生物公司合成引物序列 :GDF 9 上游 5 CCCCTAGTG GTCTCCAAACAA 3, 下游 5 CAGACAGC CCTCTTTTCTGG 3 ( 扩增长度 235bp, 退火温度 59,GenBank 登录号 AY649763);BMP 15 上游 5 AGCTTCCACCAACTGGGTTGG 3, 下游 5 TCATCTGCATGTACAGGGCTG 3 ( 扩增长度 286 bp, 退火温度 57,GenBank 登录号 AF458070);LHR 上游 5 GCTCACCCAAGA CACTCCAATG 3, 下游 5 GCTGACACCCA CAAGAGGCAAC 3( 扩增长度 512bp, 退火温度 60,GenBank 登录号 NM214449);FSHR 上游 5 CACAGTCCCTCGGTTCCTTA 3, 下游 5 CAG CCACAGATGACCACAAA 3 ( 扩增长度 462 bp, 退火温度 55,GenBank 登录号 AF025377); 内参 H2A 上游 5 GTGGCAAA CAAGGAGGAAAG 3, 下游 5 ATGCGGGTCT TCTTGTTGTC 3 ( 扩增长度 226bp, 退火温度 55.6,GenBank 登录号 BP459633) 利用常规 PCR 检测总 RNA 反应体系 cdna 1μL, 上游引物 0.5μL, 下游引物 0.5μL,2 犜犪狇 PCR MasterMix5μL,ddH 2O3μL PCR 程序 :94 预变性 5 min;94 变性 30s,Tm 退火 30s,72 延伸 30s,30 个循环 ;72 延伸 5min 扩增片段与预期相符且无明显引物二聚体即可进行半定量分析 RealTimePCR 反应体系 :SYBR Premix Ex 犜犪狇 TM12.5μL; 上游引物 0.5μL; 下游引物 0.5 μl;cdna2μl;ddh 2O9.5μL 反应程序:95, 1min;95 5s,60 30s,72 30s, 共 40 个循环 ; 融解曲线 :95 0s,50 30s,95 0s( 温度变化速率为 0.5 /s) 样品 mrna 表达水平以目的基因与内参基因的相对比值来表示 1 6 统计分析卵泡数量为母猪卵巢表面的可见卵泡数量 (n =9), 卵母细胞培养和基因测定每个处理重复 3 次数据采用 SPSS11.5 统计软件 GLM 分析, 求出最小二乘均数后,3 2 因子 ( 能量水平来源 ) 进行方差分析和 Duncan 法进行多重比较, 犘 <0.05 为显著, 犘 <0.01 为极显著试验结果用平均数 ± 标准差表示

5 12 期王延忠等 : 能量水平和来源对后备母猪卵母细胞质量及相关基因表达的影响试验结果与分析 2 1 能量水平和来源对卵泡发育的影响由表 2 可知, 高能量水平大卵泡数量极显著高于中能量组和低能量组 ( 犘 <0.01), 分别比中低能量水平高 21.8% 和 34.55%, 低能量水平小卵泡数量显著高于中高能量水平 ( 犘 <0.05), 分别高出 51.33% 和 56.16%, 结果表明, 增加能量水平提高卵巢表面大卵泡数量淀粉和油脂对卵泡数的影响差异不显著对于小卵泡, 能量水平和来源存在互表 2 能量水平和来源对卵泡发育的影响犜犪犫犾犲 2 犈犳犲犮狋狅犳犲狀犲狉犵狔犾犲狏犲犾犪狀犱狊狅狌狉犮犲狅狀犳狅犾犻犮犾犲犱犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋低能量水平 L 中能量水平 M 高能量水平 H 犘值犘 value 淀粉 S 脂肪 F 淀粉 S 脂肪 F 淀粉 S 脂肪 F 水平来源水平来源 Level Source Level source 大卵泡数 / 个 Numberof 19.57± ± ± ± ±3.44 A 25.57±1.72 A largefolicle 小卵泡数 / 个 Numberof smalfolicle 40.71±6.73 a 27.71±5.09 b 19.86±3.93 c 25.43±4.89 b 18.57±3.69 c 25.14±3.08 b 同行肩标不同小写字母表示差异显著 ( 犘 <0.05), 不同大写字母表示差异极显著 ( 犘 <0.01), 下同 Meanswithdiferentsmalleterinthesamelineindicatesignificantdiference( 犘 <0.05),withdiferentcapitalleterindicate extremelysignificantdiference( 犘 <0.01),thesameasbelow 作效应 2 2 能量水平和来源对卵母细胞体外成熟的影响由表 3 可知, 卵丘扩散程度高能组显著高于低能组 ( 犘 <0.05), 提高 3.4%, 能量来源对卵丘扩散的影响差异不显著 ; 体外培养 40~44h 卵母细胞成熟率高能量水平极显著高于 ( 犘 <0.01) 中低能量水平, 分别高出 13.13% 和 25.20%, 而且淀粉组卵母细胞成熟的比例显著高于油脂组 ( 犘 <0.05), 提高 11.17% 提高能量水平不但增加排卵前卵巢表面大卵泡数量, 而且提高卵母细胞成熟率表 3 能量水平和来源对卵丘扩散和卵母细胞成熟的影响犜犪犫犾犲 3 犈犳犲犮狋狅犳犲狀犲狉犵狔犾犲狏犲犾犪狀犱狊狅狌狉犮犲狅狀犮狌犿狌犾狌狊犲狓狆犪狀狊犻狅狀犪狀犱狅狅犮狔狋犲狊犿犪狋狌狉犪狋犻狅狀低能量水平 L 中能量水平 M 高能量水平 H 犘值犘 value 淀粉 S 脂肪 F 淀粉 S 脂肪 F 淀粉 S 脂肪 F 水平来源水平来源 Level Source Level source 卵丘卵母细胞复合物个数 / 个 NumberofCOCs 卵丘扩散程度 /% Cumulusexpansion 86.58±1.59c 85.13±1.27 a 89.06±2.30 c 85.71±1.64 c 90.28±2.18 a 87.50±1.75 b 卵母细胞成熟率 Oocytesmaturation% 67.51±6.95Cc 60.48±7.89 Cc 74.96±5.68 Bbc 66.59±5.84 Cc 83.65±6.02 Aa 76.92±5.44 Bb 能量水平和来源对犌犇犉 9 犅犕犘 15 犿犚犖犃犔犎犚和犉犛犎犚犿犚犖犃表达的影响为了研究能量影响卵巢发育和卵母细胞质量的可能机制, 采用 real timepcr 方法测定后备母猪排卵前卵巢 COCs 中 GDF 9,BMP 15,LHR 和 FSHR mrna 表达由表 4 可知,GDF 9 mrna 在低能量水平表达显著高于中高能量水平 ( 犘 <0.05), 淀粉组 GDF 9mRNA 表达极显著 ( 犘 <0.01) 高于油

6 1676 畜牧兽医学报 39 卷脂组 BMP 15 mrna 在低能量水平表达显著高于中高能量水平 ( 犘 <0.05), 能量来源对 BMP 15 mrna 表达的影响差异不显著 ( 犘 >0.05) 能量水平和来源对 GDF 9mRNA 表达存在互作效应表 4 能量来源和水平对大卵泡中犌犇犉 9, 犅犕犘 15, 犔犎犚和犉犛犎犚犿犚犖犃表达的影响犜犪犫犾犲 4 犈犳犲犮狋狅犳犲狀犲狉犵狔狊狅狌狉犮犲犪狀犱犾犲狏犲犾狅狀犌犇犉 9, 犅犕犘 15, 犔犎犚犪狀犱犉犛犎犚犿犚犖犃犲狓狆狉犲狊犻狅狀犳狉狅犿犾犪狉犵犲犳狅犾犻犮犾犲狊低能量水平 L 中能量水平 M 高能量水平 H 犘值犘 value 淀粉 S 脂肪 F 淀粉 S 脂肪 F 淀粉 S 脂肪 F 水平 Level 来源 Source 水平来源 Level source GDF ±7.82 Aa 3.70±0.31 Bc 10.79±2.66 Bb 2.38±1.02 Bc 7.88±4.03 Bbc 7.46±1.07 Bbc BMP ±13.37 ab 23.12±13.37 a 7.46±2.48 b 4.47±0.50 b 7.36±3.55 b 9.75±2.30 ab LHR 0.25±0.03 bc 0.11±0.04 c 0.16±0.03 c 0.71±0.32 b 1.40±0.37 a 0.44±0.19 bc FSHR 2.72±1.03 c 1.30±0.41 c 7.35±2.33 b 4.56±2.04 c 12.51±2.61 a 14.50±1.42 a 高能量水平 LHR mrna 表达量最高, 显著高于中低能量水平 ( 犘 <0.05), 淀粉组 LHR mrna 表达显著高于油脂组 ( 犘 <0.05) 高能量水平 FSHR mrna 表达量显著高于中能量水平 ( 犘 < 0.05), 中能量水平显著高于低能量水平 ( 犘 < 0.05); 能量来源对 FSHR mrna 表达的影响差异不显著 ( 犘 >0.05) 说明高能量水平有利于 LHR 和 FSHR mrna 的表达, 淀粉组上调 LHR mrna 的表达能量水平和来源对 LHR 和 FSHR mrna 表达存在互作效应研究同时测定了 GDF 9 和 BMP 15 mrna 在大小卵泡中 COCs 的表达, 从表 5 可以看出,2 种基因在小卵泡表达极显著高于大卵泡 ( 犘 <0.01) 从以上结果可以看出, 随着卵泡发育,GDF 9 和 BMP 15mRNA 表达下降, 高能量水平下调这 2 种基因表达表 5 大小卵泡中犆犗犆狊犌犇犉 9 犅犕犘 15 犿犚犖犃的表达犜犪犫犾犲 5 犈狓狆狉犲狊犻狅狀狅犳犌犇犉 9 犪狀犱犅犕犘 15 犿犚犖犃犻狀犆犗犆狊犳狉狅犿犾犪狉犵犲犪狀犱狊犿犪犾犳狅犾犻犮犾犲大卵泡小卵泡犘值 Largefolicle Smalfolicle 犘 value GDF ± ±1.29 A BMP ± ±2.29 A 讨论 3 1 能量水平和来源对卵泡发育和卵母细胞质量的影响研究结果表明后备母猪从体质量 59kg 直到第 2 个情期的第 19 天饲喂高能量水平显著增加大卵泡数量, 淀粉和油脂对卵巢上大卵泡数的影响差异 [7] [8] 不显著, 这与 VandenBrand 等和 Hazeleger 等的结果一致高能量水平增加血浆中胰岛素和 IGF I 浓度, 促进 FSH 和 LH 的分泌, 从而促进卵 [7] 泡发育大卵泡数量增多可能会增加母猪的排卵率而能量来源并未对卵巢上大卵泡数产生显著影响, 这可能与淀粉和脂肪的代谢途径以及最终的代谢效应密切相关饲喂淀粉日粮以产生葡萄糖为主, 血浆中葡萄糖浓度升高既能刺激 β 细胞分泌胰岛素, 也能增加胰岛素的合成, 胰岛素则可显著促进糖原和脂肪合成 ; 而饲喂脂肪日粮时, 并未引起血液中血糖浓度下降, 机体葡萄糖脂肪酸代谢途径能有效调节血液中葡萄糖和脂肪酸的浓度, 以保证血糖浓度处于恒稳状态饲喂淀粉与脂肪日粮相比, 淀粉显著提高母猪食后血液中葡萄糖浓度峰值, 但葡 [7] 萄糖浓度下降速度也相对较快, 因此, 饲喂淀粉或脂肪日粮并未对卵泡发育产生显著影响能量水平对卵丘扩散的研究还未见报道, 研究发现高能量水平卵丘扩散程度最大卵丘扩散即细胞分离和细胞外黏液化的过程, 除了有利于有效地授精, 对 COCs 成功脱离卵泡壁和随后的排卵以及在输卵管中的转运并维持卵母细胞的活力都非常重要卵母细胞在离开卵泡之前, 必须完成细胞核和细胞质的成熟过程卵泡越大越有利于卵母细胞

7 12 期王延忠等 : 能量水平和来源对后备母猪卵母细胞质量及相关基因表达的影响 1677 的成熟, 卵母细胞的质量可能就会越好研究表明, 将卵母细胞与不同阶段的卵泡液共同培养, 结果显示, 来自较大卵泡的卵泡液培养的卵母细胞成熟比例显著提高, 证明卵泡大小对卵母细胞成熟有重要 [9] 影响大卵泡相对小卵泡更有能力提供卵母细胞成熟必需的内环境, 包括提供卵母细胞成熟所需的核苷氨基酸和磷脂以及维持卵母细胞成熟过程中的离子平衡和 mrna 稳定性本研究中, 高能量水平大卵泡数量较多而且卵丘扩散程度和卵母细胞成熟的比例也最高, 表明提高能量水平可以进一步改善卵母细胞质量, 而不同能量来源对体外培养 COCs 卵丘扩散无显著影响 3 2 能量水平和来源对卵泡犌犇犉 9 犅犕犘 15 犔犎犚和犉犛犎犚犿犚犖犃表达的影响卵母细胞和颗粒细胞之间依靠双向的信号交流, 高能量水平增加大卵泡数量和提高卵母细胞成熟比例可能与改变这些信号分子有关 GDF 9 和 BMP 15 是重要的卵母细胞分泌因子, 在整个卵泡发育期都存在卵泡发育需要卵母细胞和颗粒细胞保持同步发育, 将 12 日龄小鼠次级卵泡中的卵母细胞取出与新生小鼠初级卵泡中的颗粒细胞一同培养, 加速了卵泡发育和颗粒细胞分化, 说明卵母细胞可以通过分泌因子调节颗粒细胞发育并与卵母细胞 [11] 发育阶段取得一致 GDF 9 基因敲除的小鼠, 卵泡发育停止在初级卵母细胞阶段, 说明其在卵泡早 [2] 期发育中的重要作用对于单排卵动物,BMP 15 基因敲除会导致完全不孕, 而对于多排卵动物, BMP 15 基因敲除导致繁殖力下降, 不会引起不 [5] 孕能量水平对母猪 COCsGDF 9 和 BMP 15mR NA 表达的研究还未见报道研究发现低能量水平排卵前大卵泡中 COCsGDF 9 和 BMP 15 mrna 表达量较高从表 5 可以看出, 小卵泡中 COCs GDF 9 和 BMP 15mRNA 的表达极显著高于在大卵泡中 COCs 的表达, 表明 GDF 9 和 BMP 15 在后备母猪卵泡发育早期具有重要作用通常在卵母细胞发育的过程中, 卵母细胞调节颗粒细胞功能的能 [12] 力逐步下降, 而且这种下降猪要比小鼠更快对于猪, 体内研究和体外研究都发现, 在卵母细胞成熟过程中 GDF 9mRNA 表达量显著下降 [6,13] 在卵母细胞成熟过程中, 卵母细胞对颗粒细胞功能调控能力下降, 高能量水平下调大卵泡中 COCsGDF 9 和 BMP 15mRNA 表达, 加速了这个过程, 从而增加卵母细胞成熟能量水平和来源对 GDF 9 mr NA 表达有互作效应, 低能量水平淀粉组表达量最高 LHR 和 FSHR 在卵泡发育过程中扮演了重要的角色在卵泡发育过程中, 原始卵泡和初级卵泡发育不依赖促性腺激素, 在前腔卵泡阶段开始对促性腺激素产生反应, 从有腔卵泡开始依赖促性腺激素, 主要为 FSH,LH 也存在协同促进卵泡发育的作用, 当卵泡发育到直径大于 3mm 成为优势卵泡, 转向依赖 LH [1] 在卵泡发育早期 GDF 9 和 BMP 15 [4 5] 抑制 LH 和 FSH 受体表达促进卵泡发育, 但在排卵前, 高能量水平下调大卵泡中 COCsGDF 9 BMP 15mRNA 表达, 降低对 LHR FSHR mrna 表达的抑制, 增加 COCs 对促性腺激素的敏感性, 从而导致更多的卵母细胞达到成熟高能量水平上调 [14] FSHR 和 LHR mrna 表达与于淼英的结果一致高能量水平也可能直接调控 FSHR 和 LHR mrna 表达, 提高能量水平增加血浆中葡萄糖的浓度, 葡萄糖可以促进转录激活因子同源盒基因 (Ho meoboxgenes) 哺乳动物同源基因 (Mammalian homologuegenes)mrna 等与相应的 DNA 顺式激 [15] 活元件结合, 启动基因的转录能量来源对 GDF 9 BMP 15 LHR 和 FSHR mrna 的表达的影响还未见报道研究发现淀粉组上调 GDF 9 和 LHR mrna 的表达, 对 BMP 15 和 FSHRmRNA 表达无显著影响, 淀粉组卵母细胞成熟比例高于油脂组结合卵泡发育过程, 淀粉组中较高的 LHRmRNA 表达对卵母细胞成熟具有重要作用油脂组 LHRmRNA 表达量低可能与油脂代谢产物有关油脂代谢产生脂肪酸, 其中棕榈酸抑制转录激活因子同源盒基因与 DNA 顺式激活元件结合, 下调转录激活因子哺乳动物同源基因 mr NA 的表达而且, 以棕榈酸为底物合成的神经酰胺可能抑制蛋白激酶 B 的活性进而阻碍转录激活 [15] 因子与相应位点的结合, 从而抑制基因转录在卵母细胞体外成熟过程中,GDF 9 和 BMP 15 存在协同作用 GDF 9 和 BMP 15 基因同时突变导致体外培养的小鼠 COCs 卵丘扩散程度和达到 [16] 2 细胞期的胚胎数显著低于野生型小鼠在羊的 [17] 研究也发现, 在正常表达 GDF 9 和 BMP 15 的绵羊卵母细胞转染突变的 BMP 15 基因, 降低 GDF 9 和 BMP 15mRNA 表达, 由此导致繁殖性能下降由于 GDF 9 和 BMP 15 存在协同作用, 淀粉组上调

8 1678 畜牧兽医学报 39 卷 GDF 9, 但是 GDF 9 和 BMP 15 二者对 LHR FSHR mrna 表达的抑制作用可能并没有增强能量水平和来源对 LHR 和 FSHR mrna 表达有互作效应,LHR 和 FSHR mrna 表达量分别在高能量水平淀粉组和脂肪组最高 4 小结后备母猪饲喂高能量水平和以淀粉为主要能量来源的日粮提高卵母细胞质量高能量水平可能通过下调卵母细胞分泌因子 GDF 9 和 BMP 15 mr NA 表达, 上调 LHR 和 FSHR mrna 表达, 提高卵母细胞成熟比例参考文献 : [1] HUNTER M G.Oocytematurationandovumquality inpigs[j].reviewsofreproduction,2000,5: [2 ] PANGAS S A,JORGEZ C J,MATZUK M M. Growthdiferentiationfactor9regulatesexpression ofthebonemorphogeneticproteinantagonistgremlin [J].The Journalof Biological Chemistry,2004, 279: [3] SHIMIZU T,MIYAHAYASHIY,YOKOO M,et al.molecularcloningofporcinegrowthdiferentia tionfactor9 (GDF 9)cDNAanditsroleinearlyfol liculogenesis:directovarianinjectionofgdf 9gene fragmentspromotesearlyfoliculogenesis[j].repro duction,2004,128: [4] YOSHINO O,MCMAHON H E,SHARMA S,et al.auniquepreovulatoryexpressionpaternplaysa keyroleinthephysiologicalfunctionsofbmp 15in themouse[j].proceedingsthenationalacademyof Sciences,2006,103: [5] ELVINJA,CLARK A T,WANGP,etal.Parac rineactionsofgrowthdiferentiationfactor 9inthe mammalian ovary [J]. Molecular Endocrinology, 1999,13: [6] LIH K,KUO T Y,YANG H S,etal.Diferential geneexpressionofbonemorphogeneticprotein15and growthdiferentiationfactor9during 犻狀狏犻狋狉狅 matura tionofporcineoocytesandearlyembryos[j].anim ReprodSci,2008,103: [7] VAN DEN BRAND H,LANGENDIJK P,SOEDE N M,etal.Efectsofpostweaningdietaryenergy sourceonreproductivetraitsinprimiparoussows[j]. JAnimSci,2001,79: [8] HAZELEGER W,SOEDE N M,KEMP B.The efectoffeeding strategy during the pre folicular phaseonsubsequentfoliculardevelopmentinthepig [J].DomesticAnimalEndocrinology,2005,29: [9] VATZIASG, HAGEN D R. Efects of porcine folicularfluidandoviduct conditionedmediaonmat urationandfertilization ofporcineoocytes 犻狀狏犻狋狉狅 [J].BiologyofReproduction,1999,60: [10] FERGUSONE M,ASHWORTH CJ,EDWARDSS A,etal.Efectofdiferentnutritionalregimensbe foreovulationonplasmaconcentrationsofmetabolic andreproductivehormonesandoocyte maturationin gilts[j].reproduction,2003,126: [11] EPPIGJJ,WIGGLESWORTH K,PENDOLAFL. Themammalianoocyteorchestratestherateofovari anfoliculardevelopment[j].proceedingsofthena tionalacademyofsciences,2002,99: [12] GILCHRIST R B,RITTER LJ,ARMSTRONG D T.Oocytesomaticcelinteractionsduringfoliclede velopmentinmammals[j].animalreproductionsci ence,2004,8283: [13] PROCHAZKAR,NEMCOVAL,NAGYOVAE,et al.expressionofgrowthdiferentiationfactor9mes sengerrnainporcinegrowingandpreovulatoryo varianfolicles[j].biologyofreproduction,2004, 71: [14] 于淼英. 不同日粮能量水平对初情期前母猪卵巢和子宫 LHR 和 FSHR mrna 表达的影响 [D]. 吉林 : 吉林大学,2006. [15] POITOUT V,HAGMAN D,STEIN R,etal.Reg ulationoftheinsulingenebyglucoseandfatyacids [J].JournalofNutrition,2006,136: [16] SU Y Q,WU X M,O BRIEN MJ,etal.Synergis ticrolesofbmp15andgdf9inthedevelopmentand functionoftheoocytecumuluscelcomplexin mice: geneticevidenceforanoocytegranulosacelregulato ryloop[j].developmentalbiology,2004,276: [17] WU XL,MOOREK,OTSUKAF,etal.Efectof intracelularinteractionsontheprocessingandsecre tionofbonemorphogeneticprotein 15 (BMP 15)and growthanddiferentiationfactor 9[J].TheJournal ofbiologicalchemiestry,2003,278:

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$;54 ;1 ( ' ) Vol.54 No JournalofXiamenUniversity (NaturalScience) Jan.2015 doi: /j.issn RSTU V ; &! Y,,, [,2\$ ;54 ;1 ( ' ) Vol.54 No.1 2015 1 JournalofXiamenUniversity (NaturalScience) Jan.2015 doi:10.6043/j.issn.0438 0479.2015.01.011 RSTU V ; &! Y,,, Z,@ [,2\] ( 8+ =,>^ E G,Y7,>^ 361102) ; : ( 犕狔犮犪犾犲狆犺狔犾狅狆犺犻犾犪