38 食品与生物技术学报第 30 卷犓犲狔狑狅狉犱狊 :chicken essence,restraint stress,immune activity,corticosterone,apoptosis, mitochondrionmembranepotential,cytc 应激反应涉及神经内

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笞灸戎
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1 第 30 卷第 1 期 2011 年 1 月食品与生物技术学报犑狅狌狉狀犪犾狅犳犉狅狅犱犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔 Vol.30 No.1 Jan 文章编号 : (2011) 营养型鸡精对拘束应激小鼠免疫功能的改善作用李怡芳, 曾怀苇, 陈邦添, 何蓉蓉, 栗原博 ( 暨南大学中药及天然药物研究所, 广东广州 ) 摘要 : 作者研究了营养型鸡精对拘束负荷小鼠免疫功能的改善作用将小鼠随机分为正常对照组, 拘束应激组,25mg/kgRU486( 糖皮质激素受体拮抗剂组 ),1mL/hgBEC( 营养型鸡精 ) 组及 2 ml/hgbec 组, 每组 10 只除正常对照组外, 其余各组连续灌胃给药 5d 后拘束负荷 18h, 拘束恢复 3d 后取血取脾脏测定相关指标结果显示 :BEC 不仅可以明显改善拘束应激对小鼠脾脏的损伤, 提高脾淋巴细胞总数, 而且能显著降低应激小鼠血浆中皮质酮的含量, 抑制相关凋亡因子的基因表达, 提高线粒体膜电位, 减少细胞色素 C 的释放 BEC 可以通过抑制应激小鼠脾淋巴细胞的凋亡来维护脾淋巴细胞数目和功能, 改善应激负荷引起的免疫抑制作用关键词 : 拘束应激 ; 免疫功能 ; 皮质酮 ; 细胞凋亡 ; 线粒体膜电位 ; 细胞色素 C 中图分类号 :R392.1 文献标识码 :A 犈犳犲犮狋狊狅犳犆犺犻犮犽犲狀犈狊犲狀犮犲狅狀犐犿犿狌狀犲犃犮狋犻狏犻狋狔犻狀犚犲狊狋狉犪犻狀狋犛狋狉犲狊狊犲犱犕犻犮犲 LIYi fang, ZENG Huai wei, CHENBang tian, HERong rong, KURIHARA Hiroshi (InstituteofTraditionalChineseMedicineandNaturalProducts,JinanUniversity,Guangzhou510632,China) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :ThisstudyaimstostudytheefectofBEC(BRANDS Chicken Essence,BEC)on immunesysteminrestraintstressedmice.micewererandomlydividedinto5groupswith10mice eachgroup:normalcontrolgroup,restraintcontrolgroup,25 mg/kgru486 (GRantagonist) group,1ml/100gbecand2ml/100gbec.thetreatmentgroupswereoralyadministrated withbecorru486forconsecutive5days,whilenormalcontrolandstresscontrolgroupswere giventhesamevolumeofwater.onthe5thday,almicewererestraintfor18hexceptnormal group.after3daysrecovery,miceweresacrificed.bloodwasdistiledandspleenswerereceived topreparelymphocytesforfolowingtests.theresultsshowedthatbecnotonlycouldprotect thereducedspleenindexandspleenlymphocytes,butalsocouldinhibittheelevatedcontentof corticosteroneinplasma.rt PCRanalysisshowedthatBECalsocouldrecoverGR mrna,bcl 2mRNAandBaxmRNAinspleenlymphocytesnearlytonormal.Meantime,themitochondrion membranepotential (ΔΨmt),thecontentofCytCincytoplasm or mitochondrion ofspleen lymphocyteswerealsorecoveredtonormalwhencomparedtostressedmice.aloftheseresults indicatedthatbeccouldprotectspleenlymphocytesagainstapoptosisandimprovetheimmune functioninrestraintstressedmice. 收稿日期 : 作者简介 : 李怡芳 (1985-), 女, 江西抚州人, 生物医药工程博士研究生, 主要从事天然产物药理论活性研究 liyifangkele@sina.com 通信作者 : 栗原博 (1954-), 男, 辽宁沈阳人, 教授, 博士研究生导师, 主要从事中药及天然产物药理活性研究 Hiroshi_Kurihara@163.com

2 38 食品与生物技术学报第 30 卷犓犲狔狑狅狉犱狊 :chicken essence,restraint stress,immune activity,corticosterone,apoptosis, mitochondrionmembranepotential,cytc 应激反应涉及神经内分泌及免疫等多方面的生理功能, 对于机体的影响是广泛的作者将小鼠放置在狭窄的拘束环境中, 限制自由运动, 使其烦躁和焦虑来模拟心理应激状态采用拘束负荷诱发小鼠氧化应激是目前被广泛采用的一种模拟心理压力的应激模型研究结果表明, 拘束应激能明显影响机体的免疫功能, 显著改变淋巴细胞数目和 [1-7] 活性前期实验结果提示小鼠拘束负荷后会引起免疫担当细胞数量和机能的下降,T 淋巴细胞亚群 CD4/CD8 比例失调及 NK 细胞活性降低等现象, 且这种免疫抑制作用持续到拘束负荷后 3 天时最为显著因此, 利用小鼠拘束负荷模型评价抗应激活性物质对免疫系统的影响, 探讨其作用机制目前, 营养型鸡精被已被国内外多家研究机构确认含有苏氨酸缬氨酸蛋氨酸异亮氨酸亮氨酸苯丙氨酸赖氨酸及色氨酸等人体所需的 8 种 [8-9] 必须氨基酸在内的多种氨基酸, 也富含相当比 [10] 例的游离氨基酸当然, 成年人必须的组氨酸和婴幼儿需要的精氨酸也都富含在其中此外, 营养 [9] 型鸡精还含有多种矿物质微量元素和维生素, 及肌肽 (carnosine) 鹅肌肽 (anserine) 和牛磺酸等营养元素营养型鸡精主要用于病人恢复健康, 补充营养, 促进新陈代谢水平, 提高运动员身体素质, 也被用于恢复精神及体力疲劳和增强大脑反应能 [11 15] 力及提高学习记忆效果等方面可以看出, 营养型鸡精具有一定的抗应激作用, 但有关鸡精对免疫系统的作用研究甚少, 因此, 作者利用拘束负荷小鼠模型探讨营养型鸡精的免疫赋活作用, 旨在为营养型鸡精作为保健品的广泛应用提供一定的实验依据品及罗丹明 123(rodamine123): 美国 Sigma 公司产品 ;RU486: 购于浙江仙居药厂 ;MgCl2 联二亚硫酸钠及正铁氰化钾 : 购于天津市福晨试剂厂 ;10xPCR bufer 5 cdna 合成缓冲液 (5 firststrandbuf er) 6 DNA loading bufer DNA marker I dntps M MLV 反转录酶 Oligo(dT) 20 Rnase FreeddH 2 O Taq DNA 多聚酶及 TRIzol: 北京 Tiangen 公司产品 ; 氯仿异丙醇及无水乙醇 : 购于山东禹王试剂公司 ; 琼脂糖 Agarose: 英国 Oxoid 公司产品 CoulterXL 流式细胞仪 : 美国 Beckman 公司产品 ; 荧光显微镜 : 日本 Olympus 公司产品 ;2720 型 PCR 仪 : 美国 APPLIEDBIOSYSTEMS 公司产品 ; 电泳成像系统 : 美国 Bio Rad 公司产品 ; 超级纯水仪 : 美国 Milipore 公司产品 ; 电泳仪及水平电泳槽 : 日本 Mupid 公司产品 ; 组织匀浆机 : 德国 IKA Labortechnik 公司产品 ; 高速冷冻离心机及电子分析天平 : 德国 Sartorius 公司产品 ; 漩涡混合器 : 太仓市科教器材厂产品 ; 高效液相色谱系统 : 日本 HI TACHI 公司产品 1 3 动物分组及拘束应激模型建立实验将小鼠随机分为正常对照组, 拘束应激组,RU486 组 ( 糖皮质激素受体拮抗剂,25 mg/ kg), 低剂量 BEC 组 (1mL/hg) 及高剂量 BEC 组 (2 ml/hg), 共 5 组, 每组 10 只动物实验方案如图 1 所示 1 材料与方法 1 1 动物 7 周龄雄性清洁级昆明种小鼠 : 购自广东省医学实验动物中心, 许可证号 SCXK( 粤 ) 饲养温度 23 ±2, 照明时间每天 12h (7:00~ 19:00), 用普通饲料饲养 1 周后用于实验 1 2 试剂与仪器营养型鸡精 (BRAND s chicken essence, BEC): 新加坡食益补太平洋有限公司提供 ; 皮质酮 (corticosterone) 标准品氢化可的松 (cortisol) 标准图 1 小鼠拘束负荷及给药方法犉犻犵.1 犈狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾狊犮犺犲犱狌犾犲犳狅狉犿犻犮犲犲狓狆狅狊犲犱狋狅狉犲狊狋狉犪犻狀狋狊狋狉犲狊实验组每天给药一次连续给药 5d, 正常对照组与拘束应激组给予等容量水溶液除正常对照组外, 其余各组给药 5d 后拘束负荷 18h, 拘束恢复 3d 后测定相关实验指标小鼠拘束装置为通风良好的 50mL 尖底聚丙烯塑料离心管, 给予一次性拘

3 第 1 期李怡芳等 : 营养型鸡精对拘束应激小鼠免疫功能的改善作用 39 束 18h(15:00-9:00), 拘束期间小鼠不能进食饮 [16] 水, 正常对照组小鼠为非拘束禁食禁水小鼠 1 4 脾脏指数的测定及淋巴细胞悬液制备小鼠称重后乙醚麻醉并取出脾脏, 按公式计算脾脏指数脾脏指数 = 脾脏质量 (g) / 小鼠体重 (g) 100% 计算脾脏指数淋巴细胞制备方法为, 将脾脏置于玻璃匀浆器中添加 2mLPBS 溶液后研磨,200 目网过滤, 取细胞悬液在显微镜下观察, 计算脾细胞总数 r/min 离心 5 min, 弃上清液, 加入红细胞裂解液 1mL, 混匀, 静置 2 min 后加 PBS 溶液 3 ml 终止裂解反应,4 1500r/min 离心 5 min, 弃上清液, 用 10mLPBS 溶液洗两次后, 加 0.5mLPBS 溶液混匀后在显微镜下细胞计数, 按不同指标的测定要求调整脾淋巴细胞悬液浓度 1 5 血浆皮质酮含量测定取小鼠全血置于肝素处理过的离心管中, 以 5000r/min 离心 5 min 分离血浆取 0.5 ml 血浆, 并添加入 2mL 乙酸乙酯振摇萃取, 分离得到上层乙酸乙酯液, 下层水液再用乙酸乙酯萃取一遍, 合并乙酸乙酯液后用 0.1 ml NaOH 洗一次, 再用蒸馏水洗 2 次乙酸乙酯液置于氮气下挥发吹干后加入 100μL 流动相 ( 犞 ( 乙腈 ) 犞 ( 水 ) =38 72) 溶解即得皮质酮分析样品溶液按 Woodward 等人的方法, 采用 HPLC 内标法 ( 内标物为 corti [17] sol) 测定血浆中皮质酮含量检测条件为: 紫外检测, 检测波长为 254nm; 色谱柱 :5C18( 犇 4.6mm 150 mm,5μm); 流动相 : 犞 ( 乙腈 ) 犞 ( 水 )= 38 72; 流量 :1mL/min 1 6 脾脏淋巴细胞线粒体膜电位的测定罗丹明 123(Rh123) 是一种细胞通透性的阳离子的荧光探针, 容易被有活性的线粒体摄取, 没有细胞毒性 Rh123 透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集, 发出黄绿色荧光, 可用于对很多种活细胞进行染色, 容易观察和分析线粒体的形态变化作者将小鼠脾淋巴细胞悬液调至浓度为个 / ml 的单细胞悬液, 吸取 100μL 的细胞悬液于流式管中, 加入的 Rh123 溶液 ( 终浓度为 6.8μmol/L), 室温孵育 15 min 后用探针与细胞充分接触用 PBS (ph7.4) 洗涤细胞 2 次, 以充分除去细胞外荧光物质, 流式细胞仪在 485nm 光激发下,525nm 的发射光条件下进行检测 1 7 脾脏线粒体细胞色素犆 ( 犆狔狋犆 ) 含量测定脾脏淋巴细胞胞浆中 CytC 的提取方法为, 取制备好的个 /ml 以 1000r/min 离心 5 min, 沉淀后添加 1 ml 预冷的细胞裂解液冰浴 20 min,12 号针头吹打均匀,12000r/min 离心 30 min, 上清部分蛋白定量后用于细胞浆 CytC 含量的 [18] 检测对于脾脏淋巴细胞线粒体中 CytC 的检测, 实验将小鼠心脏采血后迅速取下脾脏, 称重后按 1g 9mL 比例加入预冷的分离介质 ( 蔗糖 250mmol/ L,EDTA015mmol/L,Tris HCl10mmol/L,pH 7.4) 置于玻璃匀浆器中冰浴条件下匀浆组织匀浆液在 3000r/min, 离心 3min 后取上清液, 以 r/min 离心 8min 仔细将沉淀物悬置于 Ficol 梯度中,10000r/min 离心 30min 弃除上清液后, 将沉淀物用匀浆液悬浮, 并以 11000r/min 离心 8 min, 回收沉淀的线粒体, 以上所有操作均在 4 条件下进行, 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定线粒体 [19-20] 悬液的蛋白含量线粒体蛋白悬液分装后 - 70 保存以待用线粒体中 CytC 的测定 Cyt 含量按 Schenider.H 等 [21 22] 的方法测定, 采用氧化还原差光谱 ( 联二亚硫酸钠还原减去正铁氰化钾氧化的差光谱 ), 扫描范围是 630~500nm, 求得 4 个波长段的消光值, 代入下列公式计算出细胞色素 C 的含量 :Cytc = 4913 ( 犃 550 ~ 犃 535) ( 犃 554~ 犃 540)+1518 ( 犃 563~ 犃 557) 1 8 脾脏淋巴细胞中犌犚犅犪狓及犅犮犾 2 犿犚犖犃基因表达水平的测定收集脾脏淋巴细胞约个, 离心倒尽培养基, 加入 1mL 细胞裂解液 Trizol 试剂, 并按 Tian gen 说明书操作逐步提取得到总 RNA cdna 第一链合成体系为 25mL, 每份取总 RNA3μg, 用逆转录酶 M MLV oligodt dntp 以及相关试剂按说明配成适当浓度, 合成 cdna 取 1mL 反转录合成 cdna, 反应条件为 : 预变性 94 5min, 变性 94 30s, 退火 30s, 延伸 72 45s, 进行 30 次循环, 最后 72 延伸 7 min, 以 18S 为内参进行 PCR 扩增 PCR 产物经质量分数 10% 琼脂糖凝胶电泳,Bio rad 凝胶成像系统记录结果,Bandscan 软件进行灰度分析结果以目的基因和内参照物 18S 扩增片段的灰度值比较表示引物根据 GeneBank 提供的基因序列使用 primerde sign 软件进行引物设计, 均由英韦创津公司合成 ( 如表 1) 1 9 统计学处理实验数据以 mean ± S.E.M 表示, 采用 SPSS13.0 软件, 利用 ANOVA 检验和 Dunnet s 检验进行统计学处理, 犘 <0.05 有统计学意义

4 40 食品与生物技术学报第 30 卷表 1 引物基因序列及退火温度犜犪犫.1 犛犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狆狉犻犿犲狉狊犪狀犱犪狀狀犲犪犾犻狀犵狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狊基因名 GenBank 序列号引物序列扩增片段 /bp 退火温度 / 18S K ForwardPrimer(5'-3'):AGGGGAGAGCGGGTAAGAGA ReversePrimer(5'-3'):GGACAGGACTAGGCGGAACA GR X04435 ForwardPrimer(5'-3'):TGGTGTGCTCCGATGA ReversePrimer(5'-3'):AGGGTAGGGGTAAGC Bax NM ForwardPrimer(5'-3'):CGCACCCGGCGAGAGG ReversePrimer(5'-3'):CCAAGGCAGAGGGAGG Bcl-2 NM ForwardPrimer(5'-3'):CTGGAGGTCTGAAGCG ReversePrimer(5'-3'):ATGAATCGGGAGTTGG 实验结果没有明显变化 2 1 犅犈犆对拘束应激小鼠脾脏指数与脾淋巴细胞数影响如表 2 所示, 与正常对照组小鼠相比, 拘束负荷小鼠脾脏指数显著降低 ( 犘 <0.05), 与拘束负荷小鼠相比,RU486 和 BEC 给药小鼠均不同程度改善脾脏指数, 且呈一定的剂量依赖性关系在这一实验中, 注意到拘束负荷小鼠脾细胞显著降低 ( 犘 < 0.01), 与拘束负荷小鼠相比,RU486 和 BEC 给药小鼠均不同程度改善脾细胞数结果说明拘束负荷小鼠脾脏的萎缩是因应激反应诱发脾脏细胞数目减少而引起的, 且这种作用可能与糖皮质激素及其受体有关表 2 犅犈犆对拘束应激小鼠脾脏指数和脾淋巴细胞数的影响犜犪犫.2 犈犳犲犮狋狅犳犅犈犆狅狀狊狆犾犲犲狀犻狀犱犲狓犪狀犱狊狆犾犲犲狀犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲狊犮狅狌狀狋狊犻狀狉犲狊狋狉犪犻狀狋狊狋狉犲狊犲犱犿犻犮犲组别脾脏指数 /% 脾淋巴细胞数 / 10 6 图 2 犅犈犆对拘束应激小鼠血浆皮质酮含量的影响犉犻犵.2 犈犳犲犮狋狅犳犅犈犆狅狀犮狅狉狋犻犮狅狊狋犲狉狅狀犲犾犲狏犲犾犻狀狆犾犪狊犿犪犻狀狉犲狊狋狉犪犻狀狋狊狋狉犲狊犲犱犿犻犮犲 2 3 犅犈犆对拘束应激小鼠脾淋巴细胞线粒体膜电位 (ΔΨ 犿 ) 的影响如图 3 所示, 与正常对照组小鼠相比, 拘束负荷小鼠脾淋巴细胞膜电位显著降低 ( 犘 < 0.01); 与拘束应激小鼠相比,RU486 和 BEC 高低剂量给药小鼠膜电位均有显著提高正常对照组 0.23± ±3.6 拘束应激对照组 0.11±0.07 # 6.6±2.1 ## RU ± ±2.5 BEC-L 0.20± ±3.9 BEC-H 0.25± ±3.7 注 : 与 normalcontrol 相比,# 犘 <0.05,## 犘 <0.01 ; 与 stresscontrol 相比, 犘 <0.05, 犘 < 犅犈犆对拘束应激小鼠血浆皮质酮含量的影响如图 2 所示, 与正常对照组相比, 拘束应激小鼠血浆中皮质酮的含量显著升高 ( 犘 <0.01),BEC 给药小鼠明显改善血浆中皮质酮含量, 且呈一定的剂量依赖性关系与模型组相比,RU486 给药小鼠图 3 犅犈犆对拘束应激小鼠脾淋巴细胞线粒体膜电位 (ΔΨ 犿 ) 的影响犉犻犵.3 犈犳犲犮狋狅犳犅犈犆狅狀犿犻狋狅犮犺狅狀犱狉犻犪犿犲犿犫狉犪狀犲狆狅狋犲狀狋犻犪犾狊狅犳狊狆犾犲犲狀犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲狊犻狀狉犲狊狋狉犪犻狀狋狊狋狉犲狊犲犱犿犻犮犲

5 第 1 期李怡芳等 : 营养型鸡精对拘束应激小鼠免疫功能的改善作用犅犈犆对拘束应激小鼠脾脏淋巴细胞胞浆中犆狔狋犆和线粒体中犆狔狋犆含量的影响如表 3 所示, 与正常对照组小鼠相比, 线粒体中 CytC 含量显著降低 ( 犘 <0.01), 细胞浆中 CytC 含量显著升高 ( 犘 <0.01); 与拘束应激小鼠相比, RU486 和 BEC 高低剂量组显著改善线粒体中 CytC 含量, 并且明显降低细胞浆中 CytC 含量表 3 犅犈犆对拘束应激小鼠脾脏淋巴细胞胞浆中犆狔狋犆和线粒体中犆狔狋犆含量的影响犜犪犫.3 犈犳犲犮狋狅犳犅犈犆狅狀犆狔狋犆犮狅狀狋犲狀狋狊犻狀犮狔狋狅狆犾犪狊犿犪狀犱犿犻狋狅犮犺狅狀犱狉犻犪狅犳狊狆犾犲犲狀犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲狊犻狀狉犲狊狋狉犪犻狀狋狊狋狉犲狊犲犱犿犻犮犲组别细胞浆 CytC/ (nmol/mg) 线粒体 CytC/ (nmol/mg) 正常对照组 18.41± ±13.6 拘束应激对照组 42.33±8.67 ## ±12.1 ## RU ± ±9.8 BEC L 30.67± ±9.12 BEC H 25.08± ±8.91 注 : 与正常对照组相比,## 犘 <0.01; 与拘束应激对照组相比, 犘 <0.05, 犘 < 犅犈犆对拘束应激小鼠脾淋巴细胞中犌犚, 犅犪狓及犅犮犾 2 犿犚犖犃基因表达的影响如图 4 所示, 与正常对照组小鼠相比, 拘束负荷小鼠 GR mrna 与 Bcl 2 mrna 基因表达显著减弱 ( 犘 <0.05),BaxmRNA 基因表达显著增强 ( 犘 <0.05); 与拘束负荷小鼠相比,BEC 给药小鼠的 GR mrna 与 Bcl 2 mrna 基因表达均能明显地增强,BaxmRNA 基因表达显著减弱与拘束负荷小鼠模型组相比,RU486 给药小鼠有效的缓解 Bax mrnabcl 2mRNA 水平, 但对 GR mrna 表达没有明显的影响注 :(a)gr mrna 基因表达水平 ;(b)bcl 2mRNA 基因表达水平 ;(c)baxmrna 基因表达水平 ; 与正常对照组相比,# 犘 <0.05,## 犘 <0.01; 与拘束应激对照组相比, 犘 <0.05, 犘 <0.01 图 4 犅犈犆对拘束应激小鼠脾淋巴细胞中犌犚, 犅犪狓及犅犮犾 2 犿犚犖犃基因表达的影响犉犻犵.4 犈犳犲犮狋狅犳犅犈犆狅狀犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊犻狅狀狅犳犌犚, 犅犪狓犪狀犱犅犮犾 2 犿犚犖犃狊狅狀狊狆犾犲犲狀犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲狊犻狀狉犲狊狋狉犪犻狀狋狊狋狉犲狊犲犱犿犻犮犲 3 结语富含成熟淋巴细胞的脾脏是机体最大的免疫器官之一, 在维护机体机正常免疫功能上发挥着至关重要的作用因此, 脾脏指数与脾脏淋巴细胞总数作为免疫指标被广泛用于药效评价实验中发现拘束负荷 18h 不仅使小鼠脾脏指数明显下降, 同时脾脏淋巴细胞总数显著减少, 拘束应激明显抑制小鼠免疫功能前期实验已证明, 拘束应激诱发的这种免疫抑制作用在拘束负荷后 3 天最为明 [16,23 24] 显在实验中确认,BEC 给药明显改善因拘束负荷减少的小鼠脾脏指数和脾脏淋巴细胞总数,

6 42 食品与生物技术学报第 30 卷提示 BEC 能够缓解拘束负荷小鼠的免疫功能 Sang 等人对脾脏超微结构观察中发现, 应激负 [25] 荷能破坏脾脏的正常结构, 导致免疫细胞凋亡 ; Tarcic 等人在研究中确认应激状态下脾脏重量显著降低和胸腺萎缩, 并提示这种作用可能与血浆中的糖皮质激素 (glucocorticoid,gc) 增多, 继而对免疫细胞产生直接损伤和导致免疫细胞凋亡有 [26-27] 关在实验中也观察到糖皮质激素受体拮抗剂 RU486 能够改善拘束负荷小鼠脾脏指数及脾脏淋巴细胞数, 表明应激负荷对糖皮质激素水平及其受体的影响可能是脾脏指数及脾脏淋巴数目减少的重要原因因此, 作者以小鼠血浆中皮质酮的含量及受体 GR mrna 在脾淋巴细胞中的表达水平为指标探讨应激负荷的影响实验结果发现, 拘束应激显著增多小鼠血浆中皮质酮的含量, 反馈性地下调 GR mrna 的表达, 提示拘束负荷激活了 HPA 轴, 使 GC 分泌增多, 作用于脾脏, 导致脾脏淋巴细胞的减少在探讨脾脏淋巴细胞的减少是否起因于淋巴细胞的凋亡时, 发现拘束应激明显提高小鼠 BaxmRNA 基因表达水平的同时, 显著减低了 Bcl 2mRNA 的表达, 影响了 Bax/Bcl 2mRNA 的平衡实验结果显示,RU486 能够有效的调节因拘束负荷影响的小鼠脾淋巴细胞 BaxmRNA 和 Bcl 2 mrna 基因表达确认应激负荷小鼠脾淋巴数目的减少与 GC 诱导淋巴细胞发生凋亡相关至今为止的研究证明,GC 分泌增多能够激活 GR 向细胞核转移, 并与 DNA 上反应元件结合后, 诱导相关凋亡基因表达发生变化引起脾淋巴细胞发生凋亡此外, 在实验中注意到拘束应激显著下降脾淋巴细胞膜电位, 减少线粒体中 CytC 含量和增多细胞浆中的 CytC 水平当给予应激负荷小鼠糖皮质激素受体拮抗剂 RU486 后, 可以有效改善膜电位和 CytC 水平, 结果提示拘束应激诱导脾淋巴细胞发生凋亡, 导致脾脏指数减小和淋巴细胞数目的减少在探讨 BEC 如何影响拘束负荷小鼠免疫功能时发现,BEC 不仅可以改善拘束小鼠血浆中的皮质酮含量, 同时有效的调节因激诱负荷引起的脾脏淋巴细胞 GR mrna Bax/Bcl 2mRNA 线粒体膜电位及 CytC 水平的改变, 提示 BEC 通过影响淋巴细胞凋亡, 改善拘束应激小鼠的免疫功能实验结果显示营养型鸡精对小鼠免疫功能的改善作用与调节皮质酮水平, 抑制激素对其受体的激活, 维持相关凋亡基因和蛋白的正常表达相关已有很多研究证明营养型鸡精中富含肌肽等小分子化合物是中枢组织胺神经 (histaminergicneuronsys tem) 递质的前驱活性物质, 可以通过组胺酸等代谢途径有效的调节中枢自我意识控制的组织胺神经 [28 29] 水平, 缓解应激源的压力, 从整体上来调整机体内环境的稳定, 从而提高小鼠的抗应激能力, 改善拘束应激小鼠的免疫功能此外, 营养型鸡精中富含肌肽和鹅肌肽等组胺酰二肽类化合物, 研究表明它们具有很强的抗氧化活性, 不仅能够清除拘束应激产生的自由基及防止线粒体膜脂质过氧化, 也 [30 31] 能够有效的保护线粒体细胞膜的正常结构, 防止脾脏淋巴细胞凋亡和维护小鼠脾脏的结构和免疫功能当然, 鸡精中富含的氨基酸微量元素及维生素等其他营养成分在抗应激和改善拘束负荷小鼠的免疫功能上发挥着重要作用参考文献 (References): [1]SoniaL.BREAKTHROUGHS AND VIEWS:Glucocorticoid Induced ApoptosisinLymphocytes [J]. 犅犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾犪狀犱犅犻狅狆犺狔狊犻犮犪犾犚犲狊犲犪狉犮犺犆狅犿犿狌狀犻犮犪狋犻狅狀狊,2000,279, [2]FukuiY,SudoN,YuXN.Therestraintstress inducedreductioninlymphocytecelnumberinlympoidorganscorrelates withthesupressionofinvivoantibodyproduction [J]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犖犲狌狉狅犻犿犿狌狀狅犾狅犵狔,1997,79: [3]MilanS,GiordanoM,SotoL,etal.Shortandlongrestraintdiferentialyafecthumoralandcelularimmunefunctions [J]. 犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲狊,1996,59(17): [4]BonneauRH,SheridanJF,FengNG,etal.Stressinducedsuppressionofherpessimplexvirus(HSV) specificcytotoxic TlymphocyteandnaturalkilercelactivityandenhancementofacutepathogenesisfolowinglocalHSVinfection[J]. 犅狉犪犻狀犅犲犺犪狏犻狅狉犪狀犱犐犿犿狌狀狅犾狅犵狔,1991,5: [5]JohnH,DavidA,PatriciaA.etal.PadgetModulationofnaturalkilercelactivitybyrestraintstressduringaninfluen zaa/pr8infectioninmice[j]. 犅狉犪犻狀犅犲犺犪狏犻狅狉犪狀犱犐犿犿狌狀犻狋狔,2004,18: [6]ConnieJR,CynthiaS,etal.AcutestressimpairsNKceladhesionandcytotoxicitythroughCD2,butnotLFA 1[J]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犖犲狌狉狅犻犿犿狌狀狅犾狅犵狔,1999,99: [7]KuriharaH,TanakaT,KisoY,WatanabeT.TheChangesofHistamineConcentrationsinthePlasmaandBraininRe sponsetoacutestress[m].amsterdam:elsevier,2001. [8]AzharMZ,MohsinSSJ.Efectoftakingchickenessenceonstressandcognitionofhumanvolunteers[J]. 犕犪犾犪狔狊犻犪犑狅狌狉狀犪犾犖狌狋狉犻狋犻狅狀,2003,9:19-29.

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8 4 食品与生物技术学报第 30 卷

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38 食品与生物技术学报第 30 卷 犓犲狔狑狅狉犱狊 :chicken essence,restraint stress,immune activity,corticosterone,apoptosis, mitochondrionmembranepotential,cytc 应激反应涉及神经 内

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