896 食品与生物技术学报第 29 卷酸 ) [1], 在空气中易氧化为氧化性谷胱甘肽 (GSSG), 具有抗氧化解毒改善风味等作用, 在临床医药食品行业化妆品行业等领域有着广泛的 [2] 用途, 近期研究发现 GSH 还具有抑制艾滋病的 [3] 作用目前国内的 GSH 整体分离纯化技术

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诈慕
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1 第 29 卷第 6 期 2010 年 11 月食品与生物技术学报犑狅狌狉狀犪犾狅犳犉狅狅犱犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔 Vol.29 No.6 Nov 文章编号 : (2010) 啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法杨海麟, 张玉然, 辛瑜, 仝艳军, 张玲, 王武 ( 江南大学工业生物技术教育部重点实验室, 江苏无锡 ) 摘要 : 建立了一种从酿酒酵母干细胞中高效抽提谷胱甘肽 (GSH) 的新方法, 料液比为 1 8, 采用醋酸盐酸调节抽提 ph 值为 3.5, 抽提温度 (70±1) 的条件下,GSH 抽提量可达 5.50mg/g, 比已报道的其它抽提法提高 54.49%~62.24% 抽提液经微滤( 膜孔径 μm) 超滤 ( 膜截留相对分子质量 5000) 处理, 蛋白质总去除率为 60.98% 所得超滤液经高效液相法和氨基酸分析仪分析表明, 粗提物中的杂质除蛋白质小肽外, 氨基酸类杂质主要为谷氨酸, 为 GSH 的进一步精制提供了基础数据关键词 : 酿酒酵母 ; 谷胱甘肽 (GSH); 抽提 ; 微滤 ; 超滤 ; 分析中图分类号 :TS201.2 文献标识码 :A 犃狀犈犳犻犮犻犲狀狋犕犲狋犺狅犱犳狅狉犌犾狌狋犪狋犺犻狅狀犲犈狓狋狉犪犮狋犻狅狀犳狉狅犿犇狉犻犲犱犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犆犲犾狊 YANG Hai lin, ZHANG Yu ran, XIN Yu, TONG Yan jun, ZHANGLing, WANG Wu (KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Aneficientmethodforglutathione(GSH)extractionfromthedriedSacchromycescels wasproposedinthisstudy.duringextractionat (70±1),the mixtureofaceticacid hydrochloricacidwasusedtoadjustedph3.5,theratioofsolidtoliquid(w/v)waskeptat1:8. GSHextractionresultreachedat5.5mg/g,whichwas54.49% 62.24% higherthanthatofal ofthereportedextractionprocess.aftertreatmentthroughmicro filtration( μm)and ultra filtration (5kD MWCO),60.98% oftheyeastproteinwasremoved.thecolectionfrom ultrafiltrationwasanalyzedbyhighperformanceliquidchromatographyandaminoacidanalyzer, theresultshowedthatglutamicacid wasthe majorportioninaminoacidsimpurity besides proteinandsmalpeptideincrudeextract,andthesewouldprovidebasicdataforpurifyinggsh. 犓犲狔狑狅狉犱狊 : 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊,glutathione(GSH),ectraction,micro filtration,ultra filtration, analysis 谷胱甘肽 (GSH) 是一种具有重要生理功能的天然活性三肽 (L γ 谷氨酰 L 半胱氨酰甘氨收稿日期 : 基金项目 :: 江南大学自主科研计划学科交叉创新团队基金项目 ( ) 作者简介 : 杨海麟 (1971-), 男, 江苏无锡人, 工学博士, 副教授主要从事发酵工程研究 @sinan.com 通信作者 : 王武 (1952-), 女, 福建福州人, 教授, 博士生导师, 主要从事发酵工程遗传工程的研究 wangwu@jiangnan.edu.cn

2 896 食品与生物技术学报第 29 卷酸 ) [1], 在空气中易氧化为氧化性谷胱甘肽 (GSSG), 具有抗氧化解毒改善风味等作用, 在临床医药食品行业化妆品行业等领域有着广泛的 [2] 用途, 近期研究发现 GSH 还具有抑制艾滋病的 [3] 作用目前国内的 GSH 整体分离纯化技术较为落后, 致使产品质量在纯度浓度等方面难以不能满足医药和食品行业的要求, 高纯度 GSH 产品大多依靠进口生产出符合食品医药级要求的高纯度 GSH 产品亟待解决 GSH 的生产方法以发酵法为主, 从发酵液中分离提取 GSH 的方法主要有 [4] 铜盐法金属螯合亲和色谱法离子交换树脂分 [5] 离法等, 其中以离子交换树脂分离法最为有效, 生产成本最低, 易于工业化 [6] 在 GSH 的抽提方法中, 陈娜等以面包酵母为原料研究了超声波破碎法,GSH 抽提量为 mg/g, 但细胞破壁后胞内蛋白质色素核酸等杂质大量溶出, 将对后期的膜过滤和树脂分离带来困 [7] 难, 且难以工业化应用 ; 林志兴等以酿酒酵母为原料研究了热水抽提法, 克服了破壁的缺陷,GSH [8] 抽提得率仅为 0.301%; 熊志强等以酿酒酵母为原料研究了乙醇抽提法, 此抽提法蛋白质浸出量更少, 但与热水抽提法所得 GSH 抽提量差别不大, 且抽提时间较长 (60min), 综上所述, 一种高 GSH 抽提量低杂质浸出量的快速节能的抽提方法仍有待于探讨为解决上述问题, 本实验对抽提啤酒酵母 GSH 的方法进行改进, 采用醋酸盐酸调节抽提前 ph, 并对相关条件进行优化发现此改进的方法 GSH 抽提量最高可达 5.50 mg/g, 与以上抽提方法进行实验比较, 其 GSH 抽提量比其它方法提高 54.49%~62.24%, 蛋白浸出量增加不大抽提液经微滤超滤技术处理后, 蛋白质总去除率为 60.98%, 并对超滤液成分和稳定性探讨分析, 为离子交换树脂法 ( 得到高纯度 GSH 最有效节能的方法 ) 精提纯化 GSH 提供有利条件和参考此法 GSH 抽提量高杂质浸出量低快速节能易操作, 可为工业上综合利用废啤酒酵母提取 GSH 提供参考 1 材料与方法 1 1 实验材料市售安琪啤酒干酵母 1 2 主要试剂 GSH 与 GSSG 纯品 : 日本协和公司产品 ;DT NB 试剂 : 上海世泽生物科技有限公司产品,SIG MA 公司分装 ; 乙腈 ( 色谱纯 ): 江苏汉邦科技有限公司生产产品 ; 其它试剂均为化学分析纯 1 3 主要仪器 Agilent 高效液相色谱系统 : 美国安捷伦公司生产 ; 安捷伦氨基酸分析仪 : 美国安捷伦公司生产 ; 3K15 低温高速离心机 : 德国 SIGMA 公司产品 ; 超滤装置 : 中科院上海应用物理所膜分离技术研究发展中心研发 ; 微滤杯 : 天津市津腾实验设备有限公司生产 ;UV754 紫外可见分光光度计 : 上海精密科学仪器有限公司生产 1 4 实验方法 GSH 抽提法 ( 醋酸盐酸调节抽提前 ph) 条件的优化各取 3g 啤酒干酵母, 加入 27 ml 去离子水中, 其中 3 组先加冰醋酸调抽提前 ph3.7, 再加浓盐酸调抽提前 ph 分别为 , 其中 2 组加冰醋酸调抽提前 ph , 其中一组加浓盐酸调抽提前 ph 3.5, 另取一组不加酸调节抽提前 ph 作为对照,84±1 下, 搅拌加热 14min; 各取 10 ml 去离子水, 分别按料液比加入啤酒干酵母, 混匀, 醋酸盐酸 ( 先加冰醋酸调 ph 约 3.7, 再加浓盐酸 ) 调节 ph 为 3.5,61±1 下, 搅拌加热 14 min; 各取 10 ml 去离子水, 加入 1.25g 啤酒干酵母, 混匀, 醋酸盐酸 ( 先加冰醋酸调 ph 约 3.7, 再加浓盐酸 ) 调节 ph 为 3.5, 分别在 5 个不同的温度 (50± 1) (60±1) (70±1) (80±1) (90±1) (94±1) 下, 搅拌加热 14min 以上各组加热搅拌后均置于冰箱中冷却至室温离心 (6000r/min,12 min), 测定不同条件下上清液中 GSH 的浓度几种 GSH 抽提方法的比较参照文献报道方法, 在各自不同最优化的条件下, 把改进的 GSH 抽提法与几种报道的 GSH 抽提方法进行比 [6] 较其中超声波破碎法的输出功率为 800 W, 间隔时间 / 工作时间为 2s/1s, 破壁率为 90.9%; 乙醇 [8] 抽提法中使用的为体积分数 25% 的乙醇 ; 热水抽 [9] 提法抽提后菌液用盐酸调 ph 为 3.00; 以上各方法抽提后的菌液, 均置于冰水浴中冷却至室温, 离心 (6000r/min,12min), 测定上清液体积, 及其中 GSH 和蛋白质浓度抽提液的膜过滤及其超滤液稳定性在真空度为 MPa 下, 取 ph 2.0 的 500 ml 抽提样液, 分别采用含孔径 0.45μm 和 0.22μm 混合纤维素酯微孔滤膜的微滤设备进行分级微滤, 依次测定微滤前后样液中 GSH 和蛋白质含量 ; 取 ph2.0 的 300mL 微滤的样液, 在膜压差 ΔP=0.25 MPa

3 第 6 期杨海麟等 : 啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法 897 下, 采用含截留相对分子质量 5000 聚醚砜超滤膜的超滤设备进行超滤, 测定超滤前后样液中 GSH 和蛋白质含量, 并采用高效液相法 (HPLC) 和氨基酸分析仪分别测定超滤液中 GSH 的纯度及氨基酸的种类含量 ; 取超滤液各 25 ml, 浓盐酸分别调节 ph 为 , 放置于层析柜内 (24±1), 计时, 测定在 min 时超滤样液中 GSH 的浓度 1 5 测定方法 GSH 的含量测定 (DTNB 法 ) 改进的 El [9] man's 测定方法, 试管中共 16mL 反应体系, 含有 0.8mLDTNB 溶液 (4mmol/LDTNB,0.1mol/L Na 2HPO 4 ), 一定体积的 Na 2HPO 4 缓冲液 (0.1mol/ L,pH6.98) 和样品溶液, 漩涡混合器混合后, 室温静置 6 min, 测定 412nm 处样液 OD 值, 根据建立的标准曲线计算测定样品中 GSH 的浓度干酵母总量 (g) 料液比 = 去离子水体积 (ml) 知, 抽提前 ph3.5 时,GSH 抽提量最大, 且离心后抽提液在 ph2.3 和 3.0 时较为浑浊, 杂质较多, 在 ph 为 4.0 和 5.0 时色素相对较深 ; 在抽提前 ph 3.5 下, 醋酸盐酸调节比盐酸调节时,GSH 抽提量提高 15.38%, 这可能是由于醋酸及其盐在 ph3.5 ~5.0 时具有较好的缓冲能力, 使抽提前后菌液 ph 较稳定 ( 仅由 3.5 升至 3.9), 而盐酸调节时菌液 ph 抽提前后波动较大 ( 由 3.5 升至 5.4), 较低且稳定的抽提 ph 有利于 GSH 的释放, 因此选用醋酸盐酸调节抽提前 ph3.5 最佳 GSH 抽提量 = 菌液离心后上清液中 GSH 质量 (mg) 干酵母总量 (g) 菌液离心后上清液中蛋白质质量蛋白质浸出量 = 干酵母总量 (g) GSH 收率 (%)= 膜过滤后溶液中 GSH 质量 (mg) 膜过滤前溶液中 GSH 质量 (mg) GSH 的纯度测定采用高效液相检测法 (HPLC), 色谱条件 : 色谱柱为 AgilentC18 柱 150 mm 4.6mm,5μm ; 流动相为磷酸盐溶液 ( 取磷酸二氢钾 2.72g, 庚烷磺酸钠 1.21g, 加水溶解, 定容至 1L, 磷酸调节 ph 至 2.5) 乙腈 (125 1); 体积流量为 0.7 ml/min; 检测波长 220nm 柱温 25, 进样 10μL 蛋白质含量测定采用 Bradford 检测法, 见参考文献 [11] 氨基酸组成测定采用氨基酸 OPA FMOC 柱前衍生化, 氨基酸分析仪测定, 色谱条件 : 色谱柱为 ODS HYPERSIL250 mm 4.6 mm,5 μm; 流速为 1.0mL/min; 柱温 40 ; 检测波长 338 nm,262nm(pro,hypro) 2 结果与讨论 2 1 犌犛犎抽提法 ( 醋酸盐酸调节抽提前狆犎 ) 条件的优化抽提 ph 对 GSH 抽提量的影响由图 1 可注 :a.ph2.3~5.0 的溶液使用醋酸盐酸调节 ;b. 对照组自然 ph 值为 6.4 图 1 抽提狆犎对犌犛犎抽提量的影响犉犻犵.1 犈犳犲犮狋狅犳狆犎狅狀犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳犌犛犎料液比对 GSH 抽提量的影响由图 2 可知,GSH 抽提量在料液比 1 40 时最大,1 8 时次之前者比后者 GSH 抽提抽高 5.18%, 但使用去离子水的量是后者的 5 倍, 综合生产中减少劳动强度节水节能考虑, 选择料液比 1 8 时较适宜图 2 料液比对犌犛犎抽提量的影响犉犻犵.2 犈犳犲犮狋狅犳狋犺犲狉犪狋犻狅狅犳狊狅犾犻犱狋狅犾犻狇狌犻犱狅狀犌犛犎犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀抽提温度对 GSH 抽提量的影响由图 3

4 898 食品与生物技术学报第 29 卷可知, 随着温度的升高 GSH 抽提量先升高再下降, 其中以 (70±1) 最大温度较低可能会使细胞膜通透性差,GSH 没有更好的从膜内释放, 温度过高可能会导 GSH 的氧化, 因此选择 70±1 为最佳抽提温度 2 2 几种犌犛犎抽提方法的比较由表 1 可知, 超声波破碎法和改进的抽提法 GSH 抽提量最高, 分别为 6.11 和 5.50mg/g, 后者比前者低 9.98%, 但改进的抽提法得到的抽提液蛋白色素等杂质含量也远远低于超声波破碎法, 对下一步的离子交换法精提 GSH 有利 ; 热水抽提法和乙醇抽提法的蛋白浸出量比改进的抽提法少 10.36% 和 14.34%, 但改进的抽提法 GSH 抽提量分别比二者提高 54.49% 和 62.24%, 且抽提温度低料液比相对较大综合考虑, 改进的抽提法 ( 醋酸盐酸调节抽提前 ph) 最佳为使离子交换法更好的精提 GSH, 以下采用膜过滤方法去除离心后抽提液中的菌体蛋白等杂质图 3 抽提温度对犌犛犎抽提量的影响犉犻犵.3 犈犳犲犮狋狅犳犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅狀狋犺犲犌犛犎犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀表 1 几种犌犛犎抽提方法的比较犜犪犫.1 犜犺犲犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狊狅犿犲狋狔狆犲狊狅犳犌犛犎犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狊方法与结果料液比抽提温度 / 抽提时间 /min 抽提前后菌液 ph GSH 抽提质量分数 /(mg/g) 蛋白浸出量 / (g/g) 超声波破碎法 ( 自然 ph)~ 热水抽提法 ( 自然 ph)~ 乙醇抽提法 ( 自然 ph)~ 改进的抽提法 ± ( 醋酸 - 盐酸调 ph)~ 注 :1. 表示超声波破碎后, 胞内物质释放至上清液中, 杂质干扰测定 ;2. 改进的抽提法即上述醋酸盐酸调节抽提前 ph 时的抽提方法 2 3 抽提液的膜过滤及其超滤液稳定性抽提液的膜过滤在上述最优化的抽提条件下,GSH 抽提量最高为 5.5mg/g, 蛋白浸出量为 0.251g/g, 上清液中还带有核酸多糖色素等杂质, 若直接把抽提液上离子换柱进行分离, 会使树脂 GSH 吸附量降低, 也影响 GSH 产品纯度的提高, 以下采用不同孔径的微滤膜和超滤膜对抽提样液处理, 测定滤液中 GSH 和杂蛋白浓度, 计算 GSH 收率和杂蛋白去除率, 结果见表 3 犜犪犫.2 表 2 抽提样液膜过滤结果犜犺犲狉犲狊狌犾狋狊狅犳犿犲犿犫狉犪狀犲犳犻犾狋狉犪狋犻狅狀犪犫狅狌狋犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狊狅犾狌狋犻狅狀过膜步骤 GSH 收率 / % 蛋白质去除率 / % GSH 总收率 / % 蛋白质总去除率 /% 0.45μm 膜微滤 μm 膜微滤 kD 膜超滤由表 2 可知, 经过膜过滤后, 杂蛋白已被大量去除, 超滤液中蛋白质含量为 0.098g/g, 且离心后残留的菌体色素减少, 溶液变澄清, 这将提高离子交换树脂的利用率以下为对超滤液中进行高效液相分析的图谱 ( 见图 4) 由图 4 可知, 超滤后样液中 GSH 在 9.949min 处出峰, 由于样液中存在色素蛋白和其他小分子杂质, 从图谱来看 GSH 纯度不高, 若要得到高纯度的 GSH 纯品, 后续的离子交换层析很有必要的由于膜过滤技术, 已去除了大部分杂蛋白, 滤液中的氨基酸的成分含量有可能成为 GSH 分离时的主要干扰物质, 以下为超滤后样液中氨基酸的分析图谱结果由图 5 表 3 可知, 超滤液中谷氨酸的质量浓度最高 (2.287g/L), 比滤液中 GSH 含量 (DTNB 法测定为 0.653g/L) 的 3.5 倍, 成为影响 GSH 纯度的主要小分子物质, 后续离子交换层析条件的摸索应主要以分离氨基酸 ( 谷氨酸为主 ) 和 GSH 为指标

5 第 6 期杨海麟等 : 啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法 899 进行探讨超滤液 GSH 稳定性把超滤后的样液上离子交换柱, 从开始上样到最后洗涤去杂, 需要一段时间, 而 ph 对 GSH 稳定性具有很大影响, 以下测定了不同 ph 条件下, 不同时间处超滤样液中 GSH 的浓度, 计算氧化率, 结果见图 6 图 6 不同时间时狆犎对超滤液中犌犛犎稳定性的影响犉犻犵.6 犈犳犲犮狋狊狅犳狋犻犿犲犪狀犱狆犎狅狀狋犺犲犌犛犎狊狋犪犫犻犾犻狋狔注 :A 图为 GSH 纯品的 HPLC 图谱,B 图为超滤后样液的 HPLC 图谱图 4 超滤后样液的犎犘犔犆图谱犉犻犵.4 犎犘犔犆犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪犿狅犳狊狅犾狌狋犻狅狀犪犳狋犲狉狌犾狋狉犪犳犻犾狋狉犪狋犻狅狀图 5 超滤后样液中氨基酸组分分析犉犻犵.5 犃犿犻狀狅犪犮犻犱犪狀犪犾狔狊犻狊犪犫狅狌狋狋犺犲狊狅犾狌狋犻狅狀狌犾狋狉犪犳犻犾狋狉犪狋犻狅狀表 3 超滤后样液中氨基酸组分分析犜犪犫.3 犃犿犻狀狅犪犮犻犱犪狀犪犾狔狊犻狊犪犫狅狌狋狊狅犾狌狋犻狅狀狌犾狋狉犪犳犻犾狋狉犪狋犻狅狀氨基酸名称质量浓度 / (g/l) 氨基酸名称质量浓度 / (g/l) 谷氨酸苯丙氨酸脯氨酸异亮氨酸丙氨酸酪氨酸缬氨酸苏氨酸精氨酸丝氨酸亮氨酸甘氨酸天冬氨酸甲硫氨酸赖氨酸组氨酸由图 6 可知,pH 越低, 超滤液中 GSH 稳定性越好, 在 ph 2.0 时,180 min 后 GSH 总氧化率为 2.57%, 因此在对 GSH 上柱的过程中, 条件允许的范围内, 控制 ph 较低为好 3 结语用醋酸盐酸调节抽提 ph 时, 在 ph3.5 料液比 1 8 抽提温度 (70±1) 抽提 14min 的最佳条件下,GSH 的抽提量可达 5.50 mg/g, 虽比超声波破碎法低 9.98%, 但此法没有破壁, 杂质浸出量小, 能耗小, 且相对于其它方法 GSH 抽提量提高了 54.49%~62.24%, 抽提温度低, 料液比大综合考虑, 此法 GSH 抽提量高杂质浸出量低快速节能易操作, 可为工业上综合利用废啤酒酵母提取 GSH 提供参考热水抽提的样液离心后, 仍有大量菌体和杂蛋白, 如果直接超滤会导致超滤速度减慢,GSH 氧化加剧, 如果不经微滤超滤直接上离子交换柱进行分离, 也会使树脂利用率降低, 分离度减小为解决以上问题, 对离心的样液先进行孔径为 μm 的膜过滤后, 再在膜压差 Δ 犘 =0.25 MPa ph 2.0 条件下, 进行截留分子量 5kD 的聚醚砜超滤膜处理, 得到的滤液 GSH 总回收率为 76%, 蛋白去除率 60.98%, 缩短了超滤时间, 也将提高离子交换树脂的利用率通过高效液相检测法分析了超滤液中的成分, 图谱表明, 超滤液中存在一种和 GSH 特性相近的

6 900 食品与生物技术学报第 29 卷物质, 且 GSH 纯度不高 ; 利用氨基酸分析仪检测出超滤液中杂氨基酸的含量, 其中以谷氨酸含量最高, 为主要的干扰杂质, 以上数据为离子交换树脂法 ( 得到高纯度 GSH 最有效节能的方法 ) 精提纯化 GSH 提供有利条件和参考参考文献 (References): [1]MeisterA,Anderson M E.Glutathione[J]. 犃狀狀狌犪犾犚犲狏犻犲狑狅犳犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔,1983,52: [2]IzawaS,InoueY,KimuraA.Oxidativestressrespnseinyeast efectofglutathioneonadaptationtohydrogen peroxide stressin 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犆犲狉犲狏犻狊犻犪犲 [J]. 犉犲犫狊犔犲狋犲狉狊,1995,368(1): [3] 刘振玉. 谷胱甘肽的研究与应用 [J]. 生命的化学,1995,15(1): LIUZhen yu.studyandapplicationofglutathione[j]. 犔犻犳犲犆犺犲犿犻狊狋狉狔,1995,15(1):19-21.(inChinese) [4] 王辉, 冯万祥. 含汞树脂分离提纯谷胱甘肽 [J]. 华东理工大学学报,1996,22(6): WANG Hui,FENG Wan xiang.purificationofglutathionebyorganomercurialresin[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犈犪狊狋犆犺犻狀犪犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔,1996,22(6): (inChinese) [5]MakiH,FukudaH.Theseparationofglutathioneandglutamicacidusingasimulatedmoving bedabsorbersystem[j]. 犉犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔,1987,65(1): [6] 陈娜, 乔长晟, 胡玉霞, 等. 面包酵母中谷胱甘肽抽提方法的研究 [J]. 现代食品科技,2008,24(2): CHEN Na,QIAO Chang sheng,hu Yu xia,etal.methodsforextracting GSHfrom 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犆犲狉犲狏犻狊犻犪犲 [J]. 犕狅犱犲狉狀犉狅狅犱犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔,2008,24(2): (inChinese) [7] 林志兴, 吕永琴, 丁轲, 等. 从酿酒酵母中分离纯化谷胱甘肽 [J]. 生物加工过程,2007,5(04): LINZhi xing,lv Yong qin,ding Ke,etal.Separationandpurificationofglutathionefrom 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犆犲狉犲狏犻狊犻犪犲 [J]. 犆犺犻狀犲狊犲犑狅狌狉狀犪犾狅犳犅犻狅狆狉狅犮犲狊犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵,2007,5(04):60-64.(inChinese) [8]XiongZhi Qiang,Guo Mei Jin,GuoYuan Xin,Eficientextractionofintracelularreducedglutathionefromfermentation brothof 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犆犲狉犲狏犻狊犻犪犲 byethanol[j]. 犅犻狅狉犲狊狅狌狉犮犲犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔,2009,100(2): [9]ElmanGL.Acalorimetricmethodfordetermininglowconcentrationsofmercaptans[J]. 犃狉犮犺犻狏犲狊狅犳犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔犪狀犱犅犻狅狆犺狔狊犻犮狊,1958,74(2): [10]Bradford M,MarionM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquangtitiesofproteinutilizingthe principleofprotein dyebinding[j]. 犃狀犪犾狔狋犻犮犪犾犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔,1976,72: ( 责任编辑 : 杨萌 )

7 第 6 期杨海麟等 : 啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法 901

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