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1 2014 年 5 月 Vol.32 No.5 May 2014 Chinese Journal of Chromatography 519 ~ 523 技术与应用 DOI: / SP.J 高效液相色谱串联质谱法检测牛奶中头孢洛宁残留李帅鹏 1, 郭春娜 1, 孟蕾 2 1, 黄显会 (1. 华南农业大学国家兽药残留基准实验室, 广东广州 ; 2. 河南省兽药监察所, 河南郑州 ) 摘要 : 建立了牛奶中头孢洛宁残留检测的高效液相色谱串联质谱方法 1 g 牛奶经乙腈沉淀蛋白质后, 上清液于 37 水浴下氮气吹干, 用 1 ml 甲醇 0 1 甲酸水溶液 (3 7, v / v) 复溶, 正己烷除脂净化后检测流动相为乙腈和 0 1 甲酸水溶液, 梯度洗脱, 经 C 18 色谱柱分离, 采用多反应监测正离子模式对头孢洛宁进行定性定量分析采用基质匹配法对牛奶中头孢洛宁的含量进行标准校正, 在 2~ 200 μg / L 范围内, 头孢洛宁质量浓度与其对应峰面积的线性关系良好, 相关系数 >0 999 牛奶中加标样品的检出限 ( 按 S / N 3 计 ) 为 0 5 μg / kg, 定量限 (S / N 10 计 ) 为 2 μg / kg 在定量限 1 / 2 最高残留限量最高残留限量 2 倍最高残留限量添加水平下, 牛奶中头孢洛宁的平均回收率为 78 5 ~ 86 2, 日内相对标准偏差为 1 5 ~ 6 2, 日间相对标准偏差为 2 9 ~ 5 6 该方法可用于牛奶中头孢洛宁的残留检测关键词 : 高效液相色谱 ; 串联质谱 ; 头孢洛宁 ; 牛奶 ; 残留中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2014) Determination of cefalonium residue in milk by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry LI Shuaipeng 1, GUO Chunna 1, MENG Lei 2, HUANG Xianhui 1 (1. National Reference Laboratory of Veterinary Drug Residues, South China Agricultural University, Guangzhou , China; 2. Henan Institute of Veterinary Drug Control, Zhengzhou , China) Abstract: An analytical method was developed for the determination of cefalonium in milk by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( HPLC MS / MS). A total of 1 g milk was deproteinized by acetonitrile. The supernatant was transferred into a test tube to be blown dry with N 2 at 37. Then the residue was dissolved with methanol 0 1 formic acid in water (3 7, v / v). The sample was determined by HPLC MS / MS after the purification. The chromatographic separation was achieved on a C 18 column using 0 1 formic acid in water and acetonitrile as mobile phases with gradient elution. Qualitative and quantitative analyses were achieved by HPLC MS / MS under positive ionization and multiple reaction monitoring ( MRM) mode. Matrix matched calibration curve was used for the quantification. Good correlation coef ficients were obtained (r>0 999) in the mass concentration range of μg / L. The limit of detection (LOD, S / N 3) was 0 5 μg / kg in milk, and the limit of quantification (LOQ, S / N 10) was 2 μg / kg. The mean recoveries at the four levels of LOQ, 1 / 2MRL (maximum residue level), MRL, 2MRL were between 78 5 and 86 2, with the intra day relative standard devi ations (RSDs)of 1 5 to 6 2 and inter day RSDs of 2 9 to 5 6. In conclusion, the estab lished method can be applied for the determination of cefalonium residue in milk. Key words: high performance liquid chromatography ( HPLC); tandem mass spectrometry (MS / MS); cefalonium; milk; residue 头孢洛宁 ( cefalonium ) 是美国先灵葆雅 (Schering Plough) 制药公司在英联邦国家内开发的奶牛枯奶期针对乳房炎的预防性用药, 是全球 3 个指定的动物专用头孢类抗生素之一, 属于第二代通讯联系人.E mail:xhhuang@ scau.edu.cn. 基金项目 : 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( ). 收稿日期 :

2 520 色谱第 32 卷头孢类抗生素 [1] 头孢洛宁对酸和 β 内酰胺酶稳定, 杀菌力强, 抗菌谱广, 对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有效 ; 尤其对引起奶牛乳房炎的大多数病原菌有效, 主要用于细菌感染引起的奶牛乳房炎的防治 [2-4] 目前该药只在日本新西兰澳大利亚欧盟和英联邦国家范围内使用, 美国加拿大等市场未使用该药, 我国也未见进口或开发报道头孢菌素类抗生素的过量使用具有毒副作用, 主要体现在对脑神经听觉以及肾脏的损害 [5], 对人体健康造成危害因此, 世界各国对动物源性食品中的头孢洛宁残留量均提出了限量要求, 欧盟规定牛奶中头孢洛宁的最高残留限量 ( MRL) 为 10 μg / kg [6], 日本肯定列表规定牛组织和牛奶中头孢洛宁的最高残留限量均为 10 μg / kg [7] 国外头孢洛宁乳房注入剂 (Cepravin Dry Cow 250 mg Intramammary suspension (Dry Cow)) 已上市使用多年, 但有关牛奶中头孢洛宁残留检测方法的报道较少, 主要有微生物法 [8] 酶联免疫分析 [9,10] 法和高效液相色谱串联质谱法 [11,12] 牛奶中头孢洛宁的 MRL 为 10 μg / kg, 且牛奶中干扰基质较多,HPLC 法不能满足残留检测的要求本研究采用高效液相色谱串联质谱法 ( HPLC MS / MS) 分析牛奶中头孢洛宁残留, 并进行了方法学评价 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 API 4000 电喷雾串联四极杆质谱仪, 配 Ana lyst 软件 ( 美国应用生物系统公司 ); Agilent 1200 型液相色谱仪 ( 美国安捷伦公司 ); B 260 型恒温水浴锅 ( 上海雅荣生化仪器设备有限公司 ); Milli Q 纯水机 ( 美国 Millipore 公司 ); Mach1 6 R 冷冻型离心机 ( 美国 Thermo 公司 ) 头孢洛宁标准物质 : 产品编号 32904, CAS 号 , 由美国 Sigma 公司提供 ; 正己烷为国产分析纯 ; 甲醇乙腈甲酸均为色谱纯 ( 美国 Fisher 公司 ) 1.2 溶液的配制头孢洛宁标准储备液 (500 mg / L): 准确称取头孢洛宁标准物质 5 00 mg, 置于 10 ml 容量瓶中, 用 30 (v / v) 乙腈水溶液溶解并定容至刻度, 配成 500 mg / L 标准溶液, 于 4 冰箱中避光保存临用前用甲醇 0 1 甲酸水溶液 (3 7, v / v) 稀释成头孢洛宁系列标准工作液, 现用现配 0 1 甲酸水溶液 : 取 1 ml 甲酸, 置于 ml 容量瓶内, 用超纯水定容至刻度, 超声后使用甲醇 0 1 甲酸水溶液 (3 7, v / v): 取 30 ml 甲醇与 70 ml 0 1 甲酸水混匀即得 1.3 样品前处理准确称取 (1 00±0 01) g 牛奶置于 15 ml 离心管中加入 5 ml 乙腈, 涡旋 1 min, 置于振荡器上以 300 r / min 振荡 10 min, 在 4 条件下, 以 r / min 离心 10 min 转移上清液至 10 ml 试管中, 在 37 水浴中氮气吹干, 加入 1 ml 甲醇 0 1 甲酸水溶液 (3 7, v / v) 复溶, 涡旋 1 min, 溶液转移至 2 ml 离心管中, 加入 0 8 ml 正己烷除脂, 涡旋 1 min, 在 4 下 r / min 离心 10 min, 弃去正己烷, 过 0 22 μm 有机相针式过滤器至 2 ml 棕色进样瓶中,LC MS / MS 分析 1.4 色谱质谱条件色谱条件色谱柱 : 美国 Penomenex Luna C 18 (150 mm 2.1 mm, 3 5 μm); 流动相 : 乙腈 (A), 0 1 甲酸水溶液 ( B) 梯度洗脱程序 :0 0 ~ 0 5 min, 10 B; 0 5 ~ 1 min, 10 B ~ 95 B; 1 ~ 4 min, 95 B; 4 ~ 4 5 min, 95 B ~ 10 B; 4 5 ~ 10 min, 10 B 流速 :0 25 ml / min; 柱温 :35 ; 进样量 :5 μl 质谱条件用多反应监测 (MRM) 扫描模式 ; 电喷雾离子源 (ESI); 正离子扫描 ; 电喷雾电压 4 kv; 离子源温度 600 ; 辅助气压力 35 kpa; 雾化气压力 55 kpa; 气帘气压力 15 kpa 头孢洛宁的 MRM 质谱检测参数 : 选择离子对 m / z / 337 3, / 152 3, 其中定量离子对为 m / z / 337 3; 碰撞能量 (CE) 14 ev; 去簇电压 (DP)70 V; 碰撞室射出电压 (CXP) 10 V, 射入电压 (EP)10 V 2 结果与讨论 2.1 质谱参数的确定头孢洛宁标准溶液 (1 mg / L) 分别在正离子和负离子模式下全扫描, 发现头孢洛宁在正离子模式下的响应值更高头孢洛宁标准溶液 (1 mg / L) 在正离子模式下全扫描, 得到 [ M+H] + ( m / z 459 4) 准分子离子峰对 m / z 进行二级质谱全扫描, 得到头孢洛宁二级全扫描质谱图 ( 见图 1) 结 [13] 合头孢菌素质子化离子的一般断裂规律可知, 头孢洛宁的质谱行为较简单, 主要为 R2 断裂 ( 见图 2) 得到的 m / z 和 337 3; C ( 6) C ( 7) 键及 C(7) C(8) 键断裂导致 β 内酰胺环开环得到的 m / z 和 309 3; 而 m / z 进一步裂解又可得到 m / z 其中 m / z 和的强度相对较大, 干扰较小, 故选择 m / z 作为定量离子,

3 第 5 期李帅鹏, 等 : 高效液相色谱串联质谱法检测牛奶中头孢洛宁残留 521 图 1 头孢洛宁的二级质谱图 Fig. 1 MS / MS spectrum of cefalonium Fig. 2 图 2 头孢洛宁的结构式 Chemical structure of cefalonium m / z 为辅助定性离子 2.2 色谱条件的优化头孢洛宁属于 β 内酰胺酶类抗生素, 结构式中既有游离羧基, 又带有氨基, 为两性物质, 极性小 [14] 所选色谱柱的填料应为直链烷烃键合的硅胶, 其中最常见的为十八烷基键合硅胶 ( 即 C 18 ) 研究对比了 Phenomenex Luna C 18 (150 mm 2 1 mm, 3 5 μm) 和 Waters C 18 (150 mm 2 1 mm, 5 μm) 色谱柱两种色谱柱对头孢洛宁均有良好的保留, 头孢洛宁均可得到优异的峰形综合考虑, 本文选择 Phenomenex Luna C 18 (150 mm 2 1 mm, 3 5 μm) 色谱柱为了改善峰形及提高分离度, 增强目标物在反相色谱柱上的保留, 经常在流动相溶液中添加甲酸乙酸等酸性物质或者甲酸铵乙酸铵 [15] 等缓冲盐在水相中添加 0 1 的甲酸及对流动相条件的调整能使头孢洛宁在色谱柱上较好的保留 ( 保留时间在 6 1 min 左右 ), 响应值高, 峰形优良 2.3 样品前处理方法的优化样品前处理方法的考察有关牛奶中头孢洛宁残留检测方法报道的文献资料中, 有的采用离心的方法预先除去脂肪 [11], 有的采用乙腈沉淀蛋白 [16], 有的添加 ph 8 5 磷酸盐 [12] 缓冲液稀释牛奶然后过固相萃取 (SPE) 柱净化文献报道的样品前处理方法中, 大部分都包含了操作繁琐的 SPE 净化步骤, 成本较高国家标准方 [16] 法称取 5 g 牛奶, 最后定容至 2 ml, 浓缩了约 2 5 倍,SPE 柱净化后样品足够干净本方法称取 1 g 牛奶, 最后定容至 1 ml, 正己烷除脂后, 采用空白 [17] 基质匹配标准溶液法进行校准, 检测结果显示样品同样足够干净而本试验无需 SPE 柱净化, 成本较低, 简便易行, 效率高, 定量限为 2 μg / kg, 灵敏度更高提取液及浓缩条件的选择牛奶中蛋白质较多, 本试验比较了乙腈甲醇和乙醇沉淀蛋白的效果, 结果发现乙腈的沉淀效果更好, 头孢洛宁的回收率较高, 在 75 以上 ; 甲醇和乙醇沉淀蛋白效果不如乙腈, 且回收率也相对低些 ( 约 60), 所以最后选用乙腈作为蛋白沉淀剂考察了沉淀 1 g 牛奶中蛋白质所需要的乙腈的体积, 尝试过 ml 4 ml 时提取不充分, 回收率约 65; 5 ml 时回收率为 75 ~ 85; 连续增加乙腈体积至 10 ml, 回收率几乎没有提高为了节约试剂及提高方法的简便性, 最终确定采用 5 ml 乙腈进行提取氮气流吹干浓缩时考察了温度分别为时对头孢洛宁的影响结果表明 30 下浓缩效率低, 单个样品吹干所需时间为 1 2 h, 回收率为 74 ~ 80; 40 下浓缩效率高, 但头孢洛宁有所降解, 回收率只有 58 ~ 65; 在 37 时浓缩效率较高, 单个样品吹干所需时间为 40 min, 且头孢洛宁降解不明显, 回收率为 75 ~ 87 在浓缩吹干后, 加入 1 ml 甲醇 0 1 甲酸水溶液 (3 7, v / v) 复溶, 加入正己烷进一步除去脂溶性杂质, 低温高速离心后过 0 22 μm 滤膜可保证样品足够干净 2.4 标准曲线和线性范围准确称取 1 g 空白牛奶 7 份分别置于 15 ml 离心管中, 按 1 3 节方法处理样品, 用所得空白基质液分别配制头孢洛宁标准工作液 ( μg / L), 用 HPLC MS / MS 进行检测每一水平设 5 个平行样品同日检测, 连续测定 5 日以头孢洛宁峰面积平均值为纵坐标 ( Y), 质量浓度为横坐标 ( X,μg / L) 绘制标准曲线, 求得牛奶中头孢洛宁的回归方程 Y = X , 相关系数 r = 检出限和定量限准确称取空白牛奶 1 g, 依次加入不同质量浓度 ( μg / L) 的头孢洛宁标准工作液 100 μl, 涡旋混匀, 使得样品中头孢洛宁的添加浓度分别为 μg / kg, 按 1 3 节方法处理样品以 S / N 3 确定检出限 (LOD), 以 S / N 10 确定定量限 (LOQ) 牛奶中头孢洛宁的检出限为 0 5 μg / kg, 定量限为 2 μg / kg

4 522 色谱第 32 卷 2.6 回收率和精密度的测定回收率和精密度采用在空白牛奶中添加标准溶液的方法进行检测其 MRM 谱图见图 3 和图 4 根据残留限量要求及欧盟对头孢洛宁设置的 MRL, 在 LOQ 1 / 2MRL MRL 2MRL 4 个添加水平,1 g 空白牛奶中分别添加 μg / L 的头孢洛宁标准工作液 100 μl, 即牛奶中添加浓度为 μg / kg, 旋涡混匀, 按 1 3 节方法处理样品, 每一水平设 5 个平行样品同日检测, 连续测定 5 日求得空白牛奶中添加头孢洛宁回收率的平均值 (X) 和标准差 ( SD), 同时计算日内和日间相对标准偏差结果表明, 头孢洛宁在牛奶中的平均回收率介于 78 5 ~ 86 2 之间, 日内相对标准偏差为 1 5 ~ 6 2, 日间相对准偏差为 2 9 ~ 5 6 ( 见表 1) 图 3 空白牛奶的 MRM 谱图 Fig. 3 MRM chromatogram of a blank milk sample 表 1 牛奶中头孢洛宁的加标回收率及相对标准偏差 (n = 5) Table 1 Recoveries and relative standard deviations (RSDs)of cefalonium spiked in milk (n = 5) Spiked / (μg / kg) Recovery / Intra day RSD / Inter day RSD / ± ± ± ± 头孢洛宁稳定性良好 2.8 基质效应的消除样品基质溶液对待测物的电喷雾离子化影响较大, 可抑制或增强信号响应, 导致检测结果的准确度与精密度降低本试验通过在空白牛奶基质提取液中添加低中高 3 个浓度即 μg / L 的头孢洛宁标准溶液, 与纯溶剂中的信号强度进行比较, 牛奶基质峰面积与纯溶剂的峰面积比值分别为 64 ~ ~ ~ 86, 说明牛奶基质对头孢洛宁检测有抑制效应为消除样品基质效应的影响, 采用空白基质匹配标准溶液法进行校准 2.9 抽样检测从不同市场购买新鲜牛奶 10 份, 从超市购买国产蒙牛伊利品牌盒装牛奶各 10 份, 以及新西兰澳大利亚进口盒装牛奶各 10 份, 每份 100 ml, 共 50 份样品, 按本方法进行样品前处理和检测结果显示, 所有国产样品均未检测出头孢洛宁残留, 有 1 份新西兰进口样品检测出 8 0 μg / kg 头孢洛宁残留这是因为头孢洛宁在国内尚未批准使用, 有关头孢洛宁防治奶牛乳房炎的制剂还处于研发阶段, 尚未投入生产上述结果表明该方法可用于检测牛奶中头孢洛宁的残留量 3 结论图 4 Fig 稳定性空白牛奶添加 2 μg / kg 头孢洛宁的 MRM 谱图 MRM chromatogram of a blank milk sample spiked with cefalonium at 2 μg / kg 取 20 份空白牛奶, 添加 MRL 水平的头孢洛宁标准溶液, 按 1 3 节方法处理样品, 用 HPLC MS / MS 进行检测, 记录其峰面积 ; 于室温条件下放置 24 h 后重新检测, 比较两次峰面积的变化结果显示, 牛奶样品中头孢洛宁的峰面积变化在 ~ 3 80 之间, 说明样品在室温条件下放置 24h 内, 本文建立了 HPLC MS / MS 测定牛奶中头孢洛宁残留量的分析方法样品经乙腈提取, 氮气吹干后用甲醇 0 1 甲酸水溶液 (3 7, v / v) 复溶, 正己烷去除脂肪后, 经 HPLC MS / MS 分析本方法前处理操作简便易行, 不需要 SPE 柱净化, 所需试剂较少, 成本较低, 且精密度和重复性好, 灵敏度高, 定量限低于欧盟对牛奶中头孢洛宁制定的最高残留限量, 适用于牛奶中头孢洛宁的残留检测参考文献 : [1] Cephalonium ( 头孢洛宁 ). [ ]. http: // www. bi omart.cn / infosupply / htm [2] Bryan M A, Heuer C, Emslie F R. New Zeal Vet J, 2011, 59 (4): 166

5 第 5 期李帅鹏, 等 : 高效液相色谱串联质谱法检测牛奶中头孢洛宁残留 523 [3] Shephard R W, Burman S, Marcun P. Aust Vet J, 2004, 82 (10): 624 [4] McDougall S. New Zeal Vet J, 2010, 58(1): 45 [5] Bai G T, Chu X G, Pan G Q, et al. Chinese Journal of Chro matography ( 白国涛, 储晓刚, 潘国卿, 等. 色谱 ), 2009, 27 (4): 417 [6] Cefalonium Summary Report (2). Committee for Veterinary Medicinal Products. [ ]. http: // eu / docs / en / 2009 / 11 / WC pdf [7] National Food Safety Resource Database ( 中国食品安全资源数据库 ). ( ). http: // / Index.asp [8] Kantiani L, Farre M, Barcelo D. TrAC Trend Anal Chem, 2009, 28(6): 729 [9] Beltrán M C, Romero T, Althaus R L, et al. J Dairy Sci, 2013, 96(5): 2737 [10] Bremus A, Dietrich R, Dettmar L, et al. Anal Bioanal Chem, 2012, 403(2): 503 [11] Hou X L, Wu Y L, Lv Y, et al. J Chromatogr B, 2013, 931 (15): 6 [12] Becker M, Zittlau E, Petz M. Anal Chim Acta, 2004, 520 (1 / 2): 19 [13] Ye X M, Cao X J, Ma Y P, et al. Journal of Instrumental Analysis ( 叶学敏, 曹小吉, 马永萍, 等. 分析测试学报 ), 2010, 29(12): 1135 [14] Guo C N. [ MS Dissertation ]. Guangzhou: South China Agricultural University ( 郭春娜. [ 硕士学位论文 ]. 广州 : 华南农业大学 ), 2009 [15] Yang G, Huang X H, Guo C N, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 杨刚, 黄显会, 郭春娜, 等. 色谱 ), 2012, 30(6): 568 [16] GB / T [17] He L M, Liu X G, Zeng Z L. Chinese Journal of Chromatog raphy ( 贺利民, 刘祥国, 曾振灵. 色谱 ), 2008, 26(1): 98

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI