2007 Waters Corporation. Waters and The Science of What s Possible are trademarks of Waters Corporation. [ 公 司 动 态 ]

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1 液 相 色 谱 [ 第 45 期 ] 公 司 动 态 应 用 报 告 经 验 交 流 色 谱 分 离 专 栏 实 验 室 数 据 管 理 系 统 专 栏 新 技 术 新 产 品 质 谱 通 讯

2 2007 Waters Corporation. Waters and The Science of What s Possible are trademarks of Waters Corporation. [ 公 司 动 态 ]

3 [ 公 司 动 态 ] 重 新 变 革 药 物 发 现 过 程 Medivir 公 司 选 择 沃 特 世 Synapt High Def nition MS (HDMS) 质 谱 系 统 促 进 决 策 制 定 总 部 设 在 瑞 典 的 生 物 技 术 公 司 Medivir 公 司 选 择 了 沃 特 世 Synapt HDMS 系 统 加 强 其 蛋 白 酶 抑 制 剂 领 域 的 药 物 发 现 研 究 能 力, 最 终 有 助 于 治 疗 疱 疹 病 人, 丙 型 肝 炎 病 人, 艾 滋 病 病 毒 携 带 者, 骨 质 疏 松 症, 关 节 炎 和 高 血 压 患 者 Synapt High Definition Mass Spectrometry (HDMS) 质 谱 系 统 自 今 年 6 月 安 装 以 来, 已 经 获 得 大 量 有 意 义 的 信 息, 协 助 决 策 制 定 并 帮 助 Medivir 公 司 达 到 药 物 发 现 领 域 新 的 里 程 碑 Medivir 公 司 一 直 在 寻 找 在 质 和 量 两 方 面 改 进 研 究 成 效 的 机 会 这 项 采 购 沃 特 世 Synapt HDMS 质 谱 系 统 的 投 资 被 认 为 是 提 高 研 究 成 果 为 药 物 发 现 原 理 提 供 高 质 量 技 术 支 持 的 重 要 手 段, 药 物 发 现 研 究 副 总 裁 Bertil Samuellson 说 在 帮 助 Medivir 公 司 提 高 研 究 水 平 方 面,Synapt HDMS 系 统 拥 有 极 大 的 潜 力 该 仪 器 的 灵 敏 度 显 著 高 于 Q-TOF 的 水 平, 为 我 们 带 来 更 完 全 的 代 谢 物 分 析 数 据 分 析 化 学 部 高 级 研 究 科 学 家 Kurt Benkestock 谈 到 他 参 与 Medivir 公 司 的 许 多 研 究 项 目 有 一 段 时 间, 我 们 依 赖 外 部 资 源 为 我 们 提 供 所 需 信 息 现 在 拥 有 Synapt HDMS 系 统, 我 们 能 够 在 自 己 的 实 验 室 内 采 集 数 据, 更 快 地 使 候 选 药 物 进 入 开 发 阶 段 在 评 价 了 所 有 可 能 性 技 术 之 后,Medivir 公 司 选 择 了 沃 特 世 Synapt HDMS 质 谱 系 统 连 接 沃 特 世 ACQUITY UltraPerformance LC (UPLC ) 超 高 效 液 相 色 谱 系 统, 而 不 是 其 它 机 型, 如 OrbiTrap 我 们 选 择 沃 特 世 Synapt 质 谱 系 统 的 原 因 是 该 仪 器 在 二 十 二 项 评 估 准 则 中 胜 出 其 它 仪 器 Benkestock 说 选 型 过 程 中 的 其 它 无 形 方 面 也 很 重 要 沃 特 世 公 司 乐 意 倾 听 客 户 的 意 见, 理 解 他 们 的 要 求, 增 加 功 能 和 改 进 仪 器 帮 助 我 们 达 到 科 学 要 求 Benkestock 补 充 道 Benkestock 对 Synapt HDMS 质 谱 系 统 的 计 划 非 常 深 远, 包 括 代 谢 物 和 杂 质 结 构 解 析, 早 期 药 物 发 现 的 配 体 筛 选, 蛋 白 和 肽 的 研 究 工 作, 蛋 白 鉴 定, 翻 译 后 修 饰 研 究 和 药 靶 分 析 Medivir 公 司 在 10 月 25 日 ( 星 期 四 ), 公 司 总 部 举 行 的 一 个 庆 典 活 动 上, 让 百 名 员 工 更 好 地 目 睹 了 Synapt HDMS 质 谱 系 统 沃 特 世 公 司 于 2006 年 6 月 在 西 雅 图 美 国 质 谱 年 会 上 推 出 Synapt HDMS 质 谱 系 统 它 是 第 一 台 商 业 化 新 型 质 谱 系 统, 除 了 质 量 之 外, 还 可 分 析 离 子 的 大 小, 形 状 和 电 荷 HDMS 其 它 用 户 包 括 英 国 剑 桥 大 学, 牛 津 大 学, 荷 兰 Utrecht 大 学, 英 国 利 兹 大 学, 德 国 Max Planck Institute( 马 普 研 究 院 ) 和 英 国 Warwick 大 学 欲 获 取 更 多 信 息, 请 浏 览 沃 特 世 公 司 网 站 : 关 于 Medivir 公 司 ( Medivir 公 司 致 力 于 开 发 蛋 白 酶 抑 制 剂, 用 于 创 新 药 物, 针 对 主 要 大 病 种, 并 改 善 数 种 疾 病 人 群 的 生 活 质 量 Medivir 公 司 与 几 家 制 药 公 司 形 成 合 作 伙 伴, 拥 有 一 项 三 期 临 床 测 试 药 物, 三 项 二 期 临 床 和 一 项 一 期 临 床 药 物 其 它 蛋 白 酶 研 究 项 目 发 展 到 预 临 床 阶 段 的 后 期 沃 特 世 Synapt HDMS 质 谱 分 析 系 统 01

4 [ 公 司 动 态 ] 2007 沃 特 世 亚 太 区 纯 化 论 坛 2007 沃 特 世 亚 太 区 纯 化 论 坛 合 影 2007 沃 特 世 亚 太 区 纯 化 论 坛 (Waters Purif cation Forum) 于 2007 年 10 月 31 日 至 11 月 3 日 在 上 海 召 开, 会 议 邀 清 了 来 自 中 国 大 陆, 香 港, 台 湾 韩 国 以 及 马 来 西 亚 的 近 50 位 纯 化 用 户 参 会 此 次 论 坛 旨 在 为 亚 太 区 纯 化 用 户 以 及 对 纯 化 系 统 感 兴 趣 的 客 户 建 立 一 个 自 由 开 放 的 平 台, 就 纯 化 方 面 的 应 用 技 术 及 经 验 进 行 交 流, 从 而 更 好 的 帮 助 用 户 进 行 日 常 的 研 究 工 作, 同 时 也 推 介 了 沃 特 世 前 沿 的 新 产 品 和 新 技 术 会 议 特 别 邀 请 了 沃 特 世 的 纯 化 用 户 来 自 罗 氏 中 国 研 发 中 心 的 李 永 国 博 士 以 及 来 自 沈 阳 药 科 大 学 的 张 宇 博 士 分 别 介 绍 了 自 动 纯 化 系 统 在 药 物 研 发 以 及 中 药 成 分 分 析 分 离 中 的 重 要 应 用 同 时 来 自 沃 特 世 公 司 的 纯 化 专 家 Ronan CLEARY 先 生 为 大 家 介 绍 了 沃 特 世 公 司 纯 化 领 域 的 新 技 术 新 进 展 以 及 非 常 丰 富 的 海 外 用 户 经 验 另 外 来 自 沃 特 世 公 司 的 Kenneth NG 先 生 以 及 宋 兰 坤 女 士 也 分 别 就 实 验 室 数 据 管 理 以 及 与 纯 化 色 谱 柱 技 术 方 面 做 了 相 关 报 告 Charles SUN 先 生, 向 用 户 介 绍 如 何 应 用 Millipore 技 术 更 好 地 为 UPLC 服 务, 从 而 最 大 程 度 的 体 现 仪 器 性 能 和 获 取 最 佳 的 实 验 数 据 会 议 结 束 后, 参 会 的 用 户 纷 纷 表 示 此 次 会 议 对 其 的 研 究 工 作 非 常 有 益, 希 望 可 以 参 加 下 一 届 沃 特 世 中 国 区 高 级 市 场 经 理 叶 瑞 莉 对 此 表 示, 沃 特 世 将 每 年 举 办 一 期 亚 太 区 纯 化 论 坛, 并 有 信 心 将 其 创 建 为 一 个 品 牌, 服 务 于 中 国 和 亚 太 区 的 纯 化 用 户, 致 力 于 构 建 一 个 互 动 的 交 流 技 术 与 经 验 的 沟 通 平 台 我 们 热 忱 欢 迎 每 一 位 纯 化 用 户 的 积 极 参 与, 并 期 待 聆 听 各 位 精 彩 的 报 告 本 次 会 议 首 次 增 设 了 Workshop 环 节, 在 上 海 实 验 室 现 场 向 用 户 演 示 了 AutoPurification 系 统 的 OALogin 和 AutoPurify 等 功 能, 以 及 UPLC 快 速 高 效 的 性 能 在 高 通 量 分 析 中 的 优 势 现 场 气 氛 非 常 热 烈, 新 老 用 户 积 极 参 与, 相 互 交 流 此 次 会 议 还 特 别 邀 请 了 来 自 合 作 伙 伴 Millipore 公 司 的 02

5 [ 公 司 动 态 ] 沃 特 世 公 司 荣 获 市 场 领 导 和 产 品 创 新 奖 Frost 和 Sullivan 公 司 赞 赏 沃 特 世 为 科 学 和 商 业 创 造 新 机 遇 所 作 的 贡 献 沃 特 世 公 司 (NYSE: WAT) 今 天 宣 布 被 Frost & Sullivan 公 司 授 予 2007 年 市 场 领 导 奖 和 2007 年 产 品 创 新 奖 市 场 领 导 奖 是 对 公 司 在 液 相 色 谱 领 域 取 得 成 功 和 领 先 的 肯 定, 同 时 也 是 对 沃 特 世 技 术 在 经 营 业 绩 和 科 学 进 步 所 获 成 果 的 表 彰 产 品 创 新 奖 则 认 可 了 公 司 将 分 析 科 学 提 升 至 一 个 新 水 平 的 能 力, 特 别 是 指 实 验 室 信 息 学 软 件 系 列 和 信 息 管 理 平 台 在 美 国 液 相 市 场 获 得 这 两 个 领 域 的 领 导 地 位, 沃 特 世 公 司 无 疑 已 成 为 使 用 液 相 分 离 方 法 用 户 的 整 体 解 决 方 案 的 提 供 者, Frost & Sullivan 公 司 研 究 分 析 家 Shankar Sellappan 博 士 谈 到, 而 且, 围 绕 这 一 技 术 开 发 的 使 用 方 法 和 应 用 软 件, 会 使 公 司 在 未 来 获 益 非 浅 除 了 设 计, 制 造 和 销 售 超 高 效 液 相 色 谱 UltraPerformance LC (UPLC ), 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 和 质 谱 (MS) 仪 器 系 统 及 相 关 服 务 和 支 持 产 品 外, 沃 特 世 也 是 软 件 解 决 方 案 的 领 先 开 发 者 和 供 应 商 Frost & Sullivan 公 司 研 究 分 析 家 Amarpreet Dhiman 博 士 注 意 到, Frost & Sullivan 相 信 通 过 发 挥 目 前 在 现 有 市 场 的 领 导 地 位 作 用, 沃 特 世 公 司 将 胜 任 开 发 创 新 技 术, 商 用 尖 端 软 件 和 通 用 流 程 管 理 方 案 的 使 命 得 到 Frost & Sullivan 的 赞 誉 非 常 令 人 欣 慰, 因 为 这 个 奖 项 肯 定 了 我 们 为 实 验 室 及 其 依 赖 型 机 构 的 成 功 所 付 出 的 努 力 沃 特 世 公 司 全 球 市 场 营 销 副 总 裁 Rohit Khanna 博 士 说, 我 们 的 信 息 学 系 列 赋 予 科 学 发 现 和 高 效 商 业 管 理 洞 察 力 和 决 定 权, 并 将 一 直 成 为 各 大 行 业 领 先 企 业 的 首 要 选 择 关 于 Frost & Sullivan 公 司 Frost & Sullivan 公 司 是 一 家 全 球 发 展 咨 询 公 司, 四 十 多 年 来 与 客 户 精 诚 合 作, 支 持 创 新 决 策 的 开 发 公 司 企 业 专 长 包 括 融 合 发 展 咨 询, 发 展 合 作 服 务 和 企 业 管 理 培 训 为 公 司 寻 找 和 开 发 机 遇 Frost & Sullivan 公 司 广 泛 服 务 于 包 括 全 球 一 千 家 公 司, 新 兴 公 司 和 投 资 团 体 在 内 的 客 户 群, 结 合 与 时 俱 进 的 市 场, 技 术, 经 济 和 地 域 分 析, 反 映 独 特 的 全 球 视 角, 提 供 综 合 企 业 方 案 欲 知 更 多 详 情, 请 浏 览 com 征 稿 启 事 液 相 色 谱 / 质 谱 通 讯 欢 迎 用 户 投 稿 本 刊 自 开 办 以 来, 一 直 得 到 用 户 的 支 持 与 厚 爱 值 此 圣 诞 元 旦 佳 节 之 际, 沃 特 世 全 体 员 工 向 您 表 达 最 诚 挚 的 敬 意, 感 谢 您 长 久 以 来 真 诚 的 关 心 与 帮 助 用 户 的 成 功 = Waters 的 成 功 我 们 希 望 成 为 您 忠 实 的 工 作 伙 伴, 期 待 着 与 您 更 多 的 交 流 与 合 作 征 稿 范 围 : 使 用 沃 特 世 产 品 ( 包 括 UPLC,HPLC 或 MS 仪 器 色 谱 柱 SPE 或 其 它 前 处 理 产 品 等 ) 的 应 用 报 告, 使 用 技 巧 及 成 功 经 验 或 心 得 稿 件 在 3000 字 以 内, 以 Word 文 件 或 A4 纸 打 印 稿 投 稿 刊 物 一 经 采 用, 将 酌 致 作 者 稿 酬 未 经 录 用 的 稿 件, 恕 不 退 回, 请 作 者 自 留 底 稿 本 刊 为 内 部 交 流 刊 物, 故 不 影 响 作 者 向 公 开 正 式 出 版 物 继 续 投 稿 Word 文 件 请 电 邮 至 xie_ying_feng@waters.com 打 印 稿 投 稿 请 邮 寄 至 上 海 办 事 处 市 场 部 收 ( 见 封 底 ) 03

6 [ 应 用 报 告 ]

7 [ 应 用 报 告 ] 超 高 效 液 相 色 谱 (UPLC) UV 测 定 细 辛 不 同 部 位 中 马 兜 铃 酸 A 的 含 量 薛 燕 1, 童 湘 晖 2, 王 峰 3 3, 赵 维 国 (1. 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 药 物 研 究 所, 北 京 ; 2. 北 京 同 仁 堂 科 技 发 展 股 份 有 限 公 司, 北 京 ; 3. 沃 特 世 科 技 ( 上 海 ) 有 限 公 司, 北 京 ) 摘 要 : 目 的 : 建 立 细 辛 中 马 兜 铃 酸 A 的 含 量 测 定 方 法 方 法 : 采 用 UPLC -UV, 及 UPLC-MS/MS 法 色 谱 柱 为 ACQUITY UPLC HSS T3 色 谱 柱 ( mm,1.8 µm); 流 动 相 为 乙 腈 (A): 0.1% 甲 酸 (B);0 min:a 30%,5 min:a 60%,7 min:a 100%; 流 速 为 0.5 ml min -1 ; 检 测 波 长 251 nm 结 果 : 马 兜 铃 酸 A 在 18.12~1450 ng 范 围 内 线 性 关 系 良 好 (r=0.9999), 最 低 检 测 限 为 ng 结 论 : 本 法 专 属 性 强, 结 果 稳 定, 方 法 的 回 收 率 良 好, 证 明 超 高 效 液 相 色 谱 可 用 于 中 药 细 辛 不 同 部 位 马 兜 铃 酸 A 的 含 量 检 查 关 键 词 :UPLC, 细 辛, 马 兜 铃 酸 A 近 年 来 由 于 马 兜 铃 酸 已 确 定 为 一 种 具 有 肾 毒 性 和 致 癌 作 用 的 物 质, 使 有 关 马 兜 铃 科 中 药 的 安 全 性 受 到 了 密 切 的 关 注 1,2, 2005 版 的 中 国 药 典 对 马 兜 铃 科 中 药 的 使 用 也 作 了 相 关 调 整, 中 药 细 辛 就 是 其 中 之 一 细 辛 是 临 床 上 常 用 的 祛 风 止 痛 药, 属 于 马 兜 铃 科 植 物, 新 版 药 典 中 细 辛 的 药 用 部 位 从 使 用 全 草 变 更 为 使 用 地 下 部 分 我 们 利 用 灵 敏 度 及 分 离 度 都 高 于 高 效 液 相 色 谱 仪 ( H P L C ) 的 超 高 效 液 相 色 谱 仪 (UltraPerformance LC,UPLC), 对 于 采 集 的 和 市 售 的 细 辛 样 品 进 行 马 兜 铃 酸 A 含 量 检 测 的 比 较 研 究, 并 采 用 LC/MS/MS 对 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 及 供 试 品 中 的 马 兜 铃 酸 A 结 构 进 行 确 认 在 此 基 础 上, 对 来 源 不 同 的 细 辛 的 不 同 部 位, 进 行 马 兜 铃 酸 A 含 量 检 测 的 比 较 研 究, 测 定 这 种 有 毒 成 分 在 细 辛 中 的 分 布 情 况, 以 了 解 细 辛 用 药 的 安 全 性 本 次 测 定 结 果 表 明, 细 辛 虽 属 于 马 兜 铃 科 植 物, 但 细 辛 地 上 部 分 中 的 马 兜 铃 酸 A 均 在 万 分 之 二 以 下, 细 辛 地 下 部 分 中 的 马 兜 铃 酸 A 就 更 低, 均 在 百 万 分 之 五 以 下, 或 更 低 仪 器 与 材 料 Acquity UltraPerformance LC 色 谱 仪,Acquity PDA 检 测 器, Micromass Quattro Premier TM XE 三 重 四 极 质 谱 仪,Acquity UPLC HSS T3 色 谱 柱 (2.1 mm 50 mm,1.8 µm);ag-135 型 电 子 分 析 天 平 ` 梅 特 勒 - 托 利 多 公 司 ),T 680 H 超 声 清 洗 器 (elma 公 司 ) 甲 醇 乙 腈 均 为 色 谱 纯 (Fisher 公 司 ), 甲 酸 ( 98.0 %,Fluka 公 司 ), 水 为 高 纯 水, 其 余 试 剂 均 为 分 析 纯 马 兜 铃 酸 A( 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所, 供 含 量 测 定 用, 批 号 : ), 细 辛 药 材 ( 采 集 或 市 售 的 药 材 来 自 于 北 京 辽 宁 吉 林, 由 医 科 院 药 植 所 林 余 霖 教 授 鉴 定 ), 所 有 样 品 粉 碎 过 65 目 筛, 备 用 质 谱 条 件 电 离 模 式 : ESI+ 毛 细 管 电 压 : 3.5 KV 锥 孔 电 压 : 15 V 离 子 源 温 度 : 105 脱 溶 剂 温 度 : 300 锥 孔 反 吹 气 流 量 : 50 L/hr 脱 溶 剂 气 流 量 : 550 L/hr 碰 撞 能 量 : 15 V MRM 多 反 应 监 测 方 式 : 母 离 子 m/z 359.0([M+NH 4 ] + ) 监 测 离 子 m/z

8 [ 应 用 报 告 ] 色 谱 条 件 流 动 相 : 乙 腈 (A): 0.1% 梯 度 洗 脱 甲 酸 (B): 0 min:a 30% 5 min:a60 % 7 min:a100 % 流 速 : 0.5 ml min -1 检 测 波 长 : 251nm 柱 温 : 40 样 品 室 温 度 :20 图 1 供 试 品 溶 液 处 理 前 的 色 谱 图 样 品 溶 液 的 制 备 4.1 对 照 品 溶 液 的 制 备 精 密 称 定 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 适 量, 加 甲 醇 制 成 145 µg ml -1 的 溶 液, 即 得 对 照 品 储 备 液, 冰 箱 冷 藏 备 用 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 储 备 液, 用 甲 醇 / 水 (1:1) 混 合 液 进 行 稀 释, 制 成 18.12, 72.50, 290,580,1160,1450 ng ml -1 系 列 浓 度 的 对 照 品 溶 液 4.2 供 试 品 溶 液 的 提 取 取 细 辛 药 材 粉 末 ( 过 65 目 筛 ) 约 2g, 精 密 称 定, 置 50mL 锥 形 瓶 中, 加 10 % 甲 酸 : 甲 醇 (20:80) 至 刻 度 线, 密 塞, 超 声 ( 250W, 40kHz ) 提 取 30 min, 放 冷 后, 加 10 % 甲 酸 : 甲 醇 (20:80) 补 足 减 少 的 体 积, 摇 匀, 在 4000 rpm 下 离 心 5 分 钟, 精 密 吸 取 离 心 后 的 上 清 液 9 ml 转 移 至 10 ml 量 瓶 中, 加 12 L -1 的 NaOH 350 µl, 加 水 至 刻 度, 摇 匀, 得 ph 在 10 以 上 的 供 试 品 溶 液 4.3 细 辛 供 试 品 溶 液 的 直 接 进 样 分 析 细 辛 提 取 液 直 接 进 样 分 析, 结 果 在 目 标 峰 位 置 有 两 个 组 分 峰 ( 图 1), 由 于 有 两 个 组 分 峰 与 马 兜 铃 酸 对 照 品 溶 液 出 峰 时 间 比 较 接 近, 为 了 鉴 别 马 兜 铃 酸 峰, 分 别 提 取 其 相 应 的 光 谱 图, 与 马 兜 铃 酸 对 照 品 的 光 谱 图 相 比 较 以 判 断 峰 的 归 属 ( 图 2) 将 这 两 个 组 分 峰 的 光 谱 图 与 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 的 光 谱 图 相 比 较, 可 确 定 保 留 时 间 为 2.79 的 峰 不 是 马 兜 铃 酸 A, 而 保 留 时 间 为 2.94 的 组 分 峰 与 马 兜 铃 酸 对 照 品 出 峰 时 间 基 本 一 致, 但 两 者 的 光 谱 图 明 显 不 同 由 此 推 测 药 材 的 基 质 干 扰 比 较 严 重, 供 试 品 溶 液 进 样 前 应 进 行 样 品 前 处 理 净 化 后 再 分 析 图 2 两 个 组 分 峰 与 马 兜 铃 酸 A 的 光 谱 图 比 较 A: 保 留 时 间 为 2.79 的 组 分 峰 光 谱 图 B: 保 留 时 间 为 2.94 的 组 分 峰 光 谱 图 C: 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 的 光 谱 图 06

9 [ 应 用 报 告 ] 4.4 供 试 品 溶 液 的 前 处 理 本 实 验 采 用 Oasis MAX(3CC) 固 相 提 取 小 柱, 分 别 加 入 甲 醇, 水 进 行 活 化 及 平 衡 取 已 调 ph 至 10 以 上 的 供 试 品 溶 液 3mL 上 样 到 活 化 平 衡 后 的 MAX 小 柱 上, 分 别 用 甲 醇 2 % 甲 酸 : 甲 醇 (4: 6) 清 洗, 最 后 用 2 % 甲 酸 : 甲 醇 : 乙 腈 混 合 溶 剂 进 行 洗 脱, 收 集 洗 脱 液 并 混 匀, 进 样 5 µl, 测 定 其 中 的 马 兜 铃 酸 A, 结 果 表 明, 供 试 品 溶 液 前 处 理 后, 马 兜 铃 酸 A 从 保 留 时 间 为 2.94 的 组 分 峰 中 被 分 离 出 来, 它 前 面 保 留 时 间 为 2.79 的 大 峰 也 因 固 相 提 取 峰 面 积 明 显 减 小, 同 时, 因 固 相 提 取 使 样 品 背 景 噪 音 明 显 降 低 ( 图 3), 因 此 我 们 可 以 在 马 兜 铃 酸 A 的 几 个 最 大 吸 收 波 长 (251,322,394 nm) 中 选 择 出 吸 收 系 数 较 大 的 251 nm 作 为 该 方 法 的 检 测 波 长, 加 上 使 用 灵 敏 度 较 高 的 UPLC, 从 而 保 证 该 检 测 方 法 的 灵 敏 度 和 准 确 性 马 兜 铃 酸 A 的 确 认 取 前 处 理 后 的 供 试 品 溶 液 进 样 测 定, 通 过 与 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 比 较, 多 反 应 监 测 模 式 MRM, 样 品 与 对 照 品 的 监 测 离 子 m/z 的 质 量 色 谱 图 保 留 时 间 一 致, 结 果 见 图 5 UPLC/MS/MS 对 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 的 确 认 图 5 样 品 与 对 照 品 MRM 对 照 图 谱 UPLC-PDA 对 马 兜 铃 酸 A 的 方 法 学 研 究 时 间 图 3 供 试 品 溶 液 处 理 前 后 的 图 谱 比 较 为 了 进 一 步 确 认 保 留 时 间 为 2.91 的 色 谱 峰 就 是 要 找 的 目 标 化 合 物 马 兜 铃 酸 A, 我 们 又 取 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 储 备 液, 用 甲 醇 / 水 (1:1) 混 合 液 进 行 稀 释, 制 成 一 定 浓 度 的 对 照 品 溶 液 进 样 进 行 液 质 联 用 分 析, 从 马 兜 铃 酸 A 的 加 合 离 子 及 碎 片 峰 中 可 以 看 到 m/z359.0[m+nh 4 ],m/z 251.7,m/z 264.8,m/z 296,m/z 298.0, m/z 324.0, 与 文 献 对 比, 确 认 该 物 质 为 马 兜 铃 酸 A, 结 果 见 图 线 性 关 系 考 察 按 上 述 色 谱 条 件, 分 别 取 马 兜 铃 酸 A 系 列 对 照 品 溶 液, 自 动 进 样 5 µl, 在 251nm 处 测 定 马 兜 铃 酸 A 的 峰 面 积 值, 回 归 处 理 所 得 数 据, 得 回 归 方 程, 结 果 见 图 6 面 积 UPLC/MS/MS 对 供 试 品 溶 液 中 含 量 图 6 马 兜 铃 酸 A 校 正 曲 线 图 回 归 方 程 : y= 4.89X 220 r= 结 果 说 明 马 兜 铃 酸 A 在 ng ml -1 范 围 内 与 峰 面 积 积 分 值 呈 良 好 的 线 性 关 系 图 4 马 兜 铃 酸 A 的 子 离 子 扫 描 图 谱 7.2 最 低 检 测 限 试 验 取 对 照 品 溶 液 逐 步 稀 释, 进 样 5µL, 最 低 检 测 限 为 ng ml -1 (S/N>3) 07

10 [ 应 用 报 告 ] 7.3 精 密 度 试 验 取 供 试 品 溶 液 5 µl, 重 复 进 样 6 次, 测 定 峰 面 积 值, 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 峰 面 积 值 的 RSD 为 0.4 %, 结 果 表 明 此 色 谱 仪 的 精 密 度 良 好 7.4 稳 定 性 试 验 取 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 溶 液 (400 ng ml -1 ), 分 别 于 0,2,4, 6,8,12,24,48 h 进 样 5 µl, 测 定 其 峰 面 积 值, 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 峰 面 积 值 的 RSD 为 1.4 %, 结 果 表 明 马 兜 铃 酸 A 甲 醇 水 溶 液 在 0-48 h 内 稳 定 7.5 重 复 性 试 验 取 同 一 批 次 药 材 6 份, 按 照 4.2,4.4 项 下 制 备 供 试 品 溶 液, 供 试 品 溶 液 分 别 进 样 5 µl, 测 定 其 含 量 结 果 显 示 各 份 供 试 品 含 量 的 RSD 为 1.6 %, 表 明 重 复 性 良 好 供 试 品 溶 液 中 马 兜 铃 酸 A 的 检 测 取 采 集 或 市 售 的 细 辛 药 材, 按 照 4.2,4.4 项 下 制 备 供 试 品 溶 液, 取 供 试 品 溶 液 分 别 进 样 5 µl, 记 录 色 谱 图, 对 于 含 量 低 于 检 测 浓 度 的 供 试 品 溶 液, 将 供 试 品 溶 液 用 氮 气 吹 干, 浓 缩 后 进 样 测 定 结 果 表 明, 被 测 的 14 批 细 辛 根 中 马 兜 铃 酸 A 的 含 量 均 在 百 万 分 之 四 以 下, 一 些 样 品 甚 至 更 低 相 对 应 的 细 辛 地 上 部 分 中 的 马 兜 铃 酸 A 的 含 量 一 般 要 比 其 地 下 部 分 高 几 倍 到 几 十 倍 ( 表 1) 表 1 中 药 细 辛 中 马 兜 铃 酸 A 的 含 量 测 定 结 果 来 源 含 量 (µg g -1 ) 地 下 部 分 地 上 部 分 北 京 南 城 1.06 北 京 南 城 0.90 北 京 通 县 0.84 北 京 通 县 1.50 北 京 海 淀 1.57 北 京 海 淀 2.00 北 京 南 城 4.00 辽 宁 本 溪 辽 宁 凤 城 辽 宁 横 仁 吉 林 通 化 辽 宁 清 原 辽 宁 横 仁 辽 宁 横 仁 加 样 回 收 试 验 精 密 称 定 已 知 含 量 的 细 辛 药 材 粉 末 约 1 g, 共 6 份, 精 密 称 定 后 置 50 ml 量 瓶 中, 分 别 加 入 马 兜 铃 酸 A 对 照 品 1.13 µg, 按 照 4.2,4.4 项 下 制 备 供 试 品 溶 液, 进 样 5 µl, 测 定 其 含 量, 计 算 回 收 率, 平 均 回 收 率 为 %,RSD 为 2.49 % 讨 论 10.1 本 实 验 采 用 具 有 更 高 分 离 效 能 的 UPLC 系 统, 配 合 固 相 提 取 处 理 供 试 品 溶 液, 可 以 清 晰 地 将 马 兜 铃 酸 A 与 其 相 近 的 未 知 峰 完 全 分 离, 马 兜 铃 酸 A 在 3 分 钟 内 出 峰, 整 个 分 离 过 程 耗 时 7 分 钟, 比 HPLC[3] 省 时 而 且 高 效, 适 用 于 细 辛 和 其 制 剂 的 质 量 控 制 10.2 另 外, 供 试 品 溶 液 如 果 直 接 进 样, 马 兜 铃 酸 A 隐 藏 在 保 留 时 间 为 2.94 的 小 峰 中, 而 且 在 这 个 小 峰 的 紧 前 面 还 有 一 个 保 留 时 间 为 2.79 的 大 峰, 两 峰 保 留 时 间 相 差 0.1 分 钟, 峰 面 积 相 差 一 百 倍 以 上, 在 HPLC 方 法 中, 由 于 分 离 度 低, 有 可 能 把 保 留 时 间 =2.79 的 大 峰 误 认 为 是 马 兜 铃 酸 A 的 组 分 峰, 因 而 会 得 出 马 兜 铃 酸 含 量 很 高 的 错 误 结 论, 从 而 误 把 合 格 的 样 品 判 为 不 合 格, 浪 费 了 资 源 UPLC 因 具 有 更 高 效 的 分 离 性 能, 可 以 将 马 兜 铃 酸 与 之 完 全 分 开, 从 而 避 免 了 误 判 虽 然 UPLC 可 以 将 细 辛 药 材 中 的 马 兜 铃 酸 A 与 保 留 时 间 =2.79 的 大 峰 完 全 分 离, 但 实 验 分 析 表 明, 保 留 时 间 为 2.94 的 组 分 峰 与 马 兜 铃 酸 对 照 品 出 峰 时 间 基 本 一 致, 属 于 共 流 出 物 峰, 表 明 供 试 品 溶 液 直 接 进 样 存 在 较 大 干 扰, 应 进 行 样 品 前 处 理 净 化 后 再 分 离 因 此 本 实 验 采 用 了 固 相 提 取 处 理 供 试 品 溶 液 结 果 证 明, 供 试 品 溶 液 处 理 后, 马 兜 铃 酸 A 被 从 保 留 时 间 为 2.94 的 小 峰 中 分 离 出 来, 而 且 马 兜 铃 酸 A 的 色 谱 峰 与 保 留 时 间 为 2.8 和 2.9 的 两 个 色 谱 峰 完 全 基 线 分 离, 因 此 我 们 可 以 准 确 定 量 供 试 品 溶 液 中 马 兜 铃 酸 A 的 含 量 同 时, 固 相 提 取 处 理 后 的 供 试 品 溶 液, 使 背 景 噪 音 明 显 降 低, 因 此 我 们 可 以 在 马 兜 铃 酸 A 的 几 个 最 大 吸 收 波 长 (251,322,394 nm) 中 选 择 出 吸 收 系 数 较 大 的 251 nm 作 为 该 分 析 方 法 的 检 测 波 长, 提 高 了 方 法 的 灵 敏 度, 加 上 使 用 灵 敏 度 和 分 离 度 都 高 于 HPLC 的 UPLC, 从 而 保 证 了 该 分 析 方 法 有 更 高 的 灵 敏 度 和 准 确 性 08

11 [ 应 用 报 告 ] 10.3 许 多 临 床 上 常 用 的 马 兜 铃 科 中 药 的 安 全 性 因 马 兜 铃 酸 的 问 题 受 到 质 疑, 但 这 种 情 况 不 能 一 概 而 论 4,5 本 实 验 也 表 明, 细 辛 虽 属 马 兜 铃 科, 但 细 辛 根 中 的 马 兜 铃 酸 A 含 量 极 低 从 这 些 被 检 样 品 的 测 定 结 果 可 以 看 出, 细 辛 地 下 部 分 含 有 的 马 兜 铃 酸 A 均 在 百 万 分 之 五 以 下, 一 些 样 品 甚 至 只 有 千 万 分 之 几, 属 于 痕 量 存 在 另 外, 细 辛 的 地 上 部 分 含 有 的 马 兜 铃 酸 A 的 浓 度 高 于 地 下 部 分, 一 般 高 几 倍, 最 高 相 差 四 十 倍, 但 也 在 万 分 之 二 以 下, 比 起 马 兜 铃 酸 致 肾 毒 性 所 需 要 的 剂 量 来 看 [6], 细 辛 的 毒 性 可 能 更 多 的 是 来 源 于 它 所 含 有 的 黄 樟 醚 等 成 分 参 考 文 献 1. Volker M. Aristolochic acid a probable human cancer hazard in herbal remedies:a review. Mutagenesis vol, 2002;17: 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局. 关 于 加 强 广 防 己 等 6 种 药 材 及 其 制 剂 监 督 管 理 的 通 知. 齐 鲁 药 事,2004,23:6 3. 路 金 才, 韩 娜 杜, 晓 曦 等, 马 兜 铃 酸 的 测 定 方 法 现 状 分 析 中 草 药,2006,37(7): 倪 美 华, 狄 留 庆, 朱 蓉 蓉 等, 测 定 北 细 辛 不 同 部 位 及 穴 贴 定 喘 膏 中 马 兜 铃 酸 A 的 含 量. 南 京 中 医 药 大 学 学 报,2006,22(2):96 5. 周 祯 祥, 陈 泽, 李 军, 细 辛 毒 性 的 研 究 述 评, 中 医 药 信 息, 2003,20(6):30 6. 王 勇, 邓 晓 春. 马 兜 铃 酸 结 构 多 样 性 及 其 复 方 毒 性 研 究 进 展. 中 草 药,2006,37(8):3 沃 特 世 ACQUITY UPLC 系 统 09

12 [ 应 用 报 告 ] 沃 特 世 GCT Premier 精 确 质 量 代 谢 组 学 对 拟 南 芥 氮 饥 饿 的 研 究 Stephanie Boutet-Mercey 1, Hilary Major 2, Joanne Cardwell 2, Anne Krapp 1, Patrice Meinmoun 3, Delphine Hourcade 3 1 INRA, Versailles, 法 国 ; 2 沃 特 世 公 司, 曼 彻 斯 特, 英 国 ; 3 Paris-Sud 大 学,Orsay, 法 国 前 言 氮 是 植 物 生 长 和 发 育 过 程 的 必 要 元 素 在 自 然 界 土 壤 里, 氮 胁 迫 引 发 代 谢 和 基 因 表 达 水 平 上 的 多 种 应 答 以 及 无 梗 植 物 长 短 期 适 应 性 发 育 生 物 大 分 子 吸 收 的 氮 可 被 释 放 而 回 到 无 机 氮 (NH 4 ) 的 形 式, 这 样 可 以 重 新 进 入 各 种 生 理 过 程 的 代 谢 途 径, 如 光 呼 吸, 苯 丙 酸 类 的 生 物 合 成 由 于 氮 代 谢 与 其 它 途 径 相 互 关 联, 如 碳 代 谢, 碳 和 氮 代 谢 的 主 要 变 化 已 经 在 文 章 上 被 描 述 1,1997, 但 是, 为 了 进 一 步 了 解 代 谢 网 络 对 氮 胁 迫 的 动 态 应 答, 需 要 更 具 体 的 总 代 谢 物 分 析 结 果 最 近 对 番 茄 2,2005 3,2005 植 株 和 衣 滴 虫 的 研 究 显 示 在 氮 饥 饿 之 后, 总 代 谢 物 趋 势 发 生 极 大 变 化 本 文 中, 我 们 使 用 沃 特 世 公 司 GC/MS 气 相 色 谱 / 质 谱 联 用 仪 GCT Premier TM, 研 究 拟 南 芥 的 氮 饥 饿, 侧 重 于 一 般 和 严 重 氮 饥 饿 之 后 根 与 叶 的 代 谢 谱 图 的 变 化 规 律 一 般 氮 饥 饿 是 取 消 氮 元 素 两 天 后, 严 重 氮 饥 饿 在 十 天 后 详 细 比 较 这 两 个 器 官 在 饥 饿 时 间 段 的 代 谢 谱 图 将 可 进 一 步 描 述 植 株 对 氮 胁 迫 的 适 应 行 为 植 株 生 长 和 样 品 制 备 实 验 方 法 拟 南 芥 植 株 经 溶 液 培 养 参 照 Orsel 等 人 的 方 法 4 植 株 在 6mM 硝 酸 盐 水 溶 液 中 培 养 六 个 星 期 氮 饥 饿 期 是 两 天 和 十 天, 分 别 采 集 根 和 叶 的 样 品 称 取 40mg 拟 南 芥 叶 和 根 ( 新 鲜 材 料 ), 加 入 1mL 提 取 缓 冲 液 ( 参 照 Gulberg 等 人 的 方 法 ) 5 提 取 缓 冲 液 ( 氯 仿 / 甲 醇 / 水 ( 体 积 比 1:3:1,-20 ) 可 将 脂 溶 性 的 和 水 溶 性 的 提 取 物 合 并 在 同 一 相 所 有 样 品 混 匀 三 分 钟, 在 4 离 心 3000rpm 十 分 钟 300µL 上 清 液 经 过 真 空 干 燥, 保 存 在 -80 氩 气 中 以 备 分 析 6 干 燥 的 提 取 物 使 用 Fiehn 等 人 介 绍 的 两 步 衍 生 法 进 行 衍 生 取 20µL 40mg/mL 的 嘧 啶 中 的 甲 氧 胺 盐 酸 盐, 加 至 提 取 物 中,28 放 置 九 十 分 钟 加 入 180µLMSTFA, 于 37 放 置 三 十 分 钟 之 后, 样 品 使 用 气 质 连 用 仪 分 析 气 相 条 件 分 析 柱 : J & W Scientif c DB-5MS, 30m 0.25mm, 直 径 X0.25µm 厚 度 流 速 : 1.0mL/ 分 钟 氦 气 梯 度 : 温 度 ( ) 时 间 ( 分 钟 ) 流 速 (C/ 分 钟 ) 转 移 柱 : 280 溶 剂 延 迟 : 4.3 分 钟 质 谱 条 件 质 谱 系 统 : 沃 特 世 GCT Premier 离 子 化 模 式 : EI 和 CI 正 离 子 离 子 源 温 度 : 200 电 子 能 量 : 70 电 子 伏 特 捕 获 电 流 (EI): 200µA 发 射 电 流 (CI 正 ): 200 µa 质 量 范 围 : 50 至 1000 质 荷 比 采 集 速 率 : 0.19 秒 CI 气 体 : 90 :10 甲 烷 / 氨 锁 定 参 考 标 样 EI: 五 氟 氯 化 苯 精 确 质 量 : 锁 定 参 考 标 样 CI: 2,4,6- Tris( 三 氟 甲 基 )-1,3,5 三 嗪 精 确 质 量 : 结 果 采 集 的 数 据 通 过 沃 特 世 质 谱 操 作 软 件 中 代 谢 组 学 应 用 管 理 软 件 Markerlynx TM 处 理, 所 有 EI 数 据 的 PCA 的 结 果 分 数 图 如 图 2 所 示 图 中 看 到 叶 和 根 以 及 采 自 每 一 级 氮 饥 饿 试 验 的 样 品 被 清 晰 分 开 衍 生 化 的 树 叶 提 取 物 EI 分 析 的 总 离 子 流 图 如 图 3 所 示, 衍 10

13 应用报告 相反的是 根样品在6.88分钟的峰 主要由三甲硅烷磷酸 盐组成 而在叶子样品中含量很低 因氮饥饿带来的主要变化是在保留时间11.75至12.25分 钟段内峰强度的增加 相对应的是碳水化合物的增加 氨基酸水平在氮饥饿阶段是降低的 这一发现与 Urbanczyk-Wochniak和Fernie2的报道相符合 氨基酸的鉴定使用EI 谱图的NIST谱库 它们的分子量由CI精确质量数确认 在植物生长所需正常氮元素供给的叶子样品EI与CI图如 图5 所示 EI图给出丙氨酸的三甲硅烷衍生后产物很好的匹 配 其质子化的质量数由CI确认为 (误差 -0.1 mda, 图2 EI数据的代谢组学软件PCA分数图 -0.4 ppm) 图3 叶提取物的EI总离子流图 a)未处理 b)氮饥饿两天 c)氮饥饿十天 图5 a) EI 和b)CI谱图 正常氮供给条件下 叶提取物在5.09分钟洗脱出 来的峰 被鉴定为N O - Bis - 三甲硅烷基丙氨酸 对于气相色谱质谱连用仪鉴定代谢产物通常通过比较得 到的EI谱图和数据库中的EI谱图获得 如NIST库 然而 许多植 物代谢产物或者不在谱库中或者EI谱图被衍生化产物所覆盖 使得重新鉴定未知谱峰变得困难 CI能量较低 通常得到分子 离子而不是碎片离子的结果 从而获得分子离子信息 表1列出了一些质子化氨基酸的理论分子量 表明氮 饥饿后在根和叶中显著的降低 以及通过代谢组学软件 Markerlynx处理所有CI数据后的分子量 可以看到小于5PPM的精 图4 根提取物的EI总离子流图 a)未处理 b)氮饥饿两天 c)氮饥饿十天 生化的根提取物EI分析的总离子流图如图4 所示 色谱图显示叶与根的代谢图有显著差别 如叶子样品在 7.67分钟的强峰 被鉴定为反丁烯二酸 而在根的样品中仅仅 以微量存在 11 表1 氮饥饿后 根和叶样品中氨基酸含量显著降低 由 NIST EI数据库搜索鉴定 保留时间 (分钟) NIST库 鉴定 丙胺酸 脯氨酸 甘氨酸 谷氨酰胺 元素 组成 C9H23NO2Si2 C11H25NO2Si2 C11H29NO2Si3 C11H23NO3Si2 计算值 [N+H] 实测值 [N+H] 误差 误差 mda (ppm)

14 [ 应 用 报 告 ] 确 质 量 数 测 量 可 在 日 常 操 作 中 获 得, 为 鉴 定 未 知 代 谢 产 物 的 元 素 组 成 提 供 置 信 度 使 用 同 位 素 匹 配 ifit TM 功 能, 置 信 度 将 进 一 步 提 高 单 一 质 量 数 分 析 使 用 ifit 的 一 个 例 子 如 图 6 所 示, 五 个 候 选 元 素 组 成 的 质 荷 比 都 是 260, 误 差 都 在 5PPM 之 内, 进 一 步 分 析 发 现 具 有 最 小 ifit 值 (3.1) 的 组 成 是 正 确 的, 相 对 应 三 甲 硅 烷 衍 生 化 后 的 脯 氨 酸 分 子 式 C 11 H 26 NO 2 Si 2 结 论 将 精 确 质 量 EI 和 CI 数 据 相 结 合, 通 过 Markerlynx 应 用 管 理 软 件 处 理, 是 检 测 和 鉴 定 代 谢 产 物 全 谱 针 对 环 境 应 激 反 应 变 化 的 理 想 方 法, 本 文 中 的 刺 激 来 自 氮 饥 饿 GCT Premier 的 CI 操 作 模 式 通 过 产 生 准 分 子 离 子 提 供 有 用 的 数 据 小 于 5PPM 的 精 确 质 量 测 量 以 及 使 用 ifit 同 位 素 匹 配 模 型 很 容 易 推 导 衍 生 化 合 物 的 元 素 组 成 因 此,CI 的 使 用 结 合 EI 谱 库 匹 配 可 以 成 为 植 物 代 谢 物 未 知 结 构 鉴 定 的 强 有 力 工 具 本 文 阐 述 的 结 果 提 示 硝 酸 盐 营 养 对 植 物 代 谢 有 广 谱 作 用, 氮 饥 饿 导 致 许 多 氨 基 酸 含 量 降 低, 同 时, 相 应 碳 水 化 合 物 水 平 的 升 高 参 考 文 献 图 6 ifit 分 析 衍 生 化 脯 氨 酸 的 质 子 化 分 子 的 元 素 组 成 结 果 1. Scheible et al. Plant Cell : Urbanczyk-Wochniak and Fernie. Journal of Experimental Botany : Bölling and Fiehn. Plant Physiology : Orsel et al. Planta : Gullberg et al. Anal. Biochem : Fiehn et al. Anal. Chem : 沃 特 世 公 司 GCT Premier 12

15 [ 应 用 报 告 ] 超 高 效 液 相 色 谱 / 电 喷 雾 串 联 质 谱 (UPLC/MS/MS) 分 析 全 氟 代 化 合 物 (PFCs) Antonietta Gledhill 1,Anna Karman 2,Ingrid Ericson 2,Bert van Bavel 2,Gunilla Linstrom 2,Gordon Kearney 1 1 沃 特 世 公 司,Atlas 公 园, 曼 彻 斯 特 英 国 2 Obebro 大 学, 瑞 典 介 绍 近 年 来 在 全 球 范 围 内 环 境 和 人 体 血 液 中 检 测 到 全 氟 代 化 合 物 (PFCs) 增 长 的 趋 势 引 起 了 研 究 者 和 有 关 当 局 的 关 注 1-7 PFCs 同 时 具 有 亲 水 性 和 疏 水 性, 经 常 用 于 地 毯 纤 维 皮 革 的 处 理 纸 张 和 食 品 包 装 物 等, 也 是 塑 料 生 产 灭 火 剂 抛 光 剂 和 杀 虫 剂 的 功 能 化 学 品 8,9 实 验 研 究 表 明 PFCs 可 能 干 扰 脂 肪 酸 的 代 谢, 影 响 生 殖 系 统 以 及 导 致 肝 损 害 10,11 将 这 些 效 应 同 PFCs 的 稳 定 性 和 生 物 累 积 性 一 起 考 虑, 暗 示 出 PFCs 可 能 对 环 境 和 人 体 具 有 潜 在 的 毒 害 作 用 因 此, 对 环 境 及 人 体 样 品 中 PFCs 进 行 精 确 和 可 重 现 的 检 测 非 常 必 要, 但 也 面 临 着 诸 多 挑 战 12 来 自 实 验 室 器 材 以 及 仪 器 的 本 底 污 染 是 分 析 PFCS 常 见 的 问 题 高 效 液 相 色 谱 / 质 谱 (HPLC / MS) 技 术 推 动 了 全 氟 代 酸 类 物 质 的 选 择 性 和 灵 敏 性 分 析 本 文 描 述 了 使 用 超 高 效 液 相 色 谱 (UPLC ) 和 串 联 质 谱 ( MS / MS) 的 分 析 方 法 2004 年 推 出 的 沃 特 世 ACQUITY UPLC, 使 用 具 有 1.7µm 颗 粒 粒 径 固 定 相 的 色 谱 柱, 可 以 在 高 压 下 使 用 ( 最 大 压 力 15,000psi) 高 压 与 极 细 颗 粒 的 结 合 提 供 了 快 速 高 分 离 度 的 分 离, 提 高 了 灵 敏 度 减 少 了 基 质 干 扰 使 用 UPLC 分 析 13 种 PFC s 方 法 仅 需 要 5 分 钟, 而 常 规 HPLC 分 析 时 间 需 要 22 分 钟 因 此 UPLC 更 快 的 运 行 时 间 不 仅 提 高 了 仪 器 的 高 通 量, 也 减 少 了 方 法 的 开 发 时 间 本 方 法 包 括 使 用 沃 特 世 公 司 Oasis WAX 小 柱 的 固 相 提 取 (SPE) 的 提 取 步 骤 并 使 用 ACQUITY UPLC 和 沃 特 世 Quattro Premier XE 在 电 喷 雾 负 离 子 模 式 下 分 析 (UPLC / ES-MS / MS) 实 验 部 分 标 准 物 质 PFBuS 四 丁 基 铵 盐 ( 98%) PFOS 钾 盐 ( 98%) PFDA (>97%) PFHxA ( 97%), 购 买 自 Fluka 公 司 ( 施 泰 因 海 姆, 德 国 ) PFHpA (99%) PFNA (97%) PFOA (96%) PFUnDA (95%), 购 买 自 Aldrich 公 司 ( 施 泰 因 海 姆, 德 国 以 及 密 尔 沃 基, 威 斯 康 星, 美 国 ) 7HPFHpA (98%) 购 买 自 ABCR ( 卡 尔 斯 鲁 厄, 德 国 ) PFHxS (98%) 购 买 自 Interchim 公 司 ( 蒙 特 鲁 肯, 法 国 ) 13 C 4 PFOS 13 C 4 PFOA 13 C 5 PFNA 购 买 自 威 灵 顿 实 验 室 ( 安 大 略, 加 拿 大 ) 溶 剂 为 HPLC 纯 (Fisher Scientif c) 提 取 步 骤 ( 根 据 Taniyasu 等 13 ) 沃 特 世 Oasis WAX SPE 小 柱 参 数 :2 ml 甲 醇,2 ml 水 淋 洗 :2 ml 40% 甲 醇 溶 液 至 干 洗 脱 :1 ml 2% 氨 水 甲 醇 溶 液 氮 吹 浓 缩 提 取 液 至 0.5 ml, 使 用 0.2µm 聚 丙 烯 滤 膜 过 滤 至 进 样 瓶 中 加 入 回 收 率 内 标 ( 13 C 5 -PFNA 和 7H-PFHpA) 向 0.5 ml 血 清 或 全 血 样 品 加 入 内 标 ( 13 C 4 -PFOS 和 13 C 4 -PFOA) 混 匀 后 加 入 2mL50 v/v% 蚁 酸 水 溶 液 超 声 15 分 钟 离 心 30 分 钟 (10000 x g) 取 出 上 清 液 使 用 沃 特 世 Oasis WAX SPE 小 柱 提 取 (200mg/2ml) UPLC 方 法 沃 特 世 ACQUITY UPLC 流 动 相 A: 2 mm 醋 酸 铵 水 溶 液 流 动 相 B: 甲 醇 + 2 mm 醋 酸 铵 流 动 相 残 渣 过 滤 器 (MPRT) ( 见 图 1) 色 谱 柱 : ACQUITY BEH C x 50 mm,1.7 µm, (P / N ) 柱 温 : 50 C 流 速 : 0.4 ml / 分 钟 进 样 体 积 :10 µl 13

16 [ 应 用 报 告 ] UPLC 梯 度 0.00 分 钟 : 70% A 30% B 0.50 分 钟 : 70% A 30% B 5.00 分 钟 : 10% A 90% B 5.10 分 钟 : 0% A 100% B 6.00 分 钟 : 0% A 100% B 7.00 分 钟 : 70% A 30% B 分 钟 : 70% A 30% B MS 方 法 沃 特 世 三 重 四 极 杆 Quattro Premier XE 电 喷 雾 负 离 子 化 模 式 多 离 子 反 应 检 测 方 式 使 用 的 锥 孔 电 压 和 碰 撞 能 量 见 表 1 结 果 和 讨 论 图 2 给 出 了 本 次 报 告 使 用 的 所 有 PFCs 的 缩 写 和 全 名 定 量 过 程 使 用 了 两 种 内 标 7HPFHpA 和 13 CPFNA, 13 C-PFOA 和 13 CPFOS 作 为 回 收 率 内 标 开 始 时 实 验 使 用 水 和 甲 醇, 没 有 使 用 缓 冲 相, 但 是 发 现 化 合 物 在 色 谱 柱 上 有 残 留, 为 了 保 证 良 好 的 峰 形, 需 要 在 流 动 相 中 加 入 2 mm 醋 酸 铵 溶 液 TargetLynx, 是 沃 特 世 公 司 MassLynx 工 作 站 中 的 可 选 数 据 处 理 软 件 用 于 血 清 和 全 血 样 品 中 的 化 合 物 数 据 的 处 理 和 定 量 所 有 化 合 物 的 线 性 都 十 分 良 好 (r 2 >0.99) 本 报 告 给 出 了 PFOS 校 正 曲 线 ( 图 3) 图 4 给 出 了 使 用 ACQUITY UPLC / Quattro Premier XE PFC 的 色 谱 图 全 氟 代 化 合 物 缩 写 分 子 式 全 氟 丁 基 磺 酸 盐 PFBuS C 4 F 9 SO 3 全 氟 己 基 磺 酸 盐 PFHxS C 6 F 13 S O3 图 1 改 进 UPLC 系 统 减 少 流 动 相 PFC 干 扰 表 1. ES- 模 式 下 PFCs 的 MRM 转 换 离 子 对 参 数 保 留 时 间 PFC 母 离 子 子 离 子 停 留 时 间 锥 孔 电 压 碰 撞 能 量 功 能 窗 口 PFBuS H-PFHpA PFHxA 功 能 窗 口 PFHpA PFHxS 功 能 窗 口 THPFOS PFOA C-PFOA 功 能 窗 口 PFNA C-PFNA PFOS C-PFOS 功 能 窗 口 PFDA PFUnDA 全 氟 辛 基 磺 酸 盐 PFOS C 8 F 17 S O3 全 氟 己 酸 PFHxA C 5 F 11 C O2 H 全 氟 庚 酸 PFHpA C 6 F 13 C O2 H 全 氟 辛 酸 PFOA C 7 F 15 CO 2 H 全 氟 壬 酸 PFNA C 8 F 17 CO 2 H 全 氟 癸 酸 PFDA C 9 F 19 CO 2 H 全 氟 十 一 烷 酸 PFUnDA C 10 F 21 CO 2 H 内 标 及 回 收 率 标 7H- 全 氟 庚 酸 7H-PFHpA HC 6 F 12 CO 2 H 全 氟 辛 基 磺 酸 盐 13C-PFOS 13 C 8 F 17 SO 3 全 氟 辛 酸 13C-PFOA 13 C 7 F 15 CO 2 H 图 2 本 实 验 分 析 PFCs 清 单 图 ng / ml 浓 度 范 围 内 PFOS 校 正 曲 线 14

17 [ 应 用 报 告 ] 4.2 秒, 从 而 减 少 了 共 流 出 峰 的 可 能 增 加 了 异 构 体 分 离 从 而 提 高 灵 敏 度 回 收 率 图 4 使 用 UPLC / MS / MS 分 析 的 包 含 13 PFCs 的 谱 图 性 能 图 5 将 UPLC 同 传 统 的 HPLC 进 行 比 较, 从 运 行 时 间 和 色 谱 峰 宽 来 看 色 谱 性 能 都 有 提 高 (HPLC 数 据 使 用 LC / MS, 而 UPLC 数 据 使 用 LC / MS / MS) 使 用 HPLC 分 析 这 13 种 化 合 物 的 时 间 是 22 分 钟, 使 用 UPLC 则 缩 短 为 5 分 钟 UPLC 的 快 速 分 析 时 间 具 有 很 多 好 处, 如 减 少 了 方 法 开 发 时 间, 色 谱 峰 宽 度 更 小 图 4 中,PFOS 的 色 谱 峰 宽 从 20.3 秒 减 少 为 表 2 给 出 了 仪 器 和 方 法 的 检 出 限 仪 器 检 出 限 定 义 为 产 生 信 噪 比 (S/N) 为 3 的 浓 度 0.5ml 血 液 样 品 方 法 检 出 限 由 向 血 液 样 品 中 添 加 低 浓 度 的 待 测 物 测 得, 定 义 为 信 噪 比 为 3 的 浓 度 通 过 向 血 和 血 清 样 品 中 添 加 已 知 剂 量 的 PFCs 估 计 提 取 步 骤 回 收 率 和 重 现 性 ( 表 3 : A 部 分 ) 回 收 率 通 过 比 较 样 品 提 取 液 和 标 准 溶 液 中 的 面 积 进 行 体 积 校 正 后 计 算 可 接 受 的 回 收 率 为 % 之 间 ( 对 部 分 长 链 PFCs 而 言, 血 浆 样 品 回 收 率 略 低 这 些 化 合 物 的 标 准 偏 差 也 略 高 通 常 比 短 链 PFC 更 难 于 定 量 ) 按 本 方 法 提 取 未 添 加 PFCs 的 样 品, 在 仪 器 进 样 前 (SPE 提 取 后 ) 向 提 取 液 中 添 加 已 知 剂 量 的 PFCs, 从 而 评 估 电 喷 雾 离 子 化 模 式 下 的 可 能 的 离 子 抑 制 或 加 强 ( 表 3 : B 部 分 ) 获 得 的 峰 面 积 进 行 体 积 校 正 后 除 以 相 应 标 准 溶 液 的 面 积 比 值 >1 时 说 明 样 品 介 质 增 强 了 信 号, 比 值 <1 时 说 明 样 品 介 质 抑 制 了 信 号 结 果 值 除 血 样 品 中 的 PFUnDA 高 达 为 2.47 外, 都 接 近 于 1( 理 想 值 ) 图 5 UPLC 和 传 统 HPLC 的 运 行 时 间 和 峰 宽 比 表 3. 全 血 和 血 清 样 品 的 回 收 率 和 重 现 性 A 部 分 : 回 收 率 和 重 现 性 表 2. 实 验 检 出 限, 单 位 pg / µl. pg / ul 检 出 限 仪 器 方 法 - 血 方 法 - 血 清 PFBuS PFHxS PFOS PFHxA PFHpA PFOA PFNA PFDA PFUnDA B 部 分 : 基 质 效 应 全 血 (n=5) 血 清 (n=5) 全 血 (n=1) 血 清 (n=3) 平 均 值 标 准 偏 差 RSD% 平 均 值 标 准 偏 差 RSD% 均 值 均 值 PFBuS 77% % 77% % PFBuS PFHxA 92% % 83% % PFHxA PFHpA 82% % 79% % PFHpA PFHxS 70% % 77% % PFHxS PFOA 82% % 94% % PFOA PFNA 86% % 99% % PFNA PFOS 78% % 65% % PFOS PFDA 92% % 70% % PFDA PFUnDA 124% % 64% % PFUnDA

18 [ 应 用 报 告 ] 污 染 当 分 析 PFCs 类 化 合 物 时, 污 染 是 常 见 的 问 题, 并 在 很 多 化 合 物 分 析 中 存 在 ( 表 4) 本 文 设 计 了 一 组 实 验 来 检 测 污 染 源 : 1) 空 白 空 气 注 射 + 梯 度 洗 脱 ;2) 无 注 射 梯 度 洗 脱 ;3) 甲 醇 注 射 ( 溶 剂 空 白 ) 以 及 4) 方 法 空 白 注 射 在 预 进 样 器 前 ( 来 自 使 用 溶 剂 或 仪 器 部 件 ) 和 进 样 器 发 现 了 PFOA 和 PFNA 的 污 染, 当 甲 醇 用 量 升 高 时, 出 现 了 污 染 的 色 谱 峰 为 减 少 污 染 干 扰 在 泵 后 和 预 进 样 器 前 加 入 了 一 根 色 谱 柱, 从 而 将 干 扰 峰 从 样 品 峰 中 分 离 当 流 动 相 停 止 时 这 些 化 合 物 可 能 在 色 谱 柱 柱 头 累 积 ( 可 能 由 甲 醇 或 UPLC 系 统 的 部 件 导 致 ) 为 了 避 免 这 种 情 况 的 发 生, 在 运 行 序 列 分 析 前 或 等 待 下 一 次 序 列 分 析 时 将 溶 剂 流 速 设 置 在 ml / 分 钟 分 析 了 两 个 在 不 同 时 间 制 备 的 方 法 空 白 方 法 空 白 比 溶 剂 空 白 污 染 程 度 更 大 在 某 些 情 况 下 观 测 到 的 污 染 可 能 来 自 内 标 对 略 显 偏 高 的 污 染 的 另 一 种 解 释 是 来 自 玻 璃 器 皿 和 接 触 溶 剂 的 污 染 对 来 自 提 取 过 程 的 污 染 使 用 每 12 个 血 液 样 品 提 取 过 程 中 加 入 一 个 MilliQ 水 样 品 ( 空 白 ), 来 自 仪 器 的 污 染 使 用 在 样 品 分 析 序 列 中 引 入 多 次 甲 醇 进 样 来 评 价 表 4. 检 测 PFCs 的 污 染 1) 来 自 溶 剂 / 检 测 器 2) 来 自 处 理 步 骤 空 白 污 染 (pg / ul) 溶 剂 与 操 作 步 骤 溶 剂 空 白 水 : 甲 醇 (65:35) PFBuS 操 作 空 白 备 注 PFHxA ~0.002 ~0.002 PFHpA ~0.001 ~0.001 PFHxS PFOA ~ ~0.1 ~0.4 PFNA ~0.023 ~0.05 污 染 来 源 于 仪 器 及 内 标, 大 约 50%:50% PFOS 污 染 来 源 于 内 标 ISTD PFDA ~0.05 PFUnDA = 未 检 出 = 检 出 但 未 定 量 = 可 能 痕 量 存 在 结 论 使 用 沃 特 世 公 司 UPLC / MS / MS 可 快 速 灵 敏 分 析 PFCs 样 品 该 方 法 将 传 统 HPLC22 分 钟 分 析 时 间 减 少 至 低 于 5 分 钟 使 用 0.5ml 全 血 及 血 清 样 品 的 检 出 限 分 别 为 pg / µl 和 pg / µl 将 这 个 方 法 拓 展 至 更 长 的 长 链 PFCs 化 合 物 需 要 进 一 步 的 研 究 在 本 文 中 省 略 了 一 些 不 太 成 功 的 长 链 化 合 物 的 初 步 结 果 超 高 效 液 相 色 谱 ACQUITY UPLC 以 及 串 联 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 Quattro Premier XE 16

19 [ 经 验 交 流 ] 沃 特 世 Millennium 32 或 Empower 系 统 适 用 性 ( System Suitability ) 软 件 使 用 说 明 一 软 件 安 装 1 安 装 系 统 适 用 性 软 件 之 前, 必 须 确 定 Millennium 32 或 Empower TM 软 件 已 正 确 安 装 并 且 没 有 运 行 2 将 系 统 适 用 性 软 件 的 安 装 软 盘 放 入 驱 动 器 中 3 从 Windows 开 始 菜 单 选 择 运 行, 输 入 A:\setup.exe, 并 确 定 二 软 件 使 用 1 在 Review 窗 口 中 打 开 色 谱 图, 选 择 处 理 方 法 向 导 (Processing Method Wizard) 建 立 处 理 方 法 4 出 现 以 下 对 话 框 时, 选 择 OK 5 出 现 以 下 对 话 框, 软 件 已 安 装 成 功, 确 定 后 退 出 6 若 出 现 其 它 错 误 信 息, 请 与 沃 特 世 工 程 师 联 系 2 处 理 方 法 建 立 后, 选 择 处 理 方 法 窗 口 (Processing Method Window), 修 改 已 建 立 好 的 处 理 方 法 ( 注 :Millennium 软 件 或 Empower 软 件 默 认 不 做 系 统 适 用 性 计 算, 须 在 建 立 好 的 处 理 方 法 中 进 行 修 改, 打 开 系 统 适 用 性 计 算 功 能 ) 17

20 [ 经 验 交 流 ] 3 在 处 理 方 法 窗 口 中 选 择 适 用 性 标 签 (Suitability Tab), 分 别 在 计 算 适 应 性 结 果 (Calculate Suitability Results ) 和 计 算 未 知 峰 的 适 应 性 结 果 (Calculate Suitability Results for Unknown Peaks) 选 项 前 打 勾 选 中, 在 空 体 积 时 间 ( 分 ) (Void Volume Time (min) ) 后 输 入 系 统 死 时 间 (15cm 色 谱 柱 输 入 1.5, 25cm 色 谱 柱 输 入 2) 保 存 方 法, 重 新 积 分, 查 看 结 果 5 左 右 移 动 表 格, 可 查 看 Symmetry Factor( 对 称 因 子 ) Resolution( 分 离 度 ) USP Plate Count( 美 国 药 典 理 论 塔 板 数 ) EP Plate Count( 欧 洲 药 典 理 论 塔 板 数 ) 等 计 算 结 果 ( 注 :EP Plate Count 以 半 峰 宽 计 算, 与 中 国 药 典 相 同 ;USP Plate Count 以 切 线 峰 宽 计 算 ) 4 在 结 果 表 中, 使 用 鼠 标 右 键, 选 择 表 属 性 ( Table Properties ), 选 择 显 示 全 部 (Show All), 确 定 6 要 将 以 上 计 算 结 果 打 印 到 报 告 中, 在 项 目 (Project) 窗 口 的 结 果 (Results) 表 中 选 择 结 果 数 据, 使 用 鼠 标 右 键, 选 择 预 览 / 出 版 (Preview/Publisher), 打 开 打 印 预 览 窗 口 18

21 [ 经 验 交 流 ] 7 选 择 关 闭 (Close) 退 出 打 印 预 览, 进 入 报 告 编 辑 状 态 9 从 左 边 列 表 的 系 统 适 应 性 峰 (Sys. Suit.Peak) 组 中 找 到 对 称 因 子 (Symmetry Factor) 分 离 度 (Resolution) USP Plate Count ( 美 国 药 典 理 论 塔 板 数 ) EP Plate Count ( 欧 洲 药 典 理 论 塔 板 数 ) 等 计 算 结 果, 双 击 即 可 加 入 到 右 边 的 表 格 中 8 鼠 标 双 击 报 告 中 的 表 格 10 重 新 预 览 报 告, 可 见 所 需 的 系 统 适 用 性 计 算 结 果 已 加 入 到 报 告 中 11 此 时 即 可 打 印 报 告, 必 要 时 保 存 此 报 告 方 法 19

22 [ 色 谱 分 离 专 栏 ] 使 用 UPLC-PDA 和 SQD 质 谱 检 测 器 分 析 保 健 食 品 中 的 大 豆 异 黄 酮 Antonietta Gledhill 沃 特 世 公 司,Manchester, 英 国 简 介 大 豆 异 黄 酮 被 称 为 是 植 物 性 雌 激 素, 许 多 研 究 表 明 食 用 含 大 豆 异 黄 酮 的 保 健 食 品 如 豆 奶 和 豆 粉 可 以 预 防 乳 腺 癌 和 前 列 腺 癌, 预 防 心 血 管 疾 病 和 降 低 糖 尿 病 和 绝 经 后 骨 质 疏 松 的 发 生 已 经 发 现 的 十 二 种 大 豆 异 黄 酮, 分 别 为 大 豆 甙 元 (De), 黄 豆 黄 素 (Gle), 染 料 木 素 (Ge) 和 它 们 各 自 的 丙 二 酰 基 (6 -O- 丙 二 酰 基 -β- 配 糖 体 -), 乙 酰 基 (6 -O- 乙 酰 基 -β- 配 糖 体 -) 和 葡 萄 糖 基 (β- 葡 萄 糖 苷 ) 构 型 它 们 的 结 构 见 图 1 PDA 条 件 PDA: 分 离 度 : 波 长 范 围 : 采 集 速 度 : ACQUITY UPLC PDA 1.2nm nm 20 点 / 秒 MS 条 件 MS: SQD 检 测 器 去 溶 剂 温 度 : 400 电 离 模 式 : ESI(+) 毛 细 管 电 压 : 2000V 去 溶 剂 气 体 :1000L/h 源 温 度 : 130 大 豆 苷 元 黄 豆 黄 素 染 料 木 素 葡 萄 糖 基 - 大 豆 异 黄 酮 全 扫 描 设 置 锥 孔 电 压 : 37V 采 集 范 围 : m/z 50~550 SIR 设 置 每 个 SIR 停 顿 时 间 为 10ms, 延 迟 5ms 乙 酰 基 - 大 豆 异 黄 酮 丙 二 酰 基 - 大 豆 异 黄 酮 图 1 三 种 大 豆 异 黄 酮 的 结 构 : 大 豆 苷 元 染 料 木 素 黄 豆 黄 素 和 它 们 的 共 轭 体 本 应 用 介 绍 了 使 用 反 相 UPLC-PDA 和 MS 检 测 器 快 速 检 测 和 鉴 定 大 豆 类 营 养 品 中 大 豆 异 黄 酮 葡 萄 糖 基 共 轭 体 的 方 法 实 验 条 件 将 大 豆 胶 囊 用 甲 醇 : 水 (9:1) 溶 液 超 声 处 理 10 分 钟 以 提 取 出 大 豆 异 黄 酮, 提 取 物 经 0.2µm 滤 膜 过 滤 质 谱 采 用 两 种 模 式 : 全 扫 描 (m/z50-550) 和 单 离 子 记 录 (SIR) 模 式 LC 条 件 LC 系 统 : 沃 特 世 (Waters )ACQUITY UPLC 系 统 色 谱 柱 : 柱 温 : 35 流 速 : 流 动 相 A: 流 动 相 B: 梯 度 : ACQUITY UPLC BEH C 8 柱, mm,1.7µm 500µL/min 含 0.2% 甲 酸 水 溶 液 甲 醇 25%B 0.4min, 在 1.1min 内 从 25-40%, 维 持 0.8min 表 1 相 应 每 个 质 荷 比 锥 孔 电 压 的 SIR 设 置 SIR1( 大 豆 苷 元 ) SIR2( 染 料 木 素 ) SIR3( 黄 豆 黄 素 ) 质 荷 比 锥 孔 电 压 质 荷 比 锥 孔 电 压 质 荷 比 锥 孔 电 压 分 析 结 果 及 讨 论 相 应 洗 脱 顺 序 为 : 葡 萄 糖 基 丙 二 酰 基 乙 酰 基 和 大 豆 异 黄 酮, 保 留 时 间 见 表 2 ACQUITY UPLC C 8 与 C 18 柱 相 比, C 8 柱 在 本 流 动 相 系 统 中 有 更 好 的 分 离 本 应 用 指 南 中 两 个 方 法 分 别 采 用 全 扫 描 方 式 和 目 标 化 合 物 选 择 性 离 子 检 测 的 SIR 方 式 全 扫 描 提 供 碎 片 形 式 的 质 谱 信 息 ( 图 2) 可 帮 助 进 行 结 构 确 定 和 鉴 定 未 知 化 合 物 采 用 全 扫 描 方 法 得 到 的 大 豆 苷 元 MS 谱 见 图 2 对 于 共 轭 的 大 豆 异 黄 酮 系 统, 列 出 共 轭 体 的 母 离 子 ([M + H] + : 质 荷 比 417) 和 大 豆 异 黄 酮 母 离 子 ([M + H] + : 质 荷 比 255) 质 荷 比 为 439 和 227 的 可 能 为 [M + Na] + 20

23 色谱分离专栏 SIR相对于全扫描数据提取 可以提供更多的灵敏度(图 表2 大豆异黄酮和它们共轭体的保留时间 保留时间 化合物 Daidzein Glucoside Glycitein Glucoside Genistein Glucoside Daidzein Malonyl Glucoside Glycitein Malonyl Glucoside Daidzein Acetyl Glucoside Glycitein Acetyl Glucoside Daidzein Genistein Acetyl Glucoside Glycitein Genistein Malonyl Glucoside Genistein [M+H] ) 更适合用于定量实验 图4 用SIR(上图)和全扫描提取离子模式(下图)得到的数据的信噪比 目前对大豆异黄酮的研究主要集中于染料木素和大豆苷 元的各种生物性质 临床研究也支持它们对健康的有益作用 串连四级杆MS的研究显示大豆异黄酮和它们的葡萄糖基 共轭物除了大豆异黄酮的[M+H]+以外还有共同的子离子 反应 路径(图5)显示子离子可能为[a+1] 大豆苷元 染料木素和黄 豆黄素的质荷比分别为 和167 用SIR模式可能可以看到[a+1]离子 SIR模式允许分离较高 锥电压能量被表1中三个离子选择 图2 大豆苷葡萄糖苷(大豆苷元)和大豆苷的谱图 ESI( )下母离子分别 为417和255 采用全扫描数据可以提取需要的离子 程序见图3A 质 荷比分别为 和285 相同的程序也可以由PDA检测器 在260nm实现 图5 大豆苷元的碎裂途径 结 图3 A 选择波长260nm 由TIC提取得到的全扫描大豆苷元 染料木素 和黄豆黄素质荷比离子MS数据 B SIR方法和大豆食品中染料木素的 各个离子 图3B显示的是染料木素和染料木素共轭体的选择离子 质荷比153是大豆异黄酮结构的子离子(见讨论) 21 论 本文中采用UV和MS运行了一个5.5min的方法 用全扫描 得到化合物的结构信息 SIR方法以其更好的灵敏度而更适合 用于定量 本应用介绍了保健食品中大豆异黄酮的分析方法 随着 对保健食品研究的不断深入 此方法对于分析功效成份在人 体内的生物利用度也具有非常重要的参考价值

24 [ 色 谱 分 离 专 栏 ] 浆 果 中 花 青 素 的 快 速 分 析 Andrew Aubin, Matthew Hynes, Patricia McConville 沃 特 斯 公 司,Milford,MA, 美 国 简 介 花 色 苷 是 广 泛 存 在 于 水 果 蔬 菜 中 的 一 类 天 然 色 素, 具 有 抗 氧 化 作 用, 有 益 于 身 体 健 康 已 报 导 的 食 物 中 的 花 色 苷 种 类 超 过 600 种, 直 接 分 析 这 些 化 合 物 非 常 具 有 挑 战 性 然 而, 不 同 的 花 色 苷 在 用 酸 水 解 后 可 转 化 成 一 种 花 青 素, 即 飞 燕 草 色 素 矢 车 菊 素 牵 牛 花 色 素 天 竺 葵 色 素 芍 药 花 青 素 和 锦 葵 花 素 的 一 种 通 过 分 析 花 青 素 来 评 价 花 色 苷 的 相 对 含 量 则 比 较 简 单 本 文 介 绍 了 使 用 沃 特 世 UPLC 系 统 建 立 的 反 相 分 析 方 法, 所 有 六 种 花 青 素 在 2.1 分 钟 内 全 部 实 现 了 基 线 分 离, 比 文 献 报 导 的 HPLC 方 法 快 近 20 倍 ( 图 1) 用 一 根 mm 1.7µm ACQUITY UPLC BEH C 18 柱, 使 用 1.00mL/min 流 速 进 行 分 离, 柱 温 为 40, 标 准 品 和 样 品 进 样 量 均 为 2µL 弱 洗 针 溶 液 是 95/5 的 水 / 乙 腈, 强 洗 针 溶 液 为 7/2/1 乙 腈 / 异 丙 醇 / 水 ; 流 动 相 组 成 和 梯 度 条 件 见 表 1 所 有 花 青 素 都 在 525nm 检 测, 数 据 采 集 速 度 20 点 / 秒, 过 滤 常 数 为 0.1 秒 校 正 曲 线 表 1 梯 度 条 件 时 间 (min) %A %B 曲 线 初 始 比 例 溶 剂 A=0.3% 磷 酸 溶 剂 B=100% 乙 腈 图 1 UPLC 分 离 六 种 花 青 素 实 验 材 料 和 方 法 实 验 材 料 新 鲜 和 冷 冻 的 浆 果 样 品 以 及 蓝 莓 干 是 从 超 市 购 买, 将 浆 果 冷 冻 保 存 ; 花 青 素 标 准 品 购 自 ChromaDex; 盐 酸, 磷 酸 和 乙 腈 购 自 Fisher Scientif c; 水 经 Milli-Q 系 统 纯 化 UPLC 条 件 ACQUITY UPLC 系 统 由 ACQUITY UPLC 二 元 溶 剂 管 理 系 统 (BSM), 配 10µL 定 量 环 的 ACQUITY UPLC 样 品 管 理 系 统 (SM) 和 ACQUITY UPLC 可 调 紫 外 (TUV) 检 测 器 组 成 所 有 仪 器 操 作 和 数 据 采 集 及 分 析 由 沃 特 世 Empower TM 2 软 件 控 制 将 矢 车 菊 素 牵 牛 花 色 素 天 竺 葵 色 素 芍 药 花 青 素 的 结 晶 标 准 品 溶 于 甲 醇 得 到 标 准 溶 液 (0.100mg/mL), 标 准 曲 线 的 七 个 点 浓 度 从 0.100mg/mL 到 0.001mg/mL; 飞 燕 草 色 素 由 于 没 有 晶 体 标 准 品, 将 购 得 的 样 品 溶 液 稀 释 后 作 为 标 准 溶 液, 并 配 制 七 个 浓 度 点 ( 与 前 面 相 同 ); 锦 葵 花 素 结 晶 标 准 品 溶 于 甲 醇 得 到 标 准 溶 液 (0.300mg/mL), 标 准 曲 线 的 五 个 浓 度 点 分 别 从 0.300mg/mL 到 0.001mg/mL, 对 每 种 花 青 素 都 建 立 校 正 曲 线 和 线 性 方 程, 相 关 系 数 R 2 均 大 于 样 品 制 备 提 取 和 酸 水 解 用 天 平 称 取 25±0.3g 浆 果 并 转 移 到 100mL 量 筒 中, 加 入 30mL 提 取 液 (80/20 乙 腈 /0.3% 磷 酸 水 溶 液 ), 将 浆 果 进 行 匀 浆 处 理 后 转 到 离 心 管 中,2500 rpm 离 心 10min; 移 取 2mL 上 清 液 到 4mL 具 塞 瓶 中, 加 入 200µL 浓 盐 酸, 涡 旋 混 合 5 秒 后 将 具 塞 瓶 置 于 烘 箱 中 加 热 30min ( 保 持 温 度 150±2 );30min 后, 将 具 塞 瓶 放 置 到 冰 箱 内 冷 藏 10min 以 停 止 水 解 反 应 将 样 品 从 冰 箱 里 取 出, 待 达 到 室 温 后, 用 0.45µm 滤 膜 过 滤, 保 存 于 2mL 样 品 瓶 中, 加 盖, 在 ACQUITY UPLC 系 统 上 进 行 分 析 22

25 色谱分离专栏 图4 野生低灌蓝莓的UPLC分离 图2 浆果中所有花青素成分的比较 结果和讨论 将经水解处理的浆果提取物的峰面积与标准曲线比较 用Empower 2软件计算每个成分的含量 这些含量反过来用于 计算浆果干重中的花青素初始浓度 见表3和4 每种浆果的 干重是通过将准确称量的15g浆果 置于烘箱中40 过夜以去 图5 冷冻黑莓的UPLC分离 除水分得到的重量 重量的改变被认为是由浆果中的水分减 少造成的 试验结果与Wu等发表的文献一致 从图2可见 每克干浆果中花青素总含量 低灌蓝莓最高 12.84±0.59mg/g 购买的干蓝莓含量最低 0.26±0.06mg/g 表3和4显示每种花青素的浓度和每种测试的浆果花青素总 含量 每种浆果测定三次 表3和4中的结果是三次实验的平 均值和标准差 蓝莓中花青素含量最好的一个原因见色谱图 3-8 蓝莓含有5种或6种花青素 而其他浆果只含有1 4种 花青素 值得注意的是 每种浆果含有一种花青素的含量高 图6 冷冻树莓的UPLC分离 于其他浆果 例如蓝莓 锦葵花素是其他花青素的两倍 此 外浆果中只有蓝莓含有锦葵花素 新鲜黑莓主要含有矢车 菊素 冷冻的黑莓含有矢车菊素和痕量天竺葵色素 黑莓中 的矢车菊素是其他浆果的2-3倍 草莓显示明显的天竺葵色 素峰 而天竺葵色素在其他浆果只是痕量 蔓越莓中芍药花 青素浓度是蓝莓的3-4倍 而其他浆果根本不含芍药花青素 树莓中的主要花青素是矢车菊素 但浓度也只是黑莓中的一 半 尽管这些差异使每种浆果具有各自独特的色谱 它们的 23 样品间仍然存在联系 每种浆果样品中都发现了矢车菊素 图7 冷冻草莓的UPLC分离 图3 低灌蓝莓的UPLC分离 图8 冷冻蔓越莓的UPLC分离

26 [ 色 谱 分 离 专 栏 ] 表 3 蓝 莓 样 品 定 量 比 较 花 青 素 有 机 野 生 蓝 莓 有 机 高 灌 蓝 莓 低 灌 蓝 莓 野 生 低 灌 蓝 莓 新 鲜 蓝 莓 购 买 的 干 蓝 莓 飞 燕 草 色 素 0.59 ± ± ± ± ± 矢 车 菊 素 1.59 ± ± ± ± ± ± 0.00 牵 牛 花 色 素 3.14 ± ± ± ± ± ± 0.01 天 竺 葵 色 素 0.03 ± ± ± 芍 药 花 青 素 0.67 ± ± ± ± ± ± 0.00 锦 葵 花 素 5.63 ± ± ± ± ± ± 0.05 总 含 量 (mg/g) ± ± ± ± ± ± 0.06 表 4 其 他 浆 果 样 品 的 定 量 比 较 花 青 素 冷 冻 黑 莓 新 鲜 黑 莓 冷 冻 树 莓 新 鲜 树 莓 冷 冻 草 莓 冷 冻 蔓 越 莓 飞 燕 草 色 素 ± 矢 车 菊 素 4.18 ± ± ± ± ± ± 0.30 牵 牛 花 色 素 ± ± 0.00 天 竺 葵 色 素 0.02 ± ± ± ± ± 0.00 芍 药 花 青 素 ± ± 0.43 锦 葵 花 素 总 含 量 (mg/g) 4.20 ± ± ± ± ± ± 0.73 结 论 所 测 试 的 浆 果 中 都 有 含 有 一 种 主 要 的 花 青 素, 蓝 莓 中 花 青 素 总 含 量 最 高, 而 低 灌 蓝 莓 是 所 有 蓝 莓 中 花 青 素 总 含 量 最 高 的 除 了 蓝 莓, 花 青 素 总 含 量 依 次 为 黑 莓 蔓 越 莓 树 莓 和 草 莓 ACQUITY UPLC 系 统 结 合 1.7µm 的 ACQUITY UPLC 色 谱 柱 技 术, 使 多 种 花 青 素 达 到 快 速 基 线 分 离, 在 保 持 分 离 度 的 同 时 极 大 地 缩 短 了 分 析 时 间 UPLC 技 术 的 高 分 离 度 和 高 效 率 能 够 为 天 然 产 物 研 究 提 供 更 多 的 支 持 和 创 新 24

27 [ 实 验 室 数 据 管 理 系 统 专 栏 ] 沃 特 世 NuGenesis SDMS 为 药 物 开 发 提 供 优 化 的 图 像 数 据 处 理 和 存 储 的 解 决 方 案 客 户 : 全 球 保 健 公 司 制 药 部 (Global Healthcare Company, Pharmaceutical Division) 背 景 解 决 方 案 全 球 保 健 公 司 制 药 部 一 直 致 力 于 药 物 的 开 发 和 商 品 化 工 作, 涉 及 的 治 疗 领 域 包 括 精 神 疾 病 神 经 错 乱 肠 胃 功 能 紊 乱 真 菌 感 染 过 敏 和 癌 症 等 作 为 一 个 以 创 新 为 动 力 的 公 司, 从 成 立 以 来 他 们 已 经 开 发 了 几 十 种 药 物 为 了 支 持 研 究 和 开 发 工 作, 公 司 使 用 了 很 多 分 析 技 术, 例 如 可 以 进 行 多 模 式 高 通 量 (HTS) 筛 查 的 平 板 显 微 镜 系 统 这 些 系 统 主 要 用 于 靶 物 质 的 鉴 别 确 认 含 量 测 定 方 法 开 发 高 通 量 筛 查 在 靶 物 质 中 寻 找 先 导 物 质 药 理 分 析 和 药 物 动 力 学 预 测 (ADMET) 分 析 等 这 些 分 析 中 产 生 的 大 量 数 据 一 般 都 以 电 子 图 像 形 式 存 在 的 挑 战 客 户 需 要 在 中 高 程 度 数 据 通 量 的 条 件 下 进 行 以 图 像 为 主 的 研 究 工 作 大 量 图 像 数 据 的 采 集 储 存 和 提 取 等 工 作 会 给 当 代 的 制 药 企 业 带 来 很 多 麻 烦 安 全 的 信 息 存 储 方 案 或 系 统 往 往 因 为 成 本 太 高 而 无 法 实 行, 除 非 这 个 系 统 设 计 地 非 常 完 美, 并 且 能 突 出 给 业 务 带 来 的 好 处 而 用 大 量 的 DVD 和 CD 来 备 份 数 据 的 方 法 则 限 制 了 对 有 价 值 的 信 息 的 访 问, 妨 碍 了 对 公 司 资 源 的 充 分 利 用 本 案 例 中 的 客 户 实 施 了 沃 特 世 (Waters ) NuGenesis 科 学 数 据 管 理 系 统 (SDMS),SDMS 可 以 自 动 地 将 来 源 于 仪 器 科 学 家 以 及 外 部 的 数 据 导 入 到 一 个 中 心 数 据 仓 库 中, 使 得 信 息 可 以 被 检 索, 在 科 学 家 之 间 交 流 和 共 享, 从 而 提 高 实 验 室 的 生 产 率 和 效 率, 加 强 法 规 遵 从 性, 加 快 产 品 开 发 的 速 度 在 本 案 例 中,NuGenesis SDMS 平 台 和 客 户 开 发 的 用 户 界 面 以 及 原 始 数 据 归 档 策 略 整 合 在 一 起, 原 始 数 据 归 档 策 略 是 经 过 精 心 制 定 和 测 试 才 得 到 的, 组 成 了 一 个 科 学 图 像 数 据 管 理 系 统 (SIDMS) SIDMS 为 使 用 图 像 数 据 提 供 了 最 优 化 的 支 持 使 工 作 环 境 从 本 地 工 作 站 升 级 到 客 户 化 的 统 一 的 工 作 台, 同 时 它 也 依 赖 于 连 接 各 个 建 筑 物 之 间 的 GB 级 的 网 络 这 个 系 统 能 够 成 功 的 关 键 与 其 采 用 并 整 合 了 一 个 进 行 大 量 图 像 数 据 存 储 管 理 的 系 统 有 关, 这 就 是 先 进 数 字 信 息 公 司 (ADIC) 的 完 整 数 据 生 命 周 期 管 理 系 统, 同 时 它 也 是 一 个 可 以 负 担 得 起 的 系 统 在 ADIC 的 帮 助 下, 通 过 储 存 区 域 的 网 络, 从 连 接 多 个 不 同 设 备 的 多 个 操 作 系 统 中 采 集 得 到 数 据 原 始 数 据 文 件 通 过 NuGenesis SDMS 自 动 文 件 数 据 采 集 器 进 行 采 集 并 建 立 索 引 ;SDMS 提 供 了 对 在 线 数 据 和 归 档 数 据 的 集 中 管 理 SDMS 的 离 线 存 储 管 理 器 (OSM) 提 供 了 对 ADIC 储 存 区 域 网 络 和 磁 带 库 系 统 的 控 制 一 个 客 户 化 的 统 一 的 工 作 台 将 需 要 的 文 件 从 归 档 区 域 提 取 到 本 地 的 工 作 站 上 恢 复 服 务 功 能 具 有 很 强 的 容 错 能 力, 并 充 分 利 用 了 连 接 系 统 各 个 组 件 间 的 25

28 [ 实 验 室 数 据 管 理 系 统 专 栏 ] 高 速 网 络 由 于 数 据 量 非 常 大, 所 以 连 接 各 个 客 户 端 服 务 器 和 离 线 存 储 系 统 的 网 络 系 统 升 级 到 了 专 用 的 1GB 的 网 络 NuGenesis SDMS 软 件 开 发 工 具 包 (SDK) 被 用 来 开 发 出 了 一 个 整 合 工 具, 来 构 建 SDMS 与 ADIC 间 的 接 口 同 时, 还 增 加 了 大 图 像 数 据 集 上 传 与 下 载 的 功 能 在 800 GB 的 数 据 基 础 上 反 复 进 行 的 测 试 表 明, 系 统 采 集 数 据 到 ADIC 系 统 的 速 度 可 以 达 到 每 小 时 采 集 5 GB, 从 ADIC 系 统 恢 复 数 据 到 客 户 端 上 的 速 度 可 以 达 到 每 小 时 7 GB 假 设 系 统 的 运 行 时 间 是 50%, 那 么 它 就 可 以 提 供 每 周 采 集 400 GB 以 及 恢 复 600 GB 数 据 量 的 能 力 对 业 务 的 益 处 科 学 图 像 数 据 管 理 系 统 的 成 功 实 施 使 得 公 司 大 容 量 图 像 数 据 的 储 存 有 了 革 命 性 的 提 高, 同 时 其 成 本 也 在 可 接 受 的 范 围 内 NuGenesis 和 ADIC 两 种 技 术 的 整 合 实 际 上 可 以 为 任 何 类 型 的 科 学 数 据 管 理 服 务 这 些 益 处 包 括 : 替 代 了 分 散 的 无 法 有 效 管 理 的 DVD/CD 数 据 管 理 方 式 提 升 了 为 图 像 采 集 和 处 理 所 进 行 投 资 的 价 值 离 线 图 像 数 据 处 理 的 方 式, 提 高 了 高 通 量 筛 选 的 能 力, 通 过 对 图 像 数 据 的 再 处 理 也 能 够 得 到 更 多 有 价 值 的 结 果 通 过 沃 特 世 NuGenesis SDMS 和 ADIC 的 战 略 整 合 而 形 成 的 SIDMC 解 决 方 案 为 客 户 提 供 了 一 个 统 一 的 工 作 台, 可 也 将 图 像 数 据 直 接 送 到 研 究 人 员 的 手 中, 其 灵 活 性 使 得 从 一 端 到 另 一 端 的 数 据 管 理 流 程 完 全 透 明 化, 并 通 过 测 试 证 明 其 功 能 和 性 能 已 经 远 远 超 过 了 开 始 设 定 的 安 全 性 和 高 通 量 目 标 沃 特 世 实 验 室 信 息 系 统 解 决 方 案 包 沃 特 世 NuGenesis SDMS 作 为 功 能 强 大 经 过 实 践 证 明 的 沃 特 世 实 验 室 信 息 系 统 解 决 方 案 包 的 一 部 分, 极 大 地 提 高 了 客 户 处 理 重 要 分 析 数 据 和 知 识 的 能 力, 从 而 提 供 了 生 产 率 和 效 率 沃 特 世 实 验 室 信 息 系 统 解 决 方 案 包 整 合 了 所 有 的 实 验 室 数 据 源 无 论 是 仪 器 还 是 人 员, 进 行 数 据 的 采 集 分 类, 并 使 所 有 的 科 学 信 息 都 能 被 访 问 从 色 谱 图 光 谱 图 到 化 学 结 构 ; 从 首 席 研 究 人 员 的 想 法 到 支 持 专 利 的 知 识 产 权 这 些 的 软 件 包 括 : 用 于 色 谱 数 据 分 析 的 Empower 2 软 件 用 于 高 级 质 谱 计 算 的 MassLynx 软 件 用 于 电 子 化 管 理 实 验 室 记 录 本 数 据 的 elab Notebook 用 于 整 个 企 业 科 学 数 据 管 理 的 NuGenesis SDMS 软 件 用 于 分 析 实 验 室 流 程 在 线 管 理 的 Analytical Workflow Manager 26

29 [ 新 技 术 新 产 品 ] 新! 沃 特 世 饮 用 水 分 析 解 决 方 案 : 自 动 化 AquaAnalysis 系 统 基 于 液 相 色 谱 的 系 统 将 分 析 时 间 从 三 到 五 个 小 时 减 少 到 30 分 钟 沃 特 世 公 司 (NYSE: WAT) 今 天 发 布 新 型 沃 特 世 (Waters ) AquaAnalysis 系 统, 一 个 设 计 完 整 的 系 统 方 案 用 于 检 测 饮 用 水 中 的 杀 虫 剂 以 及 其 他 物 质 同 时 该 方 案 满 足 或 者 超 越 了 世 界 性 法 规 的 要 求 因 此 实 验 室 可 以 通 过 缩 短 分 析 时 间, 自 3 至 5 小 时 到 30 分 钟, 而 提 高 样 品 通 量 80% 世 界 上 新 的 饮 用 水 法 规 增 加 了 对 水 测 定 的 需 要, Joe Romano, 沃 特 世 公 司 化 学 分 析 部 资 深 经 理 说, AquaAnalysis 系 统 拥 有 降 低 实 验 室 对 于 饮 用 水 样 品 制 备 的 劳 动 强 度, 并 使 分 析 过 程 自 动 化 更 重 要 的 是, 新 设 施 符 合 所 有 发 达 国 家 的 法 规 要 求 由 于 新 法 规, 需 要 分 析 的 样 品 数 目 不 断 增 加, 而 最 低 残 留 物 水 平 检 测 限 不 断 降 低 为 了 满 足 灵 敏 度 的 要 求,AquaAnalysis 系 统 能 够 测 定 低 于 10ppt 的 目 标 分 析 物, 轻 松 的 满 足 或 超 过 各 国 的 法 规 标 准 此 外,AquaAnalysis 系 统 采 用 平 行 分 析 系 统, 制 备 第 二 个 样 品 的 同 时, 分 析 第 一 个 样 品, 增 加 实 验 室 产 量 低 容 量 的 系 统 在 进 行 批 操 作 的 时 候, 需 要 技 术 员 从 每 个 样 品 测 定 的 开 始 到 结 束 都 守 候 在 边 同 样, 相 对 于 1L 样 品 量, 新 的 AquaAnalysis 系 统 仅 需 20mL 体 积 样 品, 大 大 减 少 样 品 上 样 和 处 理 中 的 消 耗 AquaAnalysis 系 统 正 在 全 球 范 围 内 销 售 AquaAnalysis 系 统 27

30 [ 新 技 术 新 产 品 ]

31 沃 特 世 科 技 ( 上 海 ) 有 限 公 司 地 址 : 上 海 市 浦 东 新 区 张 东 路 1387 号 41 栋 01 室 邮 编 : 电 话 : 传 真 : 北 京 分 公 司 地 址 : 北 京 市 朝 阳 区 八 里 庄 西 里 98 号 住 邦 2000 商 务 中 心 3 号 楼 22 层 邮 编 : 电 话 : 传 真 : 广 州 分 公 司 地 址 : 广 东 省 广 州 市 流 花 路 中 国 大 酒 店 商 业 大 厦 室 邮 编 : 电 话 : 传 真 : 沃 特 斯 中 国 有 限 公 司 地 址 : 香 港 九 龙 柯 士 甸 道 102 号 901 室 电 话 : 传 真 : 免 费 售 后 服 务 热 线 : 800 (400) 沃 特 世 公 司 中 国 印 刷 2007 年 12 月 86GN00007CN 沃 特 世 公 司 版 权 所 有