此 外, 每 组 样 品 的 分 析 都 是 在 单 一 液 相 色 谱 系 统 中 运 行 标 准 样 品, 质 控 样 品 和 待 研 究 样 品 的 分 析 都 是 在 同 一 个 硬 件 上 完 成 与 一 台 通 过 阀 切 换 的 液 相 色 谱 质 谱 没 本 质 区 别 只 要 实
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- 晚筌 金
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1 新 闻 液 相 色 谱 质 谱 联 用 仪 新 型 高 通 量 前 端 系 统 质 谱 ( MS ) 技 术 应 用 于 药 物 发 现 已 有 数 十 年 从 以 往 来 看, 仪 器 产 生 的 数 据 大 大 超 过 软 件 处 理 的 能 力 近 年 来, 软 件 的 速 度 和 分 析 能 力 大 大 提 高, 促 使 仪 器 制 造 商 转 向 提 高 系 统 的 效 率 和 通 量 这 大 大 提 高 了 质 谱 前 面 分 离 技 术 的 革 新, 比 如 从 液 相 色 谱 发 展 到 高 压 液 相 色 谱 以 及 超 高 压 液 相 色 谱 最 进 前 端 技 术 的 发 展 侧 重 于 提 高 质 谱 的 效 率, 一 般 是 提 高 进 样 速 度 和 质 谱 分 析 速 度 如 最 近 开 发 的 多 维 液 相 色 谱 技 术 (LC) 和 激 光 二 极 管 热 解 析 技 术 ( LDTD ), 二 者 都 是 通 过 增 加 质 谱 仪 有 效 检 测 数 据 的 时 间, 并 最 大 限 度 减 少 其 空 闲 时 间, 从 而 达 到 提 高 效 率 的 目 的 为 实 验 室 选 择 最 佳 的 高 通 量 技 术 需 要 认 真 考 虑 对 通 量 的 要 求 以 及 技 术 的 特 点 当 评 估 多 维 液 相 色 谱 和 激 光 二 极 管 热 解 析 时, 科 学 家 至 少 应 考 虑 三 个 主 要 问 题 : 速 度, 灵 敏 度 和 系 统 易 优 化 性 本 文 介 绍 了 两 种 技 术 的 基 本 原 则, 并 比 较 他 们 在 两 个 共 同 的 药 物 发 现 应 用 中 的 性 能 前 端 可 替 代 技 术 多 维 液 相 色 谱 多 维 液 相 色 谱 系 统 是 使 用 多 于 一 个 的 高 效 液 相 色 谱 将 样 品 注 射 到 单 一 的 质 谱 仪, 使 其 提 高 通 量 每 个 通 道 可 以 独 立 操 作, 用 户 在 所 有 四 个 通 道 可 以 同 时 运 行 相 同 的 方 法, 或 者 每 个 通 道 都 有 不 同 的 方 法 双 通 道 系 统 的 通 量 是 单 液 相 色 谱 通 量 的 一 倍, 而 一 个 四 通 道 系 统 的 通 量 是 其 四 倍, 将 质 谱 的 空 闲 时 间 从 百 分 之 七 十 五 减 至 百 分 之 四 多 维 液 相 色 谱 系 统 最 大 程 度 地 利 用 质 谱 仪, 使 质 谱 几 乎 没 有 空 闲 时 间 多 维 液 相 色 谱 技 术 有 很 多 优 点 最 重 要 的 是 没 有 通 过 牺 牲 色 谱 分 离 而 提 高 了 样 品 的 通 量 因 为 每 一 路 的 液 相 色 谱 的 操 作 是 分 开 和 平 行 的, 在 整 个 洗 脱 步 骤 中, 质 谱 是 对 单 个 样 品 进 行 分 析, 在 整 个 过 程 中 保 持 数 据 质 量 和 灵 敏 度 软 件 可 以 控 制 泵 的 操 作, 阀 切 换, 清 洗 和 梯 度 程 序
2 此 外, 每 组 样 品 的 分 析 都 是 在 单 一 液 相 色 谱 系 统 中 运 行 标 准 样 品, 质 控 样 品 和 待 研 究 样 品 的 分 析 都 是 在 同 一 个 硬 件 上 完 成 与 一 台 通 过 阀 切 换 的 液 相 色 谱 质 谱 没 本 质 区 别 只 要 实 验 设 计 合 理, 多 维 液 相 色 谱 系 统 的 日 内 和 日 间 精 密 度 和 准 确 度 都 可 以 满 足 LC-MS/MS 的 公 认 标 准 激 光 二 极 管 热 解 析 激 光 二 极 管 热 解 析 与 液 相 色 谱 是 根 本 不 同 的, 因 为 它 不 需 要 液 相 激 光 二 极 管 热 解 析 是 将 2-10µL 的 样 品 注 入 到 96 孔 板 中 每 一 个 孔 底 部 植 入 一 块 金 属 将 该 盘 室 温 干 燥 用 激 光 二 极 管 加 热 孔, 使 干 燥 的 样 品 迅 速 产 生 热 解 析 完 整 的 热 解 析 分 子 被 载 气 带 入 到 大 气 压 化 学 电 离 区 域 进 行 离 子 化 大 气 压 化 学 电 离 不 需 要 溶 剂 或 流 动 相 就 可 以 完 成, 这 改 变 了 离 子 化 的 特 征, 可 以 分 析 那 些 在 普 通 大 气 压 化 学 电 离 不 能 有 效 离 子 化 的 化 合 物 热 解 吸 能 产 生 完 整 的 解 吸 附 分 子, 温 度 低 于 熔 点 激 光 二 极 管 热 解 析 的 性 能 源 于 高 的 加 热 速 率, 载 气 流 量 以 及 高 灵 敏 度 激 光 二 极 管 热 解 析 消 除 了 样 品 交 叉 污 染 的 风 险, 不 需 使 用 色 谱 技 术 如 高 效 液 相 色 谱 此 外, 它 还 没 有 由 流 动 相 引 起 的 背 景 噪 音, 或 基 质 效 应 ( 如 MALDI), 而 且 样 品 制 备 也 非 常 简 单, 每 孔 只 需 要 2-10µL 样 品 然 后 进 行 快 速 溶 剂 蒸 发 而 且 不 需 要 在 样 品 中 添 加 任 何 的 基 质 比 较 选 择 一 个 高 通 量 的 前 端 系 统 很 大 程 度 上 取 决 于 三 个 重 要 变 量 : 速 度, 灵 敏 度, 易 优 化 特 点 因 为 激 光 二 极 管 热 解 析 不 需 要 物 理 化 学 分 离, 所 以 它 比 多 维 液 相 要 快 但 不 灵 敏 激 光 二 极 管 热 解 析 处 理 一 个 样 品 需 要 7-8 秒 而 多 维 液 相 色 谱 系 统 需 要 25 秒 对 于 许 多 用 户, 这 个 微 不 足 道 的 差 异 可 以 忽 略 不 计, 在 1 分 钟 以 内 都 是 可 以 接 受 的 虽 然 激 光 二 极 管 热 解 析 方 法 提 供 更 快 的 速 度, 但 是 没 有 物 理 分 离 有 一 个 缺 点 : 低 灵 敏 度 例 如 睾 丸 酮 4- 羟 基 代 谢 产 物 和 6- 羟 基 代 谢 产 物 有 同 样 的 分 子 量 当 用 液 相 色 谱 时 它 们 只 是 物 理 分 离, 两 个 峰 有 不 同 的 保 留 时 间, 使 得 他 们 可 以 清 晰 的 区 分 开 并 且 实 现 定 量 用 激 光 二 极 管 热 解 析 进 行 同 样 的 实 验 时,4- 羟 基 代 谢 产 物 和 6- 羟 基 代 谢 产 物 同 时 洗 脱 下 来 ( 同 时 解 吸 附 ), 不 可 能 对 每 个 代 谢 物 实 现 单 独 定 量
3 系 统 易 优 化 的 特 性 是 多 维 液 相 色 谱 和 激 光 二 极 管 热 解 析 又 一 个 不 同 系 统 优 化 实 际 上 是 为 了 确 定 理 想 参 数 的 一 个 过 程 例 如 对 于 一 个 质 谱 实 验 来 说, 有 必 要 优 化 S 透 镜 电 压, 碰 撞 能 量, 和 前 体 离 子 和 产 物 离 子 的 分 子 量 当 前 端 采 用 多 维 液 相 色 谱, 可 用 注 入 模 式 优 化 质 谱 的 参 数 将 化 合 物 以 一 定 速 率 和 浓 度 泵 入 质 谱 中, 软 件 会 自 动 改 变 质 谱 参 数, 监 控 结 果, 自 动 找 到 最 优 的 设 置 当 前 端 采 用 激 光 二 极 管 热 解 析, 可 采 用 环 注 射 优 化 获 得 最 佳 质 谱 参 数 由 于 热 解 吸 没 有 提 供 一 个 统 一 的 样 品 浓 度, 用 软 件 自 动 优 化 时 是 很 困 难 的 在 环 注 射 优 化 模 式 下, 当 样 品 浓 度 和 质 谱 参 数 同 时 改 变 的 时 候, 很 难 确 定 绝 对 好 的 参 数 显 然, 多 维 液 相 色 谱 和 激 光 二 极 管 热 解 析 都 是 不 错 的 分 析 方 法 哪 一 个 更 适 合 这 个 问 题 取 决 于 是 实 验 室 的 需 求 : 是 追 求 更 快 的 速 度 还 是 追 求 更 好 的 灵 敏 度? 应 用 早 期 评 估 候 选 药 物 的 吸 收, 分 布, 代 谢 和 排 泄 ( ADME ) 是 药 物 发 现 的 一 个 必 不 可 少 的 组 成 部 分 ADME 特 征 可 帮 助 识 别 人 体 药 物 代 谢 动 力 学 好 的 一 面 和 坏 的 一 面 采 用 两 种 常 见 的 实 验 - 细 胞 色 素 P450 和 代 谢 稳 定 性 - 比 较 多 维 液 相 色 谱 和 激 光 二 极 管 热 解 析 两 种 方 法 在 药 物 发 现 的 过 程 中 关 键 一 步 是 鉴 别 可 能 的 药 物 药 物 相 互 作 用 主 要 原 因 在 于 这 些 相 互 作 用 的 药 物 会 与 细 胞 色 素 P450 的 同 功 酶 发 生 竞 争 抑 制, 这 通 常 用 细 胞 色 素 P450 的 抑 制 方 法 来 检 测 细 胞 色 素 P450 的 检 测 方 法 非 常 易 懂 且 已 标 准 化, 一 旦 优 化 好 检 测 细 胞 色 素 P450 的 探 针 化 合 物 的 质 谱 参 数, 就 可 以 很 方 便 的 检 测 一 次 优 化 针 对 一 个 探 针 化 合 物, 一 旦 优 化 好, 则 不 需 要 更 改 参 数 化 合 物 浓 度 通 常 在 治 疗 水 平 代 谢 物 的 浓 度 非 常 低, 因 此 需 要 高 灵 敏 度 地 方 法 来 进 行 检 测 代 谢 稳 定 性 试 验 是 研 究 随 着 时 间 的 推 移 化 合 物 的 代 谢, 以 确 定 该 化 合 物 的 体 外 半 衰 期 在 该 方 法 中 化 合 物 的 浓 度 比 细 胞 色 素 P450 浓 度 要 高 得 多 ; 因 此, 对 灵 敏 度 的 要 求 不 是 特 别 大 然 而, 在 一 天 内 需 要 对 多 个 化 合 物 进 行 测 试, 因 此 每 一 个 都 需 要 优 化, 因 此 易 优 化 的 特 性 是 非 常 重 要 的 激 光 二 极 管 热 解 析 在 细 胞 色 素 P450 的 应 用
4 在 最 近 的 一 次 应 用 LDTD 技 术 检 测 通 量 能 力 的 实 验 中, 研 究 人 员 用 Phytronix Technologies 公 司 的 LDTD 源 耦 合 Thermo Scientific 三 重 四 级 杆 质 谱 仪 进 行 检 测 研 究 者 观 察 到 8 个 代 谢 物 对 9 个 抑 制 剂 浓 度 进 行 了 测 试, 在 每 一 个 抑 制 剂 浓 度 下 检 测 形 成 的 代 谢 产 物 计 算 了 酶 活 性 并 绘 制 成 图 在 8 个 代 谢 物 中, 其 中 有 一 个 由 于 发 生 源 内 裂 解 没 有 鉴 定 到 在 进 行 LDTD 实 验 中, 所 有 9 个 异 构 体 都 放 入 到 同 一 个 样 品 中, 样 品 检 测 时 间 为 15 秒 在 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 中 同 样 进 行 细 胞 色 素 抑 制 试 验, 该 系 统 有 一 个 标 准 非 多 维 的 液 相 色 谱 耦 合 应 用 生 物 系 统 的 API4000 离 子 源 样 品 根 据 不 同 的 亲 油 性 分 为 3 组 样 品 检 测 时 间 为 6 分 钟 研 究 人 员 发 现, 两 种 方 法 的 数 据 是 有 可 比 性 的, 而 且 用 LDTD 系 统 检 测 混 合 样 品 可 以 减 少 时 间 并 节 省 成 本 由 于 样 品 检 测 的 速 度 大 约 为 15 秒,, 因 此 完 成 96 孔 板 的 所 有 样 品 检 测 也 只 需 要 24 分 钟 由 于 可 能 的 源 内 裂 解, 非 那 西 丁 形 成 对 乙 酰 氨 基 酚, 研 究 人 员 得 出 结 论, 液 相 色 谱 串 联 质 谱 (LC-MS/MS) 有 更 大 的 选 择 性 代 谢 稳 定 性 研 究 : 高 效 液 相 色 谱 和 多 维 高 效 液 相 色 谱 代 谢 稳 定 性 的 定 义 是 母 体 化 合 物 的 百 分 比 在 代 谢 活 性 测 试 系 统 随 时 间 推 移 丢 失 的 量 对 于 代 谢 稳 定 实 验, 典 型 的 测 试 系 统 是 肝 微 粒 体, 肝 S9, 肝 细 胞 ( 贴 壁 或 悬 浮 ), 一 般 根 据 实 验 目 标 不 同 选 择 不 同 的 测 试 系 统 为 了 确 定 一 个 新 化 学 实 体 的 代 谢 稳 定 性, 需 要 对 孵 育 上 清 中 的 候 选 药 物 进 行 定 量, 这 项 工 作 通 常 是 由 高 效 液 相 色 谱 质 谱 完 成 通 过 了 解 化 合 物 的 代 谢 稳 定 性, 可 以 对 化 合 物 进 行 排 序, 可 以 使 候 选 药 物 由 于 药 动 原 因 失 败 的 几 率 大 大 降 低 最 近 的 一 项 研 究 表 明, 当 进 行 代 谢 稳 定 实 验 的 时 候, 通 过 自 动 优 化 和 多 维 液 相 色 谱, 通 量 可 以 显 著 提 高 Thermo Scientific Aria TLX-4 液 相 色 谱 系 统,Thermo Scientific QuickQuan 自 动 优 化 软 件, 在 加 上 TSQ Quantum Ultra 三 重 四 级 杆 质 谱 仪 可 以 现 在 鉴 定 优 化 时 间, 并 提 高 样 品 通 量, 而 不 牺 牲 谱 图 质 量 对 8 个 化 合 物 分 别 用 自 动 优 化 和 手 动 优 化 进 行 比 较, 一 维 液 相 色 谱 和 多 维 液 相 色 谱 进 行 比 较 采 用 单 高 效 液 相 色 谱 质 谱 系 统 和 手 动 优 化 模 式 分 析 样 品 ; 采 用 四 通 道 多 维 液 相 色 谱 质 谱 系 统 和 自 动 优 化 模 式 分 析 样 品 二 者 的 准 确 度 与 理 论 值 相 比 小 于 10%, 精 密 度 RSD<10%
5 采 用 手 动 优 化 的 模 式 大 约 花 了 2 个 小 时, 平 均 15 分 钟 一 个 化 合 物 而 自 动 优 化 总 共 才 花 了 16 分 钟, 平 均 2 分 钟 一 个 化 合 物 提 高 了 7 倍 的 时 间 在 单 通 道 液 相 色 谱 系 统 中 运 行 时 间 需 要 48 个 小 时 而 在 四 通 道 多 维 液 相 色 谱 系 统 只 需 要 12 个 小 时 运 行 时 间 提 高 了 4 倍 研 究 者 得 出 结 论 自 动 优 化 和 多 维 高 效 液 相 色 谱 系 统 能 够 显 著 提 高 通 量, 而 不 损 失 数 据 质 量 结 论 LDTD 和 多 维 液 相 色 谱 在 药 物 发 现 的 实 验 中 都 能 提 高 通 量 多 维 液 相 色 谱 提 供 更 高 的 灵 敏 度 ( 如 细 胞 色 素 P450), 并 且 易 于 优 化, 对 于 每 天 分 析 多 个 样 品 是 很 实 用 的 LDTD 能 够 提 供 高 通 量, 可 以 使 用 户 在 一 天 内 分 析 更 多 的 样 品, 而 且 可 以 快 速 得 到 结 果 然 而, 自 动 优 化 不 是 很 准 确 实 验 室 必 须 根 据 对 速 度 灵 敏 度 和 易 用 性 的 要 求 进 行 评 估 参 考 文 献 (1) Wernevik, J.; Landin, A.; Tremblay, P. LDTD-MS/MS and LC-MS/MS comparison for high throughput IC50 determination of CYP2A6, 2B6, 2C9, 2C19, 2D6 and 3A4 inhibition in Human Liver Microsomes (HLM). 28th Montreux Symposium on LC/MS, Montreux, Switzerland, Nov , (2) Yan, Z., Caldwell, G. Evaluation of Cytochrome P450 Inhibition in Human Liver Microsomes. In Methods in Pharmacology and Toxicology, Optimization in Drug Discovery: In Vitro Methods; Yan, Z., Caldwell, G. Eds.; Humana Press Inc.: Totowa, NJ, 2004; pp 231. (3) Ackley, D.; Rockich, K.; Baker, T. Metabolic Stability Assessed by Liver Microsomes and Hepatocytes. In Methods in Pharmacology and Toxicology, Optimization in Drug Discovery: In Vitro Methods; Yan, Z., Caldwell, G. Eds.; Humana Press Inc.: Totowa, NJ, 2004; pp 151. (4) Berube, M. High Throughput LC-MS/MS Analysis of Metabolic Stability Incubations, Application Note 458; Thermo Fisher Scientific: Franklin, MA, April 2009.
6 TSQ Quantum Ultra, Aria, 和 QuickQuan 是 赛 默 飞 世 尔 科 技 旗 下 产 品 LDTD 是 Phytronix Technologies 旗 下 品 牌 Thermo Scientific 是 世 界 领 先 的 赛 默 飞 世 尔 科 技 的 重 要 品 牌 关 于 赛 默 飞 世 尔 科 技 (Thermo Fisher Scientific) 赛 默 飞 世 尔 科 技 有 限 公 司 (Thermo Fisher Scientific Inc.)( 纽 约 证 交 所 代 码 :TMO) 是 全 球 科 学 服 务 领 域 的 领 导 者, 致 力 于 帮 助 客 户 使 世 界 变 得 更 健 康 更 清 洁 更 安 全 公 司 年 度 营 收 达 到 105 亿 美 元, 拥 有 员 工 34,000 多 人, 为 350,000 多 家 客 户 提 供 服 务 这 些 客 户 包 括 : 医 药 和 生 物 技 术 公 司 医 院 和 临 床 诊 断 实 验 室 大 学 研 究 院 和 政 府 机 构 以 及 环 境 与 工 业 过 程 控 制 装 备 制 造 商 等 该 公 司 借 助 于 Thermo Scientific 和 Fisher Scientific 这 两 个 主 要 品 牌, 帮 助 客 户 解 决 从 常 规 测 试 到 复 杂 的 研 发 项 目 中 所 面 临 的 各 种 分 析 方 面 的 挑 战 Thermo Scientific 能 够 为 客 户 提 供 一 整 套 包 括 高 端 分 析 仪 器 实 验 室 装 备 软 件 服 务 耗 材 和 试 剂 在 内 的 实 验 室 工 作 流 程 综 合 解 决 方 案 Fisher Scientific 则 提 供 了 一 系 列 用 于 卫 生 保 健, 科 学 研 究, 以 及 安 全 和 教 育 领 域 的 实 验 室 装 备 化 学 药 品 以 及 其 他 用 品 和 服 务 赛 默 飞 世 尔 科 技 将 努 力 为 客 户 提 供 最 为 便 捷 的 采 购 方 案, 为 科 研 的 飞 速 发 展 不 断 地 改 进 工 艺 技 术, 并 提 升 客 户 价 值, 帮 助 股 东 提 高 收 益, 为 员 工 创 造 良 好 的 发 展 空 间 欲 获 取 更 多 信 息, 请 登 陆 : 英 文 ), ( 中 文 ) ###
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