标题

Size: px

Start display at page:

Download "标题"

免韵靳
5 years ago
Views:

1 中华人民共和国国家标准 GB 食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定发布实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布

2 前言本标准代替 GB/T 贝类中腹泻性贝类毒素的测定 SC/T 腹泻性贝类毒素的测定生物法 SN/T 进出口贝肉中大田软海绵酸的检测液相色谱 - 串联质谱法 SN/T 进出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法第 2 部分 : 小鼠生物法 SN/T 贝类中腹泻性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附法 SN/T 进出口贝类腹泻性贝类毒素检测方法第 1 部分 : 荧光磷酸酶抑制法本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 标准名称修改为食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定 ; 增加了酶联免疫吸附法 ; 增加了液相色谱 - 串联质谱法 Ⅰ

3 食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定 1 范围本标准规定了贝类中腹泻性贝类毒素测定的小鼠生物法, 酶联免疫吸附法和液相色谱 - 串联质谱法本标准中小鼠生物法和酶联免疫吸附法适用于贝类及其制品中腹泻性贝类毒素的测定, 液相色谱 - 串联质谱法适用于贝类可食部分及其制品 ( 不包括盐渍制品 ) 中腹泻性贝类毒素大田软海绵酸 (OA) 鳍藻毒素 -1(DTX-1) 和鳍藻毒素 -2(DTX-2) 的测定小鼠生物法 2 原理用丙酮提取贝类中腹泻性贝类毒素 (DSP), 经无水乙醚分配, 减压蒸干后, 再以含 1% 吐温 -60 的生理盐水为分散介质, 制成 DSP 混悬液将该混悬液注射入小鼠腹腔, 观察小鼠存活情况, 计算其毒力 3 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB/T6682 规定的一级水 3.1 试剂丙酮 (C3H6O) 无水乙醚 (C4H10O) 吐温 -60(C64H126O26) 氯化钠 (NaCl) 3.2 试剂配制氯化钠溶液 (0.85%): 称取 0.85gNaCl, 加水溶解并定容至 100mL 吐温 -60(1%): 称取 1.0g 吐温 -60, 用氯化钠溶液 (0.85%) 溶解并定容至 100mL 3.3 材料小鼠 : 体重为 16g~20g 的健康 ICR 品系雄性小鼠金属筛网 : 孔径约 2mm 4 仪器和设备 4.1 旋转蒸发器 1

4 4.2 均质器 4.3 天平 : 感量为 0.1g 5 分析步骤注 : 为避免毒素的危害, 应戴手套进行操作移液管及移液器吸头等用过的器材废弃的提取液等应在次氯酸钠溶液 (5%) 浸泡 1h 以上以使毒素分解对于动物实验过程中产生的污水废弃物及动物尸体处理, 应参照 GB14925 执行 5.1 样品采集采取足够的贝类样品个数, 并使贝肉达 400g 以上远离实验室不能及时送检的样品, 除了在常温下品质不会发生变化的, 应将样品置于保温盒中冷冻送检, 或采取必要措施保证其处于低温状态 (0 ~10 ) 送检如为带壳样品, 应开壳, 去除水分后冷冻送检 5.2 试样制备生鲜带壳样品用清水彻底洗净贝类样品外表, 切断闭壳肌, 开壳, 用清水淋洗内部去除泥沙及其他异物, 取出贝肉严禁以加热或药物方法开壳注意不要破坏闭壳肌以外的组织, 尤其是中肠腺 ( 中肠腺又称消化盲囊, 组织呈暗绿色或褐绿色 ) 将去壳贝肉置于孔径约 2mm 的金属筛网上, 沥水 5min 将贝肉剪碎冷冻样品在室温下使冷冻样品融化呈半冷冻状态带壳冷冻的样品按方法清洗开壳淋洗取肉, 除去贝肉外部附着的冰片, 抹去水分将贝肉剪碎 5.3 试样提取称取 200g 剪碎的贝肉试样置于均质杯中, 按体积比加 3 倍量丙酮后均质 2 min 以上将均质好的物质倒入布氏漏斗中抽滤, 收集滤液分别用残渣 2 倍量的丙酮再清洗残渣两次, 滤液与上述滤液合并将滤液移入 500mL 的圆底烧瓶中,56 ±1 下, 减压浓缩去除丙酮直至在液体表面分离出油状物用 100mL~200mL 无水乙醚溶解油状物, 倒入分液漏斗内, 再用少量无水乙醚清洗圆底烧瓶, 合并倒入分液漏斗内, 以少量的水洗下粘壁部分, 轻轻振荡 ( 不能生成乳浊液 ), 静置分层后去除水层 ( 下层 ) 用相当乙醚半量的水洗乙醚层两次, 去除水层, 再将乙醚层移入 250mL 或 500mL 的圆底烧瓶中, 于 35 ±1 减压浓缩去除乙醚用少量无水乙醚将浓缩物移入 50mL 或 100mL 圆底烧瓶中, 再次减压浓缩去除乙醚用 1% 吐温 -60 的生理盐水将全部浓缩物转移至刻度试管中稀释到 10 ml, 充分振摇, 制成均匀混悬液 1mL 该混悬液相当于 20g 试样, 以此混悬液为试验原液以试验原液注射小鼠, 当 24h 内 2 只或 3 只小鼠死亡时, 需振荡试验原液使成均匀混悬液, 用 1% 吐温 -60 生理盐水按表 1 逐步稀释成 4 倍或 16 倍的稀释液, 充分混匀, 按表 1 注射小鼠 5.4 小鼠试验选择 16g~20g 健康 ICR 雄性小鼠 6 只, 随机分为实验组和溶剂对照组两组, 每组 3 只实验组将腹腔注射试验原液或其稀释液, 溶剂对照组将腹腔注射 1% 吐温 -60 生理盐水 2

5 分别取 1mL 待测液或 1% 吐温 -60 生理盐水腹腔注射小鼠注射过程中若有提取液溢出, 须将该只小鼠丢弃, 并重新注射一只小鼠仔细观察并记录死亡时间死亡时间计算从注射完毕开始至小鼠停止呼吸 ( 小鼠呼出最后一口气止 ) 为止存活动物应连续观察 24h 观察时限 24h 内, 在溶剂对照组小鼠正常的情况下, 实验组若出现 2 只或 3 只小鼠死亡, 则按表 1 进一步实验, 以确定一组 3 只小鼠中死亡 2 只或 2 只以上的最小染毒量或最大稀释度表 1 注射量稀释度与毒力的关系注射液注射量 ml 相对应的试样量 g 毒力 MU/g 试验原液试验原液倍稀释液倍稀释液倍稀释液倍稀释液分析结果的表述观察时限 24h 内, 在溶剂对照组小鼠正常情况下, 若实验组无小鼠死亡或仅有 1 只小鼠死亡, 则报告样品中 DSP 毒力为 :<0.05 MU/g 观察时限 24h 内, 在溶剂对照组小鼠正常情况下, 若实验组有 2 只或 3 只小鼠死亡, 则按 5.4 进行动物实验, 并根据表 1 计算样品中 DSP 毒力, 报告样品中 DSP 毒力为 : MU/g 酶联免疫吸附法 7 原理根据竞争性酶联免疫反应, 游离的腹泻性贝类毒素与其酶标记物竞争腹泻性贝类毒素抗体没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去将酶底物和显色剂加入到孔中并且孵育结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色用酶标仪在 450nm 波长下测量微孔溶液的吸光度值, 试样中的腹泻性贝类毒素含量与吸光度值成反比, 按绘制的标准曲线定量计算 8 试剂和材料 8.1 试剂除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB/T6682 规定的一级水甲醇 (CH3OH) 十二水合磷酸氢二钠 (Na2HPO4 12H2O) 3

6 8.1.3 氯化钠 (NaCl) 氯化钾 (KCl) 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 吐温 -20(C58H114O26) 牛血清白蛋白 (BSA) 酶标记物过氧化氢 (H2O2) ,3,5,5- 四甲基联苯胺 (TMB,C16H20N2) 硫酸 (H2SO4) 8.2 试剂配制甲醇溶液 (90%): 量取 90mL 甲醇, 加入 10mL 水, 混合均匀磷酸盐缓冲液 (PBS 溶液,pH7.4): 分别称取磷酸二氢钾 0.20g 十二水合磷酸氢二钠 2.90g 氯化钠 8.00g 氯化钾 0.20g, 加水溶解并定容至 1000mL 酶标记物稀释液 : 称取 1.0gBSA, 加 PBS 溶液溶解并定容至 1000mL 酶标记物工作液 : 用酶标记物稀释液将酶标记物稀释至工作浓度洗脱液 : 吸取 0.5mL 吐温 -20 加入 PBS 溶液中, 并稀释至 1000mL 硫酸溶液 (1mol/L): 吸取 53.2mL 硫酸, 缓缓加至 900mL 水中, 并用水稀释至 1000mL 8.3 标准品大田软海绵酸 (OA,C44H68O13,CAS 号 ) 标准溶液 8.4 标准溶液配制标准系列工作液 : 将大田软海绵酸标准溶液用 PBS 溶液稀释, 配制成浓度分别为 0μg/L 5μg/L 10μg/L 25μg/L 50μg/L 100μg/L 150μg/L 和 200μg/L 的 DSP 标准系列工作液现用现配 8.5 材料包被有腹泻性贝类毒素抗体的微孔板注 : 商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准, 参见附录 A 9 仪器和设备 9.1 酶标仪 9.2 均质器 9.3 离心机 : 转速 6000r/min 10 分析步骤 10.1 样品采集同试样制备同 5.2 4

7 10.3 试样提取将剪碎的试样均质, 准确称取 10g( 精确至 0.1g), 加入 50 ml 甲醇溶液 (90%), 均质 1 min~ 2min,6000r/min 离心 10min, 转移出上清液, 根据上清液体积加入 2 倍体积的 PBS 溶液, 混合均匀, 吸取 50μL 试样稀释液进行测定 10.4 测定将包被有腹泻性贝类毒素抗体的微孔条插入微孔架并做好标记, 其中包括空白对照孔标准液孔和样液孔, 分别做平行孔向空白对照孔加入 50μLPBS 溶液, 标准液孔加入 50μL 腹泻性贝类毒素标准系列工作液, 样液孔加入 50μL 样液加入 50μL 腹泻性贝类毒素酶标记物至每个微孔, 迅速充分混合,22 ~25 避光孵育 10min 孵育结束后, 倒去孔中液体, 每个微孔注入 250μL 洗脱液冲洗, 翻转微孔板, 倾去孔内液体, 再重复以上洗板操作 4 次, 在吸水纸上拍干每孔加 50μL 过氧化氢和 TMB, 充分混合, 室温避光孵育 6 min 每孔加入 50μL 硫酸溶液 (1 mol/l) 迅速混匀, 终止反应, 在 10min 内测量并记录 450nm 波长下的吸光度值若提取液经测定后的质量浓度超出标准曲线的线性范围, 应适当稀释后重新测定 10.5 标准曲线的制作以腹泻性贝类毒素标准工作液质量浓度以 10 为底的对数值为横坐标, 以式 (1) 计算的标准液的百分比吸光度值为纵坐标, 绘制标准曲线腹泻性贝类毒素标准液或样液的百分比吸光度值按式 (1) 计算 : 式中 : A 百分比吸光度值 ; S 腹泻性贝类毒素标准液或样液的平均吸光度值 ; S0 0μg/L 的腹泻性贝类毒素标准液的平均吸光度值 A = S S0 100% (1 ) 11 分析结果的表述试样中腹泻性贝类毒素的含量按式 (2) 计算 : 式中 : X = ρ V f m X 试样中腹泻性贝类毒素的含量, 单位为微克每克 ( μ g/g); (2 ) ρ 由标准曲线得到的试样待测液中腹泻性贝类毒素的质量浓度, 单位为微克每毫升 ( μ g/ ml); V 试样提取液的体积, 单位为毫升 (ml); f 稀释倍数 ; m 试样的称样量, 单位为克 (g) 注 : 任何腹泻性贝类毒素含量大于 16μg/100g 的样品即被认为是有害的, 对人类食用不安全 12 其他本方法的定量限为 10μg/kg 5

8 液相色谱 - 串联质谱法 13 原理试样经甲醇提取, 碱性条件下水解释放出酯化态腹泻性贝类毒素, 液相色谱分离, 串联质谱法测定, 以基质标准曲线进行外标法定量 14 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为优级纯, 水为 GB/T6682 规定的一级水 14.1 试剂甲醇 (CH3OH): 色谱纯乙腈 (CH3CN): 色谱纯氨水 (NH3 H2O) 氢氧化钠 (NaOH) 盐酸 (HCl) 甲酸铵 (NH4COOH): 色谱纯甲酸 (HCOOH): 色谱纯 14.2 试剂配制甲醇溶液 (30%): 量取 30mL 甲醇, 用水稀释至 100mL 甲醇溶液 (20%): 量取 20mL 甲醇, 用水稀释至 100mL 氨水 - 甲醇溶液 (0.3%): 吸取 0.3mL 氨水, 用甲醇稀释至 100mL 氢氧化钠溶液 (2.5mol/L): 准确称取 50g 氢氧化钠, 用水溶解并稀释至 500mL 盐酸溶液 (2.5mol/L): 准确量取 104.5mL 盐酸, 用水稀释至 500mL 流动相 A[ 甲酸铵溶液 (2mmol/L)]: 准确称取 126 mg 甲酸铵, 用 50 ml 水将其全部溶解, 加入 2mL 甲酸, 加水定容至 1000mL, 室温下可保存 48h 流动相 B[ 乙腈 - 甲酸铵溶液 (2mmol/L)(95+5)]: 准确称取 126mg 甲酸铵, 用 30mL 水溶解, 加入 2mL 甲酸, 加水稀释至 50mL, 再加入 950mL 乙腈, 室温下可保存 48h 14.3 标准品大田软海绵酸 (OA,C44H68O13,CAS 号 ) 标准溶液 :14.24μg/mL, 或经国家认证并授予标准物质证书的一定浓度的 OA 标准溶液鳍藻毒素 -1(DTX-1,C45H70O13,CAS 号 ) 标准溶液 :15.15μg/mL, 或经国家认证并授予标准物质证书的一定浓度的 DTX-1 标准溶液鳍藻毒素 -2(DTX-2,C44H68O13,CAS 号 ) 标准溶液 :7.80μg/mL, 或经国家认证并授予标准物质证书的一定浓度的 DTX-2 标准溶液 14.4 标准溶液配制腹泻性贝类毒素混合标准中间液 : 分别吸取适量的各腹泻性贝类毒素标准溶液于 5 ml 棕色容 6

9 量瓶中, 用甲醇稀释并定容, 使各腹泻性贝类毒素浓度分别为 :OA1.0μg/mL,DTX-11.0μg/mL, DTX-21.0μg/mL -18 以下避光保存, 保存期 1 个月腹泻性贝类毒素基质标准系列工作液 : 取 5 份空白试样, 分别加入适量上述各浓度腹泻性贝类毒素混合标准中间液, 按与试样相同的分析步骤处理, 制成 OA DTX-1 DTX-2 的质量浓度为 0.8ng/ ml 1.6ng/mL 4.0ng/mL 8.0ng/mL 和 16.0ng/mL 的基质标准系列工作液, 过 0.22μm 的有机相微孔滤膜后备用 14.5 材料固相萃取柱 : 硅胶表面修饰苯乙烯二乙烯基苯聚合物型固相萃取柱,60 mg/3 ml, 或性能相当者使用前依次用 1mL 甲醇 1mL 甲醇溶液 (30%) 活化微孔滤膜 :0.22μm, 有机相 15 仪器和设备 15.1 液相色谱 - 串联质谱仪 : 配电喷雾离子源 15.2 天平 : 感量为 0.01g 15.3 组织均质器 : 转速 10000r/min 15.4 涡旋振荡器 15.5 离心机 : 转速 8000r/min 15.6 超声波清洗器 15.7 恒温干燥箱 15.8 固相萃取装置 15.9 真空泵氮吹仪 ph 计 16 分析步骤 16.1 样品采集同试样制备同试样提取腹泻性贝类毒素提取将剪碎的试样均质, 准确称取 2g( 精确至 0.01g) 于 50mL 具塞离心管中, 加入 9mL 甲醇, 涡旋混合 1min, 超声提取 10min,8000r/min 下离心 5min, 移出上清液于 20mL 刻度玻璃管中残渣中加入 9mL 甲醇, 重复提取一次, 合并提取液, 用甲醇定容至 20mL 酯化态腹泻性贝类毒素水解释放准确吸取提取液 1 ml 置于螺纹口样品瓶中, 加入氢氧化钠溶液 (2.5 mol/l)125μl, 混匀后用密 7

10 封膜将瓶密封, 于 76 下温育 40min, 冷至室温后, 加入盐酸溶液 (2.5 mol/l)125μl 并混匀, 所得水解液 (1.25mL 相当于 0.1g 试样 ) 可直接过 0.22μm 有机相微孔滤膜后, 供液相色谱 - 串联质谱测定, 或者必要时进行净化处理 16.4 试样净化所得水解液用 3mL 水稀释, 涡旋混匀后, 移入已预活化的聚合物型固相萃取柱, 待液体以 1 ml/ min 的流速流出后, 再用 1mL 甲醇溶液 (20%) 淋洗, 弃去流出液, 保持抽气 2 min, 最后用 1 ml 氨水 - 甲醇溶液 (0.3%) 洗脱, 保持抽气 2 min, 收集洗脱液, 用甲醇定容至 1 ml( 相当于 0.1g 试样 ), 过 0.22μm 的有机相微孔滤膜后, 供液相色谱 - 串联质谱测定 16.5 空白试验除不加试样外, 采用与试样相同的操作步骤, 得到空白溶液 16.6 仪器参考条件液相色谱参考条件 : a) 色谱柱 :C18 柱, 柱长 100mm, 内径 2.1mm, 粒径 3.5μm, 或性能相当者 ; b) 流速 :0.2mL/min; c) 柱温 :35 ; d) 进样量 :10μL; e) 流动相 : 流动相 A 为甲酸铵溶液 (2mmol/L),B 为乙腈 + 甲酸铵溶液 (2mmol/L)(95+5), 梯度洗脱, 梯度洗脱条件见表 2 表 2 流动相梯度洗脱条件时间 /min A/% B/% 质谱参考条件 a) 离子源 : 电喷雾离子源 ; b) 扫描模式 : 负离子扫描 ; c) 检测方式 : 多反应监测模式,OA DTX-1 DTX-2 母离子子离子及去簇电压和碰撞能见表 3; d) 电喷雾电压 (IS):-4000V; e) 雾化气压力 (GS1):414kPa; f) 气帘气压力 (CUR):104kPa; g) 碰撞气压力 (CAD):83kPa; h) 辅助气流速 (GS2):70L/min; i) 离子源温度 (TEM):550 8

11 表 3 腹泻性贝类毒素多反应监测模式下母离子子离子去簇电压和碰撞能量目标化合物母离子 m/z 子离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 ev 大田软海绵酸 (OA) 鳍藻毒素 -1 (DTX-1) * * 鳍藻毒素 -2 (DTX-2) * * 代表定量离子 16.7 基质校正标准曲线的制作将基质标准系列工作液分别注入液相色谱 - 串联质谱仪中, 测定相应的峰面积, 以标准工作液的质量浓度为横坐标, 以峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线腹泻性贝类毒素标准溶液的多反应监测色谱图参见图 C 试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱 - 串联质谱仪中, 得到峰面积, 根据基质标准曲线得到试样溶液中腹泻性贝类毒素的质量浓度在同样测试条件下, 试样溶液中腹泻性贝类毒素的保留时间与基质标准工作液中腹泻性贝类毒素的保留时间之间的偏差在 ±2.5% 以内, 且试样溶液中腹泻性贝类毒素的定性离子的相对丰度应与质量浓度相近的基质标准工作液中腹泻性贝类毒素的定性离子的相对丰度一致, 其丰度比偏差应符合表 4 要求, 则可判定试样溶液中存在被测化合物表 4 定性离子相对丰度的最大允许偏差定性离子相对丰度 >50% >20%~50% >10%~20% 10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 17 分析结果的表述 17.1 试样中腹泻性贝类毒素的含量按式 (3) 计算 : 式中 : Xi ρi V Xi = ρ i V 1000 m 1000 试样中腹泻性贝类毒素的含量, 单位为微克每千克 ( μ g/kg); (3 ) 由基质标准曲线得到的试样溶液中腹泻性贝类毒素的质量浓度, 单位为纳克每毫升 (ng/ml); 试样溶液的体积, 单位为毫升 (ml); 1000 换算因子 ; 9

12 m 与 1mL 试样提取液相当的试样质量, 单位为克 (g) 计算结果应扣除空白值计算结果保留三位有效数字 17.2 总毒力计算试样中腹泻性贝类毒素总毒力按式 (4) 计算 : 式中 : OAeq 腹泻性贝类毒素总毒力, 单位为微克每千克 ( μ g/kg); Xi ri 各种腹泻性贝类毒素的含量, 单位为微克每千克 ( μ g/kg); 毒性因子 n OAeq Xi ri = (4 ) i=1 注 : 试样中各种腹泻性贝类毒素的含量需按照附录 B 中的毒性因子 (TEFs), 统一转换为总毒力 (OAeq ) 18 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15% 19 其他本方法中 OA DTX-1 和 DTX-2 的检出限均为 10.0μg/kg,OA DTX-1 和 DTX-2 的定量限均为 30.0μg/kg 10

13 附录 A 商业化试剂盒评价技术参数 A.1 定量限定量限为 10μg/kg A.2 回收率回收率为 85%~90% A.3 重现性标准品变异系数 10%, 样品变异系数 15% A.4 交叉反应率检测 OA 交叉反应率达到 100%; 检测 DTX-1 交叉反应率达到 50%; 检测 DTX-2 交叉反应率达到 50% 与麻痹性贝类毒素, 包括 STX neostx dc-stx GTX1/4 GTX2/3 B1 B2 C-1/2 和 DA 等没有任何交叉反应 11

14 附录 B 腹泻性贝类毒素毒性因子表 B.1 腹泻性贝类毒素毒性因子 (r) 毒素 OA DTX-1 DTX-2 毒性因子

15 附录 C 腹泻性贝类毒素标准溶液的多反应监测色谱图腹泻性贝类毒素标准溶液的多反应监测色谱图见图 C.1 图 C.1 腹泻性贝类毒素标准溶液 (3ng/mL) 的多反应监测色谱图 13

标题

中华人民共和国国家标准 GB 5009.222 2016 食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定 2016-12-23 发布 2017-06-23 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布前言本标准代替 GB/T5009.222 2008 红曲类产品中桔青霉素的测定 SN/T2426 2010 进出口粮谷中桔霉素含量检测方法液相色谱法和 SN/T2916 2011