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1 司法鉴定技术规范 SF/Z JD 生物检材中单乙酰吗啡 吗啡 可待因的 测定 发布 生效 中华人民共和国司法部司法鉴定管理局 发布

2 前 言 本标准的附录 A 为资料性附录 本标准由中华人民共和国司法部司法鉴定科学技术研究所提出 本标准由中华人民共和国司法部归口 本标准起草单位 : 中华人民共和国司法部司法鉴定科学技术研究所 本标准主要起草人 : 卓先义 刘伟 向平 沈保华 卜俊 马栋 严慧 I

3 生物检材中单乙酰吗啡 吗啡和可待因的测定 1 范围 本标准规定了血液 尿液 组织及毛发中单乙酰吗啡 吗啡和可待因的免疫筛选法 气 相色谱 - 质谱联用法和液相色谱 - 串联质谱法测定方法 本标准适用于血液 尿液 组织及毛发中单乙酰吗啡 吗啡和可待因的免疫筛选法 气 相色谱 - 质谱联用法和液相色谱 - 串联质谱法定性定量分析 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件, 其 随后所有的修改单 ( 不包括勘误的内容 ) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 (GB/T ,ISO 3696:1987,MOD) GA/T 122 毒物分析名词术语 第一篇 免疫筛选法 3 原理采用高度特异性的抗原 - 抗体反应的免疫胶体金层析技术, 通过单克隆抗体竞争结合吗啡偶联物和尿液中可能含有的吗啡, 试剂盒含有被事先固定于膜上测试区 (T) 的吗啡偶联物和被胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体 4 试剂吗啡尿液胶体金法试剂盒 (MOP) 5 操作方法用吸管吸取尿液检材, 滴入试剂盒的样品孔中 5 滴 ( 约 150~200μL),3~5 分钟后观察结果 6 结果判定 6.1 阳性仅质控区 C 出现紫红色带, 而测试区 T 无紫红色带, 提示尿液中存在吗啡类物质 6.2 阴性质控区 C 及测试区 T 均出现紫红色带, 提示尿液中无吗啡类物质或尿液中吗啡浓度在 300ng/mL 以下 6.3 无效 1

4 质控区 C 未出现紫红色带, 结果无效, 应重新检验 第二篇 气相色谱 - 质谱联用法 7 原理 单乙酰吗啡 吗啡和可待因在约 ph9.2 时可用氯仿 : 异丙醇 (9:1) 从生物检材中提出, 用 丙酸酐使单乙酰吗啡 吗啡和可待因结构上的羟基基团丙酰化后, 用气相色谱 - 质谱联用仪 进行检测, 经与平行操作的单乙酰吗啡 吗啡或可待因对照品比较, 以保留时间和特征碎片离子定性分析 8 试剂和材料 除另有规定外, 试剂均为分析纯, 水为 GB/T 6682 规定的二级水 8.1 单乙酰吗啡 吗啡和可待因对照品纯度 99% 8.2 单乙酰吗啡 吗啡和可待因对照品溶液的制备分别精密称取对照品单乙酰吗啡 吗啡 可待因各适量, 用甲醇配成 1mg/mL 的对照品储备溶液, 置于 -18ºC 冷冻保存, 保存期为 1 年 试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储备液稀释而得, 储存在 4 冰箱中, 保存期为 6 个月 8.3 氯仿 8.4 异丙醇 % 氢氧化钠溶液 8.6 丙酸酐 8.7 吡啶 8.8 硼砂缓冲液 ph9.0~ 甲醇 8.10 丙酮 % 十二烷基磺酸钠溶液 % 洗洁精溶液 8.13 浓盐酸 mol/L 盐酸溶液 8.15 MSTFA 8.16 乙腈 9 仪器 9.1 气相色谱 - 质谱联用仪配有电子轰击源 (EI) 9.2 分析天平感量 0.1mg 9.3 微波炉 2

5 9.4 涡旋混合器 9.5 离心机 9.6 恒温水浴锅 9.7 空气泵 9.8 移液器 9.9 具塞离心试管 9.10 冷冻研磨机 10 测定步骤 10.1 样品预处理 尿液直接提取取尿液 2mL 置于 10mL 具塞离心管中, 用 10% 氢氧化钠溶液调至 ph9.0~9.2, 加入 1mL 硼砂缓冲液, 用氯仿 : 异丙醇 (9:1)3mL 提取, 涡旋混合 离心, 转移有机层至另一离心管中, 约 60 C 水浴中空气流下吹干 残留物中加入丙酸酐 (50μL) 吡啶(20μL), 混匀, 微波炉 (500W) 衍生化 3min,60 C 水浴中空气流下吹干, 残留物用 30μL 甲醇溶解, 取 1μL 进气相色谱 - 质谱联用仪分析 尿液中总吗啡或可待因的提取取尿液 2mL 置于 10mL 具塞离心管中, 加入 0.2mL 浓盐酸沸水浴中水解 30min, 取出, 冷却后加入 1mL 正丁醇, 涡旋混合 离心, 弃去有机层, 用 10% 氢氧化钠溶液调至 ph9.0~ 9.2, 以下同 项下操作 血液直接提取取血液 2mL 置于 10mL 具塞离心管中, 加入 2mL 硼砂缓冲液, 用氯仿 : 异丙醇 (9:1)3mL 提取, 以下同 项下操作 组织提取将组织剪碎或匀浆, 称取 2g, 加入 2mL 水, 再加入 0.4mL 浓盐酸, 沸水浴中水解 30min, 取出, 用 10% 氢氧化钠溶液调至 ph9.0~9.2, 以下同 项下操作 毛发提取 毛发采集贴发根处剪取毛发, 发根处作标记 毛发洗涤毛发样品依次用 0.1% 十二烷基磺酸钠溶液 0.1% 洗洁精溶液 水和丙酮振荡洗涤一次, 晾干后剪成约 1mm 段, 供检 毛发的提取 净化称取 50mg 毛发, 加 1mL 0.1mol/L 盐酸溶液浸润,45 C 水浴水解 12~15 小时或超声 1 小时 ( 针对磨碎的头发 ), 取出后用 10% 氢氧化钠溶液调至 ph9.0~9.2, 加入 1mL 硼砂缓冲液,, 用氯仿 : 异丙醇 (9:1)3mL 提取, 涡旋混合 离心, 转移有机层至另一离心管中, 约 60 C 水浴中空气流下吹干 残留物中加入 MSTFA(25μL) 乙腈(25μL), 混匀, 微波炉 (500W) 衍生化 3min, 冷却后取 1μL 进气相色谱 - 质谱联用仪分析 10.2 样品测定 气相色谱 - 质谱参考条件 3

6 a) 色谱柱 :HP-1MS 毛细管柱 (30m 0.25mm 0.25μm) 或相当者 ; SF/Z JD b) 柱温 :100 C 保持 1.5min, 以 25 C/min 程序升温至 280 C, 保持 15min; c) 载气 : 氦气, 纯度 %, 流速 :1.0mL/min; d) 进样口温度 :250 C; e) 进样量 :1μL; f) 电子轰击源 :70eV; g) 四极杆温度 :150 C; h) 离子源温度 :230 C; i) 接口温度 :280 C; j) 检测方式 :SIM 每种化合物分别选择 3 个特征碎片离子 单乙酰吗啡 吗啡 可待因的保留时间与特征 碎片离子见表 1 表 1 单乙酰吗啡 吗啡 可待因的色谱峰保留时间与碎片离子 保留时间 (min) 碎片离子 (m/z) 单乙酰吗啡丙酰化物 ,383,268 吗啡丙酰化物 ,397,268 可待因丙酰化物 ,355,282 单乙酰吗啡三甲基硅衍生物 ,340,399 吗啡三甲基硅衍生物 ,414,429 乙基吗啡三甲基硅衍生物 , 定性测定 进行样品测定时, 如果检出的色谱峰保留时间与空白检材添加对照品的色谱峰保留时间 比较, 相对误差小于 2%, 并且在扣除背景后的样品质谱图中, 所选择的离子均出现, 而且 所选择的离子相对丰度比与添加对照品的离子相对丰度比之相对误差不超过表 2 规定的范 围, 则可判断样品中存在这种化合物 表 2 相对离子丰度比的最大允许相对误差 (%) 相对离子丰度比 允许的相对误差 ±20 ±25 ±30 ± 定量测定 采用外标 - 校准曲线法或单点法定量 用相同基质空白添加适量目标物对照品制得一系 列校准样品, 以目标物的峰面积对目标物浓度绘制校准曲线, 并且保证所测样品中目标物的 浓度值在其线性范围内 当检材中目标物浓度在空白检材中添加目标物浓度的 ±50% 以内 时, 可采用单点校准法来计算目标化合物的浓度 10.3 平行试验 样品应按以上步骤同时平行测定两份 平行试验中两份检材测定结果按两份检材的平均值计算, 双样相对相差不得超过 20% ( 腐败检材不超过 30%) 双样相对相差按式 (1) 计算 : C 1 - C 2 双样相对相差 (%) = 100 C (1) 4

7 式中 : C 1 C 2 两份样品平行定量测定的结果 ; C 两份样品平行定量测定结果的平均值 (C 1 + C 2 )/ 空白试验 除以相同基质空白替代检材外, 均按上述步骤进行 11 结果计算 以外标 - 校准曲线法或按式 (2) 计算被测样品中单乙酰吗啡 吗啡或可待因浓度 : A 1 W C = (2) A 2 W 1 式中 : C 检材中目标物的浓度 (μg/ml 或 μg/g) A 1 检材中目标物的峰面积 A 2 空白检材中添加目标物的峰面积 W 空白检材中目标物的添加量 (μg) W 1 检材量 (ml 或 g) 12 方法检出限 血液 尿液 组织和毛发中单乙酰吗啡 吗啡和可待因的检出限见附录 A 第三篇液相色谱 - 串联质谱法 13 原理单乙酰吗啡 吗啡 可待因在约 ph9.2 时可用氯仿 : 异丙醇 (9:1) 从生物检材中提出, 提取后的样品用液相色谱 - 串联质谱法的多反应监测模式进行检测, 经与平行操作的单乙酰吗啡 吗啡和可待因对照品比较, 以保留时间和两对母离子 / 子离子对进行定性分析 14 试剂和材料除另有规定外, 试剂均为分析纯, 水为 GB/T 6682 规定的一级水 14.1 单乙酰吗啡 吗啡 可待因对照品及溶液的制备同 8.1 及 氯仿 14.3 异丙醇 14.4 丙酮 14.5 硼砂缓冲液 ph9.0~ 浓盐酸 mol/L 盐酸溶液 5

8 % 氢氧化钠溶液 % 十二烷基磺酸钠溶液 % 洗洁精溶液 乙腈色谱纯 甲酸优级纯 乙酸胺色谱纯 流动相缓冲液 20mmol/L 乙酸铵和 0.1% 甲酸缓冲液 : 分别称取 1.54g 乙酸铵和 1.84g 甲酸置于 1000mL 容量瓶中, 加水定容至刻度,pH 值约为 4 15 仪器 15.1 液相色谱 - 串联质谱仪配有电喷雾离子源 (ESI) 15.2 分析天平感量 0.1mg 15.3 涡旋混合器 15.4 离心机 15.5 恒温水浴锅 15.6 空气泵 15.7 移液器 15.8 具塞离心试管 15.9 冷冻研磨机 16 测定步骤 16.1 样品预处理 尿液提取取尿液 2mL 置于 10mL 具塞离心管中, 用 10% 氢氧化钠溶液调至 ph9.0~9.2, 加入 1mL 硼砂缓冲液, 用氯仿 : 异丙醇 (9:1)3mL 提取, 涡旋混合 离心, 转移有机层至另一离心管中, 约 60 C 水浴中空气流下吹干 残留物中加入 100μL 乙腈 : 流动相缓冲液 (70:30) 进行溶解, 取 5μL 进 LC-MS/MS 血液提取取血液 2mL 置于 10mL 具塞离心管中, 加入 2mL 硼砂缓冲液, 用氯仿 : 异丙醇 (9:1)3mL 提取, 以下同 项下操作 组织提取将组织剪碎或匀浆, 称取 2g, 加入 2mL 水, 再加入 0.4mL 浓盐酸沸水浴中水解 30min, 取出, 用 10% 氢氧化钠溶液调至 ph9.0~9.2, 以下同 项下操作 毛发提取 6

9 称取 50mg 毛发, 加 1mL 0.1mol/L 盐酸溶液浸润,45 C 水浴水解 12~15 小时或超声 1 小时 ( 针对磨碎的头发 ), 取出后用 10% 氢氧化钠溶液调至 ph9.0~9.2, 加入 1mL 硼砂缓 冲液, 以下同 项下操作 16.2 样品测定 液相色谱 - 串联质谱参考条件 a) 色谱柱 :Allure PFP Propyl 100mm 2.1mm 5μm 或相当者, 前接保护柱 ; b) 柱温 : 室温 ; c) 流动相 :V( 乙腈 ) : V( 缓冲液 ) = 70 : 30; d) 流速 :200μL/min; e) 进样量 :5μL; f) 扫描方式 : 正离子扫描 (ESI+); g) 检测方式 : 多反应监测 (MRM); h) 离子喷雾电压 :5500 V; i) 离子源温度 :500 C; j) 每个化合物分别选择 2 对母离子 / 子离子对作为定性离子对, 以第一对离子对作为定量 离子对 其定性离子对 定量离子对 去簇电压 (DP) 碰撞能量 (CE) 和保留时间 (t R ) 见表 3 表 3 单乙酰吗啡 吗啡和可待因的定性离子对 定量离子对 去簇电压 (DP) 碰撞能量 (CE) 和保留时间 (t R ) 名称定性离子对 DP(V) CE(eV) t R (min) 吗啡 286.1/ ) / 单乙酰吗啡 328.1/ ) / 可待因 300.2/ ) / 注 :1) 为定量离子对 定性测定 进行样品测定时, 如果检出的色谱峰保留时间与空白检材添加对照品的色谱峰保留时间 比较, 相对误差小于 2%, 并且在扣除背景后的样品质谱图中, 均出现所选择的离子对, 而 且所选择的离子对相对丰度比与添加对照品的离子对相对丰度比之相对误差不超过表 4 规 定的范围, 则可判断样品中存在这种化合物 表 4 相对离子对丰度比的最大允许相对误差 (%) 相对离子对丰度比 允许的相对误差 ±20 ±25 ±30 ± 定量测定 采用外标 - 校准曲线法或单点法定量 用相同基质空白添加适量目标物对照品制得一系 列校准样品, 以目标物的峰面积对目标物浓度绘制校准曲线, 并且保证所测样品中目标物的 浓度值在其线性范围内 当检材中目标物浓度在空白检材中添加目标物浓度的 ±50% 以内 时, 可采用单点校准法来计算目标化合物的浓度 7

10 16.3 平行试验 样品应按以上步骤同时平行测定两份 平行试验中两份检材测定结果按两份检材的平均值计算, 双样相对相差不得超过 20% ( 腐败检材不超过 30%) 双样相对相差按式(1) 计算 : C 1 - C 2 双样相对相差 (%) = 100 (1) C 式中 : C 1 C 2 两份样品平行定量测定的结果 ; C 两份样品平行定量测定结果的平均值 (C 1 + C 2 )/ 空白试验 除以相同基质空白替代检材外, 均按上述步骤进行 17 结果计算 以外标 - 校准曲线法或按式 (2) 计算被测样品中单乙酰吗啡 吗啡或可待因浓度 : A 1 W C = (2) A 2 W 1 式中 : C 检材中目标物的浓度 (μg/ml 或 μg/g) A 1 检材中目标物的峰面积 A 2 空白检材中添加目标物的峰面积 W 空白检材中目标物的添加量 (μg) W 1 检材量 (ml 或 g) 18 方法检出限 血液 尿液 组织和毛发中单乙酰吗啡 吗啡和可待因的检出限见附录 A 8

11 附录 A ( 资料性附录 ) 血液 尿液 组织和毛发中单乙酰吗啡 吗啡和可待因的检出限 血液 尿液 组织和毛发中单乙酰吗啡 吗啡和可待因的检出限见表 A 表 A 生物检材中单乙酰吗啡 吗啡和可待因的检出限 GC-MS 检出限 LC-MS/MS 检出限样品成分 (μg/ml 或 μg/g) (μg/ml 或 μg/g) 单乙酰吗啡 吗啡 尿液 血液可待因 单乙酰吗啡 吗啡 组织可待因 单乙酰吗啡 吗啡 毛发可待因

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前言 亚硝胺类化合物, 特别是亚硝基二甲胺 (NDMA), 是存在于饮用水中的污染物, 这类物质对健康的潜在威胁引发了环保团体的关注 2 工业来源污染( 如火箭燃料生产中产生的直接污染物 ) 将产生高浓度的 NDMA 此外,NDMA 也是饮用水和废水进行氯化 氯胺化和臭氧化消毒的副产物 3 EPA 应用简报 环境 使用 GC/MS/MS 分析饮用水中的亚硝胺类化合物 满足 EPA 方法 521 的等效性 使用 Agilent 71 和 7 三重四极杆气质联用系统 作者 Andy Eaton Charles Grady 和 Konjit Tadigo Eurofins Eaton Analytical, Monrovia, CA, USA Yongtao Li 和 William Davis Eurofins

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前言 多种氨基酸以百万分之一 (ppm) 和十亿分之一 (ppb) 级的水平广泛存在于植物材料中 之前的研究中发现 1, 使用配备低 ph 与正离子模式质谱检测的亲水相互作用色谱 (HILIC) 模式分析未衍生化氨基酸, 能够获得出色的分离度与灵敏度 本应用简报对这些条件进一步优化, 以对植物中的氨 应用简报 食品检测 代谢组学 农药化学 环境 使用 LC/MS 检测通过亲水相互作用色谱 (HILIC) 对植物基质中的未衍生化氨基酸进行定量分析 作者 Yuxiong Huang Weiwei Li 和 Arturo Keller 美国加州大学圣塔芭芭拉分校 Tarun Anumol 和 Adam Bivens 安捷伦科技公司 摘要 本应用简报介绍了一种使用三重四极杆液质联用系统定量分析多种未衍生化氨基酸的方法

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