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艳史
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安捷伦 6460 三重四极杆液质联用仪用于亲脂性海洋贝类毒素的高灵敏度可靠分析应用简报环境, 食品安全作者 liver Keuth Chemical and Veterinary Analytical Institute Muensterland-Emscher-Lippe, Muenster,Germany 摘要海洋生物毒素正在世界各个地方日益威胁着人类的健康

1 安捷伦 6460 三重四极杆液质联用仪用于亲脂性海洋贝类毒素的高灵敏度可靠分析应用简报环境, 食品安全作者 liver Keuth Chemical and Veterinary Analytical Institute Muensterland-Emscher-Lippe, Muenster,Germany 摘要海洋生物毒素正在世界各个地方日益威胁着人类的健康毒素是由几类微观浮游藻类生成的, 其浓度很低, 但可以在双壳贝类中累积并达到毒性剂量食用受污染的贝类或鱼类可导致人体中毒, 甚至死亡在动物和人类中, 根据症状划分出了四类公认的贝毒 : 腹泻性贝毒 (DSP) 麻痹性贝毒(PSP) 神经性贝毒(NSP) 记忆缺失性贝毒(ASP) Thomas Glauner Agilent Technologies, Waldbronn,Germany 小白鼠生物法 (MBA) 是用于监测亲脂性生物毒素的欧盟官方标准的参考方法 [ 委员会法规 (EC) 第 074/005 号 ] 最近, 欧洲食品安全局 (EFSA) 认为, 由于小白鼠生物法 (MBA) 的高变异性低检测能力和有限的特异性, 使得这个方法不能满足要求 (EFSA 杂志,009,06,-) 因此需要一个具体的能够替代低检测限(LD) 的方法来用于海洋生物毒素的检测本文描述了一种高灵敏度的液相色谱 - 串联质谱方法来测定亲脂性的海洋毒素, 包括大田软海绵酸 (A) 鳍藻毒素(DTX 毒素 ) 聚醚类毒素( 如原多甲藻酸, 蛤毒素和虾夷扇贝毒素 ) 初步测试表明, 若能找到标准物质, 这种方法也适用于软骨藻酸环亚胺毒素或螺旋内酯毒素等亲脂毒素的进一步检测

2 前言海洋生物毒素是海洋植物藻类产生的次生代谢物, 其浓度一般很低在藻类生长时, 毒素的浓度可以达到有毒水平, 特别是双壳类软体动物中毒素的积累在过去的二十年中, 有害藻类大量繁殖, 其数量和强度都日益增加, 大量的有毒化合物在海洋食物链中被发现 [ 海洋生物毒素粮农组织食品和营养文件 (80)004] 由于欧盟现有的官方的标准方法中, 小白鼠生物法的高变异性低检测能力和有限的特异性, 欧洲食品安全局 (EFSA) 要求需要开发出更灵敏更可靠的方法, 用于脂性海洋生物毒素的测定您面对的挑战目前的挑战是需要寻找灵敏和可靠的分析方法用于海产品中亲脂性的海洋毒素的测定, 这些海洋毒素包括大田软海绵酸 (A) 鳍藻毒素(DSP 毒素 ) 聚醚类毒素 ( 如原多甲藻酸蛤毒素和虾夷扇贝毒素 ) 这种方法应该能够扩展到亲脂毒素 ( 如软骨藻酸环亚胺毒素或螺旋内酯毒素 ) 的进一步检测欧盟立法规定检测限 (LD) 应该低于原多甲藻酸大田软海绵酸和鳍藻毒素和蛤毒素的总和以及虾夷扇贝毒素的最大残留限量 (MRL) 基质使得痕量毒素的定量和确认分析更加复杂由于很多标准品很难得到, 所以只能根据其它的毒素进行定量分析我们的综合方法当前, 海洋生物毒素的分析方法主要是基于物理化学技术, 如液相色谱 - 串联质谱三重四极杆质谱能大幅减少或消除基质的干扰多反应监测 (MRM) 是根据待测物的母离子在碰撞反应池产生特征离子, 然后采集这些特征离子来完成检测而且, 待测物母离子 (MS 设置成选择离子扫描模式 ) 与单四极杆质谱的选择离子扫描的选择性相同, 生成的子离子 (MS 的选择离子扫描模式 ) 更有可能成为目标化合物的特征离子, 这样的模式能够大大提高 MRM 的选择性特征的子离子组合 ( 更高的选择性 ) 和背景噪音的消除使得即使在复杂基质样品中也能得到更低的检测限本文的方法中, 使用安捷伦 6460 三重四极杆液质联用仪和多反应监测 (MRM) 安捷伦 00 SL 快速高分离液相色谱以及 Massunter 工作站软件, 建立了贝类样品中亲脂性海洋生物毒素的高灵敏度和高选择性的分析方法本文介绍的样品净化方法非常简单, 因此很适合常规检测它可以用于 A DTX- DTX- 的分析, 包括水解后的脂 YTX -YTX PTX- PTX- AZA- AZA- 和 AZA- 由于缺少某些商品化的毒素标样, 因此使用 CopyCalibration Level.quant.script 对其它的毒素化合物进行定量分析方法和运行用于海洋生物毒素的现代分析方法是基于三重四极杆液质联用系统的技术样品前处理很简单, 只需要用溶液提取, 然后过滤液相色谱进行毒素的分离, 然后用液相色谱 - 电喷雾离子源 - 串联质谱 (MRM 正 / 负模式 ) 进行待测物的定量分析分析步骤液相萃取高效液相色谱, 线性梯度进行分离液相色谱 - 电喷雾离子源 - 串联质谱 (MRM) 用于毒素检测样品制备步骤称取 g 熟的研磨贝类加入 9 ml 甲醇溶液 (80%) 进行两次提取步骤将两次提取液混合在一起, 移至 50 ml 容量瓶取一定体积的样品溶液, 过滤 (RC 5 µm), 0 µl 样品进到液相色谱 - 串联质谱中进行分析

3 待测物的结构 ( 举例 ) C C C C C C C C N C C C C C C C C N C C C S C C C C S R C C C C C C C C 7 5 C C 图. 一些海洋生物毒素的化学结构

4 液相色谱 - 串联质谱方法亲脂性海洋生物毒素的总分析时间小于 0 min 分析方法中, 对于 A DTX- DTX- PTX- PTX- AZA- AZA- 和 AZA- 采用正离子模式 YTX 需要用不同的色谱柱和流动相另外进行分析提取物 (0 µl) 直接进到液相色谱 - 串联质谱系统进行分析对于液相色谱方法, 正离子模式下用 0.% 甲酸溶液 (A) 和甲醇 (B); 对于负离子模式下用 mm 醋酸铵溶液 (A) 和甲醇 (B) 色谱柱 (Phenomenex Luna 5 pm C8() 00 Å 50 x.0 mm [ 正离子模式 ],ZRBAX Eclipse Plus C x 75 mm.5 pm [ 负离子模式 ]), 柱温为 0 C, 流速为 0. ml/min 梯度 * 时间 [min] 溶剂比例 B [%] 表. 梯度设置 * 适用于正负电离模式样品制备步骤 g 80 % 50mL 5 µm 0 µl - LC-MS/MS 图. 检测贝类中海洋生物毒素过程中的样品前处理步骤参考 :McNabb,P.,A.I. Selwood,and P.T. olland 贝类中藻毒素多多残留检测方法 J AAC.nt, :p Chapela,M.J.,et al., 液相色谱 - 质谱用于鲜的冷冻, 处理过的软体动物中亲脂性毒素分析, 并且与小白鼠生物法的比较 J Agric Food Chem, (9): p Moutfort,D..,T. Suzuki,and P. Trueman, 蛋白磷酸酶抑制法适用于测定受污染贻贝中的总 DSP,Toxicon,00.9:p

5 质谱参数设置和喷射流离子聚焦电喷雾源参数甲醇中 0 ng/ml A 标样安捷伦 6460 QQQ 喷射流电喷雾离子源参数气体温度 : 00 C 气体流速 : 5 L/min 雾化器压力 : 45 psi 鞘流气温度 : 50 C 鞘流气流速 : L/min 毛细管电压 : V V 喷嘴电压 : +/- 500 V Delta EMV: 400 # QA [min]!&' (! ) '! * QA [min] Agilent 640 QQQ 离子源参数离子源 : ESI 气体温度 : 00 C 干燥气流速 : 0 L/min 雾化器压力 : 4 psi 毛细管电压 : V V Delta EMV: 400 # QA DTX-!&' (! ) '! * QA [min] 图. 含有 A 和 DTX- 的大田软海绵酸标样和实际贝类样品 ( 样品与图 4 所示相同 ) A µg/kg 和 DTX- 0 µg/kg DTX- [min] 待测物极性母离子子离子碰撞电压 CE 定量离子 m/z m/z [V] [ev] A and DTX- pos X pos DTX- pos X pos PTX- pos X pos PTX- pos X pos PTX-sa* pos X pos YTX neg X neg omo-ytx* neg X -YTX neg X -omo-ytx* neg X AZA- pos X pos AZA- pos X pos AZA- pos X pos *MRM 参数参考文献表. MRM 参数和质谱设定 5

6 结论通过国际合作研究进行方法验证合作研究是在 64 LFGB 工作小组的藻类毒素框架下进行的, 由联邦消费者保护和食品安全 (BVL) 办公室主办化合物检测限定量限 A 6 µg/kg 0 µg/kg DTX- & 6 µg/kg 0 µg/kg AZA- to 6 µg/kg 0 µg/kg PTX- & 6 µg/kg 0 µg/kg YTX 0 µg/kg 5 µg/kg 方法检测限 (MRL): 原始贝类样品中 A,DTX- &, PTX- & 的总和 : 相当于 60 µg/kg A 方法检测限 (MRL): 原始贝类样品中原多甲藻酸的总和 : 相当于 60 µg/kg AZA- 方法检测限 (MRL): 原始贝类样品中虾夷扇贝毒素的总实际贝类样品的总离子流图 x ESI MRM Frag=00.0V CID@** > d Smooth AZA- AZA- AZA [min] 图 4. 实际样品提取物浓度 :96 µg/kg AZA-, µg/kg AZA-,50 µg/kg AZA-, µg/kg A 和 0 µg/kg DTX- * 根据文献的数据暂时定义得到 PTX-sa, 无法获得 PTX-sa 标样 PTX-sa*? A DTX- 和 : 相当于 000 µg/kg YTX 表熟的研磨贝类样品中亲脂性海洋生物毒素的检测限和定量限分析结果的重现性 (S.D.) 在 0 % 至 5 % 之间 ( 取决于样品基质浓度待测物 ) 提取回收率在 75 % 至 0 %( 取决于待测物和样品基质 ) 实际贝类样品的提取离子流图 x0 +ESI MRM Frag=0.0V CID@** > d AZA- AZA- AZA- PTX-sa*? A DTX- DTX- 优势安捷伦 00 SL 快速高分离液相色谱 / 6460 三重四极杆液质联用系统用于贝类中海洋生物毒素的高灵敏度和高选择性分析样品前处理简单成本低分析流程容易, 适合常规分析, 具有很高的可靠性符合 EFSA 的法规要求具有很高的灵活性, 可以扩展至其它亲脂性毒素的检测分析 Counts vs. Acquisition [min] Time [min] 图 5. 实际贝类样品提取物,AZA- 检测限 - < 0 µg/kg 浓度 :7 µg/kg A,0 µg/kg DTX- 和 69 µg/kg DTX- * 根据文献的数据暂时定义得到 PTX-sa, 无法获得 PTX-sa 标样质控样品的离子流图 x ESI MRM Frag=00.0V CID@** > d Smooth AZA- PTX- A [min] 图 6. 质控样品,5 µg/kg AZA-,PTX- 和 A, 贝类加标提取样品 6

7 校正曲线 ( 基质匹配 ) AZA- - 6 Levels 6 Levels Used 8 Points 8 Points Used 0 QCs y= * x x0 R = AZA ng/ml A - 6 Levels 6 Levels Used 8 Points 8 Points Used 0 QCs y= * x x0 R = ng/ml A 图 7. 贝类提取物中的 AZA- 和加标 A 的校正曲线, 线性拟合, 包括原点, 没有权重 AZA- 的浓度范围是.5 至 5 ng/ml,a 的浓度范围是. 至 8 ng/ml 校正曲线 ( 甲醇 ) AZA- - 7 Levels 7 Levels Used 8 Points 8 Points Used 0 QCs x0 6 y= * x R = AZA ng/ml A - 7 Levels 7 Levels Used 8 Points 8 Points Used 0 QCs x0 5 y= * x R = A ng/ml 图 8. 甲醇中 AZA- 和 A 的校正曲线, 线性拟合, 包括原点, 没有权重两个化合物的浓度范围都是.5 至 50 ng/ml 7

8 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任本资料中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,00 00 年 9 月日, 中国印刷 CCN

前言海洋生物毒素是全球食品安全关注的主要焦点之一, 尤其是在沿海国家中国的海洋食品易受海洋生物毒素的污染近年来, 由于水体的工业化和富养化, 中国的内海经常发生浮游植物的大量增殖水生物种的大规模海水养殖, 尤其是占中国海水养殖产品总产量 4.7% 的贝类养殖, 进一步促进了浮游植物的增殖原多

前言海洋生物毒素是全球食品安全关注的主要焦点之一, 尤其是在沿海国家中国的海洋食品易受海洋生物毒素的污染近年来, 由于水体的工业化和富养化, 中国的内海经常发生浮游植物的大量增殖水生物种的大规模海水养殖, 尤其是占中国海水养殖产品总产量 4.7% 的贝类养殖, 进一步促进了浮游植物的增殖原多改进的 QuEChERS 方法结合超高效液相色谱 - 三重四极杆质谱测定食用贝类中原多甲藻酸贝类毒素 * 应用简报作者 Shen Han,Peiyue Wang,Ying Liu, Jin Gu,Jinhua Wang 北京出入境检验检疫局中国北京 Meiling Lu,Shan Zhou 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司中国北京摘要我们已开发了一种检测贝类中原多甲藻酸贝类毒素的方法该方法采用改进的