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1 中南大学学报 医学版! 波动性高糖诱导的内皮细胞凋亡与 0 信号转导途径 汤智敏 雷闽湘 中南大学湘雅医院内分泌科 长沙 岳阳市一人民医院老年病科 湖南岳阳 摘要 目的 观察波动性高糖对人血管内皮细胞凋亡的影响 并探讨其机制 方法 波动性高糖 或 +6 与恒定性高糖 +6 作用于人脐静脉内皮细胞 5 用 /!( 7 双染流式细胞仪检测细胞凋亡率 $!* 荧光染色观察凋亡形态学变化 比色法测定培养液中超氧化物岐化酶 % 活力和丙二醛 2/ 含量 E!!, 印迹测定磷酸化 * 0$ 末端激酶 0 水平 结果 波动性高糖组的细胞凋亡率明显高于恒定性高糖组 < 且其培养液中 % 活力降低 < 2/ 含量增加 < 细胞 0 水平增高 < 0 特异性抑制剂 应用后降低了波动性高糖诱导的细胞凋亡率 < 抗氧化剂维生素 ; 应用后抑制了细胞内 0 水平的升高 < 降低了细胞凋亡率 < 结论 波动性高糖较恒定性高糖更易促发培养的人脐静脉内皮细胞凋亡 其机制可能与氧化应激水平增高 进而激活 0 信号转导途径有关 关键词 血管内皮细胞 波动性高糖 凋亡 氧化应激 %7 "" 3(5 55 '#/+!,! #!./08'(( 6172(() -!"$(.$&'%"&'" "$" $' "& " -!"$(2$"$ $ "8'"& 8'"& " " $().!-+!!!!*(!,(!() )+*!!( (+(*+-!(!!+(+*!+ $&1; (!*(* 7!,(!() )+*! *() )+*!!,!+(! $&1;,5 +*!!, +,! *!(()( $!*!,!!!!*($&1;.!!,(!(! % *(-(!*!++!! 2/ ( *+,!+(!,!!!*! ( *+,(!,!*)!0 +!-!+!,!!(! E!!, +%!.! (,!-(+()!,(!(!,(!() )+*!), (!* () )+*!), <.!% *(-(()((*++!,(!(!,(!() )+*!), < 2/ +!-!+()!,!*() )+*! <!(((,0!*,!!!(,!(*! (!,(!() )+*! < / (( (( ; (((!!0!*,!!!(,! <! 7!,(!() )+*!(!(!,,!!,(*!!* 收稿日期 " # #" 作者简介 汤智敏 硕士研究生 主要从事糖尿病及其并发症方面的研究 通信作者! 雷闽湘 1(+ +!(+**

2 波动性高糖诱导的内皮细胞凋亡与 0 信号转导途径 汤智敏 等 5 $&1; *() )+*! (* **,!(*,!! ((-!,!! *(-!0()+,*( +, -*+,!!+(+*!+ (!,(!() )+*! ( ((-!,! 作为糖尿病的共同特征 高血糖是导致糖尿病血管内皮功能损伤的一个重要影响因素 慢性持续性高血糖与慢性波动性高血糖可能是高血糖对糖尿病患者血管内皮功能损伤的两种作用方式 糖尿病慢性并发症的发生发展不仅与整体血糖水平相关而且还与血糖的波动性密切相关 此外近年来许多研究表明波动性高糖较持续性高糖对血管内皮功能的损害可能更严重 但其机制尚不十分明确 本研究旨在初步探讨波动性高糖对人血管内皮细胞凋亡的诱导作用 及氧化应激 * 0$ 末端激酶 0 信号转导途径的作用机制 探索糖尿病慢性血管并发症发生的可能机制 -. 材料与方法 主要材料 212 培养基 低糖 为北京海克隆公司产品 胰蛋白酶 1./ 胎牛血清! 葡萄糖 )+ *! 8+ $!* 均为德国 () 公司产品 E!!, 细胞裂解液为江苏碧云天生物技术研究所产品 /!( 7.; 凋亡检测试剂盒为上海晶美生物工程有限公司产品 丙二醛 2/ 测定试剂盒 超氧化物歧化酶 % 活性测试盒均为南京建成生物有限公司产品 0 一抗 辣根过氧化物酶标记的二抗 *( 均为美国 ;,9 公司产品 1;6 检测试剂盒为 公司产品 维生素 ; 公司产品 人脐静脉内皮细胞株 $&1; 的培养和分组 $&1; $&1; 购自中南大学湘雅医学院细胞中心 用含 胎牛血清的 212 低糖培养液 放入 5 C ;% 无菌培养箱内培养 取对数生长期的 $&1; 细胞 以 6 浓度传至 孔板中 以 D 6 浓度传至 * 培养瓶中 待细胞均匀铺满孔底面或瓶底面后 换含 胎牛血清的 212 低糖培养液培养 后将细胞依培养条件不同分为 组 对照组 恒定加入 组 恒定加入 组 每 轮换加入 +6 或 维生素 ; +6 组 组 同时以甘露醇作为高渗对照 各组每 换液 次 共培养 5 内皮细胞凋亡形态学观察 孔板中细胞去除培养基 C 洗 次 多聚甲醛在 C 下固定 ( 洗 次 加入 +6 $!* 染色 洗 次 置于倒置荧光显微镜下观察并拍照 内皮细胞凋亡定量分析细胞培养 5 后 去培养基 用 缓冲液洗细胞 次 结合缓冲液重悬细胞 调整浓度为 6 加入 6 膜联蛋白 /!( 7.; 和 6 )6 的碘化丙啶,(( ((!7 混匀后于室温避光孵育 ( 在每管中加 6@ 稀释后 以流式细胞仪检测并计算 /!( 7.; 及 7 双染阳性细胞百分含量 培养液中 % 活性及 2/ 含量的检测细胞培养 5 后收集全部条件培养液, ( 离心 ( 取上清液于 #5 C 保存备测 用分光光度计检测样本吸光度 计算出培养液中 % 活性及 2/ 含量 E!!, 印迹检测磷酸化 0 水平将 * 培养瓶中的 $&1; 用 洗 次 用细胞裂解液裂解细胞 冰上孵育 ( 后 C,( 离心 ( 取 6 样品 以 /81 分离蛋白质 之后转移至聚乙二烯双氟化物 +-(+(!!+,(! 膜 室温下以 脱脂奶粉封闭液封闭 加

3 中南大学学报 医学版! F 的兔抗 0 抗体于 C 过夜孵育 之后 加 F $A 标记的羊抗兔抗体于室温下孵育 1;6 试剂盒孵育 ( 4 光片感光 显影 用 /+7)!, 图像处理系统扫描测定感光区带平均积分吸光度 /*( 作为内对照 计算磷酸化 0 0 的蛋白相对含量 5 统计学处理 统计软件包进行数据处理 数据均以均数? 标准差? 表示 多组间参数比较采用单因素方差分析!/0%/ 如有差异 多组间参数两两比较采用 6 检验 以 G 为差异的检验水准. 结.. 果 $&1; 凋亡的核形态学改变 $!* 是一种核特异性荧光染料 可以透过细胞膜与核 0/ 特异性结合 发出蓝光 正常 $&1; 细胞核内 0/ 分布相对均匀 核无固缩 故在视野中呈现体积较大的浅染核形态 而凋亡中的 $&1; 细胞核内 0/ 浓聚 核出现不同程度的固缩 故呈现体积明显缩小的深染核形态 图 ; 分别显示 +68+ 组 +68+ 组 +68+ 组 $&1; 正常及凋亡的核形态学改变 $&1; 凋亡定量 /!( 7.; 染色 流式细胞仪检测 测得 / 组细胞凋亡率为? 组和 ; 组细胞凋亡率分别为 5? " 和? 均高于 / 组 < ; 组 < 甘露醇高渗对照组与 / 组相比 差异无统计学意义 B 图 图 培养液中 % 活性改变及 2/ 和 ; 组培养 5 培养液中 % 活性明显降低 且 ; 组培养液中 % 组 < 表 而培养液中 2/ 含量明显升高 且 ; 组 < 表 波动性高糖对血管内皮细胞 0 蛋白表达的影响与 / 组和 ; 组细胞 0 蛋白表达显著增高 且 ; 组细胞 0 组 < 图 维生素 ; 及 对波动性高糖诱导的细胞凋亡率 % 活性 2/ 含量及 0 表达的影响应用抗氧化剂维生素 ; 后 % 活性增加 2/ 含量下降 且显著抑制了波动性高糖导致的 0 水平的升高 < 降低了波动性高糖导致的细胞凋亡率 < 0 特异性抑制剂 应用后显著降低了波动性高糖诱导所致的细胞凋亡率 < 但对 % 活性及 2/ 含量无影响 表 图 = 图 -. 高糖 波动性高糖作用诱导 07 细胞凋亡 0> / 组 ; +68+ 组 "1-.$07! #!!0> 1/ +68+ ),@ +68+ ),; +68+ ),

4 波动性高糖诱导的内皮细胞凋亡与 0 信号转导途径 汤智敏 等 "! "#$%&! "#$%&! "#$%&! "#$%&! "#$%& 图. 高糖 波动性高糖作用诱导 07 凋亡的流式细胞图 / 组 ; 组 +68+ 维生素 ; 组 组 "1.",# # 07! #!!1/ ),; +68+ ), +68+ (;), ), 表 -. 高糖 波动性高糖培养 075 培养液中 ( 活性和 *$ 含量的比较 3 < &1-. # ( *$ 07!! 5 #! 组别 % 活性 &6 2/ 含量 +6 图. 高糖 波动性高糖培养 075 的凋亡率 < 组 组 组 +68+ 维生素 ; 组 组 与 组比较 < 与 +68+ 组比较 < 与 组比较 < " 1. $07! #8!! ), ), +68+ ), +68+ (;), ), ;,! ( +68+ ), < *,! ( +68+ ), < *,! ( +68+ ), < +68+ "?? ?? +68+ """?? +6?"? 8+ 维生素 ; +6 8+?" "5? 与 +68+ 组比较 < 与 +68+ 组比 较 < 与 +68+ 组比较 <

5 中南大学学报 医学版!! "#$ %&' %&' 图. 波动性高糖对血管内皮细胞 8/+ 蛋白表达的影响 /E!!, 各组 0 相对吸光度值的比较 +68+ 组 +68+ 组 +68+ 组 +68+ 维生素 ; 组 +68+ 组 与 +68+ 组比较 < 与 组比较 < 与 +68+ 组比较 < "1. #!98 8/+1/E!!, -,*!-+!0,!(!,!( (!* ), +68+ ), ), +68+ ), +68+ (;), +68+ ), *,! ( +68+ <*,! ( +68+ < *,! ( +68+ <. 讨.. 论 糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合征 各种慢性并发症是其主要致死致残原因 在死亡的原因中 =5 是由于大血管病变引起的心脑血管疾病所致 研究显示血糖的波动性可以加速动脉硬化 血管内皮细胞 -*+,!!+(+*!+ 1; 的凋亡与增殖之间的动态平衡维持内皮细胞数量的稳定和血管功能的正常 1; 凋亡是糖尿病引起血管内皮损伤和功能障碍过程中一个重要的早期事件 本研究通过 $!* 染色荧光显微镜形态学观察和 /!( 7.;7 双染流式细胞术两种不同的方法 证实了波动性高糖与恒定性高糖均能诱导 $&1; 发生凋亡 而波动性高糖培养 $&1;5 后 细胞凋亡率较恒定性高糖组明显增加 提示波动性高糖较恒定性高糖对内皮细胞的损伤作用更大 这就较好地解释了糖尿病患者血糖控制不稳定时更易出现大血管并发症这一现象 氧化应激是导致血管内皮功能异常的重要因素 它产生的活性氧使内皮细胞和血管平滑肌细胞发生改变 影响血管壁细胞的生长和凋亡 研究发现血糖波动更容易引发氧化应激 5 笔者选取简便 经济 易测的 % 和 2/ 作为观察指标 反映高糖及波动性高糖作用下 $&1; 氧化应激状况 结果显示 恒定性高糖 波动性高糖诱导的 $&1; 凋亡过程中均伴有培养液 % 活性降低 2/ 含量增加 且波动性高糖组的这种改变更明显 提示波动性高糖组氧化应激水平 较恒定性高糖组高 有研究表明 抗氧化剂维生素 ; 单独或与维生素 1 合用可改善内皮依赖的血管舒张功能 减少蛋白尿 本试验发现抗氧化剂维生素 ; 能部分抑制波动性高糖诱导的细胞凋亡率 降低氧化应激水平 提示波动性高糖诱导的 $&1; 凋亡增加可能与氧化应激水平增高有关 0 又称为应激活化蛋白激酶 / 是有丝分裂原活化蛋白激酶 2/ 家族成员之一 0 通路的激活与细胞凋亡有密切关系 " 本实验发现 恒定性高糖及波动性高糖作用 $&1; 5 后 二者 0 磷酸化水平均增高 且波动性高糖组较恒定性高糖组增高更明显 0 特异性抑制剂 能显著抑制 0 磷酸化水平 并能显著降低波动性高糖诱导的细胞凋亡率 表明二者诱导细胞凋亡过程中均伴有 0 通路的激活 且波动性高糖组较恒定性高糖组更明显 为了解波动性高浓度葡萄糖所致的氧化应激增加与 0 通路激活之间的关系 本实验应用了抗氧化剂维生素 ; 观察其对波动性高糖所诱导的氧化应激增加与 0 通路激活的影响 实验发现维生素 ; 能显著增加 % 活性 降低 2/ 含量 并能显著抑制波动性高浓度葡萄糖诱导产生的 0 磷酸化水平增高 提示波动性高浓度葡萄糖引起的 $&1; 凋亡增加 可能与波动性高糖环境下氧化应激水平增高 进而激活 0 信号转导途径导致细胞凋亡有关 综上所述 波动性高糖较恒定性高糖对血管内皮细胞的损害更大 因此波动性高血糖相对于

6 波动性高糖诱导的内皮细胞凋亡与 0 信号转导途径 汤智敏 等 持续性高血糖更能增加糖尿病患者发生慢性血管并发症的危险性 通过合理治疗 全面精细地控制患者的血糖 避免血糖频繁波动 对于改善患者的预后至关重要 抗氧化治疗可能对防治 型糖尿病血管病变有一定的作用 (*( 等研究表明高糖及波动性高糖诱导的内皮细胞凋亡与线粒体的过氧化物过度产生有关 防止线粒体的氧化损伤将可能成为糖尿病治疗的新策略 参考文献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本文编辑 陈丽文

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南通大学杂志社 南通大学学报 医学版. */(& 0 1&( () (' / ' '-& -' (- 评价血清 %'8$ 在肝细胞肝癌诊断中的作用 张 玉 邵建国 陈 琳 卞兆连 管海涛 南京中医药大学 南京 江苏省南通市第三人民医院肝病研究所 摘 要 目的 探讨血清 %'8$ 作为一种新的生物标志 .*/& 0 1&) '/' '-& -'- 评价血清 %'8$ 在肝细胞肝癌诊断中的作用 张 玉 邵建国 陈 琳 卞兆连 管海涛 南京中医药大学 南京 江苏省南通市第三人民医院肝病研究所 摘 要 目的 探讨血清 %'8$ 作为一种新的生物标志物在肝细胞肝癌 2&-*&/ -&/-'%&3 44 诊断中 的作用 方法 采用实时定量聚合酶链式反应 /&$'% 9*&'&' 2%/& -&' /&-'3

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