252 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 25 卷起艾滋病恶性肿瘤和器官移植等免疫功能严重抑制或缺陷患者死亡的原因之一弓形虫分泌的棒状体蛋白 (rhoptryproteins,rops) 在其入侵细胞过程中发挥了极其重要的作用 ROPs 主要分布于纳虫泡膜纳虫泡内和宿主细胞内 ( 细胞核和细

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羊吕
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1 第 25 卷第 3 期 2015 年 5 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.25 No.3 May2015 弓形虫棒状体蛋白 16 的原核表达及多克隆抗体制备刘原 1, 杨华 1, 吴亮 1, 苏丹华 1, 付涛 1, 郭雪 1, 刘曼 1, 姜旭淦 1, 陈盛霞 1 2, 曹建平 (1. 江苏大学医学院, 江苏镇江 ;2. 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所, 上海 ) [ 摘要 ] 目的 : 克隆刚地弓形虫 RH 株速殖子棒状体蛋白 (rhoptryprotein,rop)16 基因, 并构建 ROP16 基因的原核表达系统, 检测和定位 ROP16 蛋白的表达方法 : 以弓形虫 RH 株速殖子基因组 DNA 为模板,PCR 扩增弓形虫 ROP16 基因, 克隆至 pet 32a(+) 载体, 在大肠埃希菌 Roseta 中诱导表达经 KCl 染色切胶法纯化重组 ROP16 蛋白, 并制备其兔多克隆抗体采用蛋白质印迹法和间接免疫荧光法检测和定位 ROP16 在弓形虫速殖子内的表达结果 : 成功表达并纯化重组 ROP16 蛋白, 制备了其多克隆抗体蛋白质印迹法检测出相对分子质量为的特异性条带, 间接免疫荧光实验显示 ROP16 分布于弓形虫速殖子胞质内结论 : 经原核表达重组 ROP16 制备的多克隆抗体能检测和定位 ROP16 在弓形虫速殖子内的表达 [ 关键词 ] 刚地弓形虫 ; 棒状体蛋白 16; 原核表达 ;KCl 染色切胶 [ 中图分类号 ] R382.5 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2015) DOI: /j.isn y Prokaryoticexpresionandpolyclonalantibodypreparationof rhoptryprotein16from Toxoplasmagondi LIUYuan 1,YANGHua 1,WULiang 1,SUDan hua 1,FUTao 1,GUOXue 1,LIUMan 1,JIANGXu gan 1, CHENSheng xia 1,CAOJian pin 2 (1.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013;2.NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDisease ControlandPrevention,Shanghai200025,China) [Abstract] Objective:Tocloneandconstructarecombinantexpresionplasmidofrhoptryprotein (ROP)16fromtachyzoitesofToxoplasmagondi(T.gondi)RH straininescherichiacoli,andtodeter mineandlocatetheexpresionofrop16intachyzoites.methods:therop16genewasamplifiedfrom genomicdnaoft.gondirhstrainandclonedintotheplasmidpet 32a(+).Theexpresionofthere combinantpet32a ROP16wasinducedinE.coliRosetastrain,andROP16waspurifiedbycutingthegel sliceswithkclstain.theanti ROP16polyclonalantibodywasproducedinrabbit,andROP16intachyzoi teswasanalyzedbywesternblotingandindirectimmunofluorescenceasay(ifa)respectively.results: TherecombinantplasmidpET32a ROP16wassuccesfulyexpresedandpurified,andtheanti ROP16 polyclonalantibodywasobtained.the74000specificbandofrop16wasdetectedbywesternbloting, andtherop16wasdistributedinthecytoplasmoftachyzoitesbyifa.conclusion:theanti ROP16poly clonalantibodypreparedbyrecombinantrop16candetectandlocatetheexpresionofrop16intachyzoi tesoft.gondi. [Keywords] Toxoplasmagondi;ROP16;prokaryoticexpresion;KClstain 刚地弓形虫 (Toxoplasmagondi) 是专性细胞内寄生原虫, 几乎可感染包括人类在内的所有恒温动物弓形虫感染会导致孕妇胎儿畸形流产早产甚至死胎同时, 作为一种机会致病寄生虫, 它也是引 [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( ); 卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室开放课题 (WSBKTKT201302); 中国博士后科学基金资助项目 (2014M561598); 江苏省博士后科研资助计划项目 ( C); 江苏大学高级人才启动基金资助项目 (13JDG023,13JDG127) [ 作者简介 ] 刘原 (1991 ), 女, 硕士研究生 ; 陈盛霞 ( 通讯作者 ), 教授, 博士生导师,E mail:chensxia@ujs.edu.cn

2 252 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 25 卷起艾滋病恶性肿瘤和器官移植等免疫功能严重抑制或缺陷患者死亡的原因之一弓形虫分泌的棒状体蛋白 (rhoptryproteins,rops) 在其入侵细胞过程中发挥了极其重要的作用 ROPs 主要分布于纳虫泡膜纳虫泡内和宿主细胞内 ( 细胞核和细胞质 ) [1], 仅有 ROP16 和蛋白磷酸酯酶 2C(PP2C Hn) 被发现可以入侵宿主细胞核 ROP16 可通过影响细胞的信号转导和转录激活因子 (STAT) 信号传导途径, 干扰细胞的增殖分化及凋亡等 [2] 此外, ROP16 属于 ROP2 家族成员, 是丝氨酸苏氨酸激酶, 并具有蛋白激酶活性 [3], 在弓形虫逃避宿主免疫应答中起重要的作用 [4] 国内尚未见弓形虫 ROP16 原核表达的相关报道本研究通过对弓形虫 ROP16 进行原核表达, 制备其多克隆抗体, 检测并定位 ROP16 在弓形虫速殖子中的表达, 为深入研究 ROP16 的功能及阐明弓形虫的致病机制提供基础数据 1 材料与方法 1.1 虫株细胞株菌株载体和动物刚地弓形虫 RH 株速殖子由复旦大学医学院病原生物学系徐大刚教授提供, 液氮中长期保存将我室长期保存在液氮中的人包皮成纤维 (HFF) 细胞培养于含 15% 胎牛血清 DMEM 培养液中, 用 0.25% 胰酶消化传代培养于 37 5% CO 2 细胞培养箱中原核表达载体 pet 32a(+) 及大肠埃希菌 (E. coil)dh5α 株和 Roseta(DE3) 株为本室保存 ptg19 T 载体购自上海捷瑞生物工程有限公司雄性新西兰兔, 约 2.0kg, 购自江苏大学动物实验中心, 清洁级环境下饲养 1.2 主要试剂和仪器限制性内切酶 EcoRⅠ XhoI 和蛋白质分子质量标准品 ( 立陶宛 Fermentas 公司 ); 质粒小量制备试剂盒 ( 离心柱型 ) GenClean 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 离心柱型 ) 2 PCR 预混液牛血清白蛋白购自上海捷瑞生物工程有限公司 ; 胎牛血清购自杭州四季青公司 ;DMEM 培养液购自美国 Thermo Fisher( 中国 ) 有限公司 ;FITC 标记羊抗兔 IgG(FITC IgG) 辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG(HRP IgG) 和硝酸纤维素膜购自武汉博士德公司 ; 弗氏完全佐剂和不完全佐剂 ( 美国 Sigma 公司 ); 增强型 ECL 化学发光检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司全自动凝胶成像仪及垂直电泳仪 ( 美国 Bio Rad 公司 ), 激光共聚焦显微镜 ( 德国莱卡公司 ) 1.3 DNA 的提取参照文献 [5] 的方法体外培养弓形虫速殖子于 HFF 细胞中, 镜下观察到虫体胀破 80%~90% 细胞, 并可见虫体游离于细胞外时, 收集虫体按试剂盒操作说明提取弓形虫速殖子基因组 DNA,-20 保存备用 1.4 目的基因扩增根据基因库中显示的弓形虫 RH 株速殖子基因组 ROP16 的基因序列 ( 登录号 GQ ), 利用 DNAStar 引物设计软件设计引物上游引物 ROP16 F:5 GGCGAATTCATGAAAGTGACCACGAA AGGGCTT 3 ( 下划线为 EcoRⅠ 酶切部分 ), 下游引物 ROP16 R:5 GGCCTCGAGCATCCGATGTGAAGA AAGTTCGGTAG 3 ( 下划线为 XhoI 酶切部分 ), 由上海捷瑞生物工程有限公司合成以速殖子基因组 DNA 为模板, 扩增弓形虫 ROP16 编码基因 PCR 反应体系 :PCRGreenMix25μL, 上游引物和下游引物各 2μL, 模板 DNA4μL, 灭菌蒸馏水 17μL, 总体积为 50μL 反应条件:94 10s( 热启动 );94 5s, s,72 2min, 共 25 个循环 ;72 延伸 10min PCR 产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 用 GenClean 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收 PCR 产物并纯化 1.5 ROP16/pET32a 表达载体的构建将目的基因片段与载体 ptg19 T 连接, 构建 ptg19 T ROP16 载体将 ptg19 T ROP16 转化 DH5α 感受态细胞, 经氨苄西林筛选 PCR 扩增及 BamHⅠ 酶切鉴定, 测序分析阳性克隆将测序正确的阳性重组质粒以限制性内切酶 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 酶切回收 ROP16 基因片段, 通过 T 4 连接酶与 pet32a 连接, 构建 pet32a ROP16 表达载体, 转化 DH5α 感受态细胞, 经过氨苄西林筛选及酶切鉴定阳性克隆 1.6 重组 ROP16 在 Roseta 菌中的诱导表达将重组 ROP16 阳性克隆质粒导入 Roseta 感受态菌中取培养 12h 的阳性克隆菌液 200μL, 按比例加入含氨苄西林的 20mLLB 培养基中当光密度值 [D(600nm)] 达到 0.6 左右, 将上述菌液加入终浓度为 0.4mmol/L 的 IPTG 进行诱导表达, 分别于 2,4,6,8,10h 收集菌体, 取 5μL 离心后样本上清液进行 SDS PAGE 分离, 并根据电泳结果确定最佳诱导条件 1.7 重组 ROP16 蛋白的纯化按最佳诱导条件诱导表达, 收集菌体沉淀, 加入 PBS 并重悬混匀, 取冰上超声裂解后上清液和沉淀

ROP16, 收集菌体沉淀并用包涵体洗涤缓冲液充分洗涤除去杂蛋白, 经包涵体结合缓冲液变性超声裂解等处理后得到上清液,SDS PAGE 电泳后, 用 1mol/L 预冷的 KCl 溶液染色 5min, 对照考马斯亮蓝染色的蛋白标准分子质量, 可见 1 条明显的目的条带将目的蛋白条带切下, 置于 EP 管中,-70 保存 1.

3 第 3 期刘原, 等. 弓形虫棒状体蛋白 16 的原核表达及多克隆抗体制备 253 进行 SDS PAGE 电泳分离, 电泳结果显示目的蛋白在包涵体中故在剩余菌体沉淀中, 按每 100mL 菌液加入 4mL 包涵体结合缓冲液, 超声裂解后取上清液, 采用 Ni NTA 亲和纯化柱纯化蛋白,SDS PAGE 电泳发现无目的条带, 蛋白未能纯化故采用 KCl 染色切胶法纯化目的蛋白 [6] 大量表达重组蛋白 ROP16, 收集菌体沉淀并用包涵体洗涤缓冲液充分洗涤除去杂蛋白, 经包涵体结合缓冲液变性超声裂解等处理后得到上清液,SDS PAGE 电泳后, 用 1mol/L 预冷的 KCl 溶液染色 5min, 对照考马斯亮蓝染色的蛋白标准分子质量, 可见 1 条明显的目的条带将目的蛋白条带切下, 置于 EP 管中,-70 保存 1.8 重组 ROP16 蛋白多克隆抗体制备取出 -70 保存的胶条, 每根胶条加 1mL 弗氏佐剂研磨至肉眼无可见颗粒为止, 于背部皮下注射免疫新西兰兔, 首次免疫使用弗氏完全佐剂研磨, 分别于初次免疫后第 21 天 28 天和 35 天使用弗氏不完全佐剂研磨胶条并加强免疫新西兰兔于最后一次免疫前抽取兔耳缘静脉血, 当 ELISA 法检测的血清抗体效价 > 时, 终止免疫, 心脏采血,4000r/ min 离心 20min, 将血清保存于 -20 备用 1.9 蛋白质印迹法检测 ROP16 的表达将弓形虫 RH 株培养于生长状态良好的 HFF 细胞中, 镜下观察虫体胀破 80%~90% 细胞, 并可见虫体游离于细胞外时, 收集虫体, 以 HFF 细胞作为阴性对照用 10μL1 SDS PAGE 上样缓冲液将虫体及细胞沉淀重悬, 煮沸 5min, r/ min 离心 10min 取上清液 5μL 加样进行 SDS PAGE 电泳, 将目的蛋白于 150mA 80min 条件下转印到 NC 膜上, 用 5% 脱脂奶粉封闭 30min, 将制备的多克隆抗体 (1 200) 作为一抗, 室温孵育 2h, TBST 缓冲液洗涤 3 次 ; 将 HRP 标记的羊抗兔 IgG (1 5000) 作为二抗, 室温孵育 1h,TBST 缓冲液洗涤 3 次后加入 ECL 显色, 观察结果 1.10 间接免疫荧光法 (IFA) 检测 ROP16 的分布无菌条件下于 6 孔细胞培养板每孔中间放置 1 个盖玻片, 加入适量含 15% 胎牛血清 DMEM 培养液, 个 / 孔接种 HFF 细胞细胞生长至 90% 左右时, 个 / 孔接种弓形虫 RH 株, 轻摇混匀后置于 37 5% CO 2 的培养箱中继续培养 24h 后移除培养液, 加入 2mL4% 低聚甲醛室温固定 10min, 吸去低聚甲醛后加入 2mL0.25%Tri tonx 100 透化 10min,5%BSA 室温封闭 2h 滴加兔抗重组 ROP16 蛋白抗血清 (1 200) 室温孵育 1 h, 用 PBS 缓冲液洗涤 3 次 ; 滴加 FITC IgG(1 50) 室温孵育 1h,PBS 缓冲液洗涤 3 次 ; 取 2μLDAPI 至 3mLPBS 缓冲液中, 染色 10min 后再用 PBS 缓冲液洗涤 3 次 ; 封片后激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光在虫体内的分布 2 结果 2.1 弓形虫 ROP16 基因的 PCR 扩增以弓形虫基因组 DNA 为模板, 经 PCR 扩增后进行 0.8% 琼脂糖凝胶电泳, 获得 2121bp 片段 ( 图 1), 与弓形虫 ROP16 理论长度相符 bp bp bp bp bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp M bp M:DL5000DNA 标准参照物 ;1:ROP16 基因 PCR 产物 ;2: 阴性对照图 1 PCR 扩增弓形虫 ROP16 基因 2.2 ROP16/pET32a 重组质粒的鉴定将 ROP16/pET32a 重组质粒进行 EcoRⅠ 和 Xho Ⅰ 双酶切, 得到大小约为 5422bp 和 2121bp 的两条片段 ( 图 2), 与预期结果相符, 说明 ROP16 被完整插入到 pet32a(+) 载体中 bp bp bp bp bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp M bp bp M:DL5000DNA 标准参照物 ;1:ROP16/pET32a(+) 重组质粒图 2 ROP16/pET32a(+) 重组质粒 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 双酶切结果 2.3 重组蛋白的鉴定与纯化诱导表达产物经 SDS PAGE 电泳, 结果显示在相对分子质量处出现 1 条蛋白表达条带 ( 图 3), 与重组质粒理论蛋白分子质量相符将 KCl 染色切胶法纯化获得的胶条与 PBS 混合, 研磨至没有

254 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 25 卷颗粒, 取上清液进行 SDS PAGE 电泳, 可见纯化的蛋白回收条带 ( 图 3) Mr 170 000 130 000 100 000 70 000 55 000 40 000 35 000 25 000 M 1 2 3 99 800 2.

空质粒 ;2: 重组质粒 ;3: 纯化后图 3 弓形虫 ROP16 重组蛋白的表达与纯化 1:HFF 细胞 ;2: 弓形虫 RH 株图 4 蛋白质印迹法检测弓形虫 ROP16 蛋白的表达 2.

弓形虫棒状体分泌的蛋白改变宿主细胞的很多正常生理功能, 从而感染大范围的宿主物种和细胞种类 [7] 目前已鉴定出 9 种棒状体蛋白 [8], 而唯一能入侵宿主细胞核的只有 ROP16 不同弓形虫虫株间 ROP16 基因序列呈多态性 [9],ROP16 因其特殊的功能和在宿主细胞内的定位, 成为宿主和弓形虫之间相互作用的关键因子 [10-11] 本研究采用聚合酶链反应黏性末端双酶切体外定向克隆

4 254 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 25 卷颗粒, 取上清液进行 SDS PAGE 电泳, 可见纯化的蛋白回收条带 ( 图 3) Mr M 弓形虫 ROP16 蛋白的表达蛋白质印迹检测结果显示, 相对分子质量为的条带可被兔抗重组 ROP16 蛋白多克隆抗血清识别 ( 图 4), 与重组 ROP16 蛋白相对分子质量大小相符由此可以证明 KCl 染色切胶纯化法制备的兔抗多克隆抗体具有较高的免疫反应活性 Mr ROP M:DL5000DNA 标准参照物 ;1: 空质粒 ;2: 重组质粒 ;3: 纯化后图 3 弓形虫 ROP16 重组蛋白的表达与纯化 1:HFF 细胞 ;2: 弓形虫 RH 株图 4 蛋白质印迹法检测弓形虫 ROP16 蛋白的表达 2.5 IFA 检测弓形虫 ROP16 的表达激光共聚焦显微镜下可见 ROP16 蛋白的绿色荧光分布于弓形虫速殖子胞质内, 位于细胞核前端, 与棒状体位置相符 ( 图 5) DAPI FITC 图 5 弓形虫 ROP16 蛋白的分布 (IFA 1000) 3 讨论棒状体是仅在顶复门寄生虫中发现的一种专性分泌器官, 其分泌的蛋白直接进入宿主细胞, 发挥各自的功能弓形虫棒状体分泌的蛋白改变宿主细胞的很多正常生理功能, 从而感染大范围的宿主物种和细胞种类 [7] 目前已鉴定出 9 种棒状体蛋白 [8], 而唯一能入侵宿主细胞核的只有 ROP16 不同弓形虫虫株间 ROP16 基因序列呈多态性 [9],ROP16 因其特殊的功能和在宿主细胞内的定位, 成为宿主和弓形虫之间相互作用的关键因子 [10-11] 本研究采用聚合酶链反应黏性末端双酶切体外定向克隆转化感受态细胞筛选鉴定蛋白免疫印迹间接免疫荧光等方法, 对 ROP16 进行原核表达, 成功制备了重组 ROP16 兔多克隆抗体, 并检测到 ROP16 在弓形虫 RH 株速殖子中的表达和分布, 为后续研究 ROP16 的生物学功能及其在弓形虫致病中的作用提供了技术支持目的蛋白在大肠埃希菌中的表达形式分为两种 : 一是非可溶性的包涵体颗粒, 二是可溶性的蛋白质本研究中 ROP16/pET32a(+) 重组蛋白以包涵体形式存在, 未能用 Ni NTA 亲和纯化法获得目的蛋白, 原因可能是拟表达的重组蛋白相对分子质量较大或空间结构较为复杂, 其 His 标签可能会被包裹在蛋白内, 无法与镍柱结合, 难以通过镍螯合层析法纯化 [12] 于是我们采用染色切胶法获取目的蛋白, 该方法首先要选取一个合适的染料, 不仅能将目的蛋白短时间内显现出来, 而且还不能破坏其结构通常采用的考马斯亮蓝 R 250 染色方法会使蛋白质的一级结构受到影响 [13] [14], 于在江等用 NaAc 染色切胶的方法成功纯化了目的蛋白, 但因电泳染色等过程耗时较长, 使用受到限制与 NaAc 染色切胶法相比,KCl 染色切胶法具有如下优点 :1 更加高效, 获取的目的蛋白可反复冻融, 且不会导致浓度和纯度的改变 ;2 试剂成本低, 性价比高 [15] 本研究采用 IFA 技术, 以重组 ROP16 蛋白制备的多抗, 在弓形虫速殖子入侵的宿主细胞核内未能检测出 ROP16 的分布, 与已有的研究报道不一

5 第 3 期刘原, 等. 弓形虫棒状体蛋白 16 的原核表达及多克隆抗体制备 255 致 [11,16], 可能是制备的多抗特异性没有单抗强下一步我们将构建带有 Myc 标签的 ROP16 突变株, 用 Myc 单抗来检测 ROP16 蛋白在宿主细胞核内的分布 [ 参考文献 ] [1] ZhaoY,FergusonDJ,WilsonDC,etal.VirulentTox oplasmagondievadeimmunity relatedgtpase mediated parasitevacuoledisruptionwithinprimedmacrophages [J].JImmunol,2009,182(6): [2] GilbertLA,RavindranS,TuretzkyJM,etal.Toxoplas magonditargetsaproteinphosphatase2ctothenuclei ofinfectedhostcels[j].eukaryotcel,2007,6(1): [3] 赵桂华, 尹淑霞, 尹昆. 弓形虫棒状体蛋白与宿主细胞互作的研究进展 [J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2014,26(4): [4] 郑斌, 陆绍红. 刚地弓形虫免疫逃避相关分子的研究进展 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2012,30 (5): [5] 吴亮, 章秋霞, 李婷婷, 等. 人包皮成纤维细胞和人子宫颈癌细胞体外培养弓形虫速殖子 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2009,27(3): [6] 鞠爱萍, 吴亮, 沈进, 等. 弓形虫棒状体蛋白 18 的原核表达及鉴定 [J]. 江苏大学学报 : 医学版,2013, 23(3): [7] LimDC,CookeBM,DoerigC,etal.Toxoplasmaand Plasmodiumproteinkinases:rolesininvasionandhost celremodeling[j].intjparasitol,2012,42(1): [8] ReichmannG,DlugonskaH,FischerHG.Characteriza tionoftgrop9(p36),anovelrhoptryproteinoftoxo plasmagonditachyzoitesidentifiedbytcelclone[j]. MolBiochemParasitol,2002,119(1): [9] ButzowR,AlfthanH,StenmanUH,etal.Immunoflu orometricdemonstrationandquantificationofplacental protein5intheabsenceofpregnancy[j].clinchem, 1988,34(8): [10] DubremetzJF.RhoptriesaremajorplayersinToxoplas magondiinvasionandhostcelinteraction[j].cel Microbiol,2007,9(4): [11] SaeijJP,ColerS,BoyleJP,etal.Toxoplasmaco opts hostgeneexpresionbyinjectionofapolymorphickinase homologue[j].nature,2007,445(7125): [12] CaruthersV,BoothroydJC.Pulingtogether:aninte gratedmodeloftoxoplasmacelinvasion[j].curopin Microbiol,2007,10(1): [13] 高慎阳, 查恩辉, 王糰, 等. 一种高性价比切胶纯化原核表达蛋白的方法 [J]. 中国农学通报,2010, 26(22): [14] 于在江, 马学恩, 周建华. 切胶纯化表达蛋白包涵体的可行性分析 [J]. 生物技术,2007,17(3): [15] 姜静, 孙其飞, 陈勇, 等. 切胶免疫制备腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体 [J]. 北京口腔医学,2007,15 (5): [16] BradleyPJ,WardC,ChengSJ,etal.Proteomicanaly sisofrhoptryorganelesrevealsmanynovelconstituents forhost parasiteinteractionsintoxoplasmagondi[j].j BiolChem,2005,280(40): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 陈海林 ( 上接第 250 页 ) [15] 占国清, 吴少庭, 李国光, 等. 弓形虫表面抗原 P30DNA 疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究 [J]. 中国寄生虫病防治杂志,2001,14(4): [16] 高世同, 吴少庭, 龙彩虹, 等. 弓形虫 pvax1 SAG2 真核表达质粒的构建及其诱导的小鼠免疫应答 [J]. 中国人兽共患病杂志,2004,20(8): [17] ChenG,GuoH,LuF,etal.Constructionofarecombi nantplasmidharbouringtherhoptryprotein1geneof ToxoplasmagondiandpreliminaryobservationsonDNA immunity[j].chinmedj(engl),2001,114(8): [18] WangPY,YuanZG,PetersenE,etal.Protectiveefi cacyofatoxoplasmagondirhoptryprotein13plasmid DNA vaccinein mice[j]. Clin Vaccine Immunol, 2012,19(12): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 刘星星

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽