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槐劫仰
5 years ago
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1 !" # $% '!"! 文章编号 ->- "#$%! 论著喆 - -3!" - #$ - %' - 目的建立高效检测刚地弓形虫的环介导等温扩增方法为弓形虫病诊断提供新的技术手段方法采用在线引物设计软件 ()*"! 设计弓形虫 +,* 基因扩增引物用已构建的 *#-+.+,* 重组质粒为模板建立扩增反应通过添加环引物设置不同浓度的甜菜碱和 /0$ 以及不同反应温度对扩增反应体系和反应条件进行优化以猪微小隐孢子虫猪等孢球虫! 的基因组 # 和超纯水为对照 *#-+.+,* 重组质粒为模板分别进行优化后的和扩增评价方法的特异性将 *#-+.+,* 重组质粒梯度稀释为 %!*" 分别进行优化后的和扩增评价方法的灵敏性结果设计的扩增引物可扩增出弓形虫 +,* 序列保守区域的目的片段优化结果显示最佳反应总体系为 " 其中甜菜碱最佳浓度为!" /0$ 最佳浓度为!" 添加环引物反应的扩增效率与未添加环引物反应的扩增效率相当可使反应时间缩短最佳反应条件为特异性检测结果显示所建立的方法可特异扩增弓形虫 +,* 基因片段对照均未扩增出目的片段灵敏性检测结果显示方法的最低检出值达 %!*" 效率为扩增 %!*" 的倍结论建立了弓形虫 +,* 重复序列的检测方法该法具有较好的特异性和灵敏性中图分类号文献标识码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基金项目安徽省高等学校自然科学基金! > 作者单位 - 安徽农业大学动物科学技术学院合肥中国农业科学院兰州兽医研究所兰州 > 4 通讯作者 (" )7/?-%!

2 !" # $% '!"! / / ("/3 9! 3/ /% () /)/ /:;/%/! )/%9% 3 /!!"# #!$!! %#!" 4;))! /3 ( / ;3!9 ;!%/ - 8/ ;" 4%/%/! +*!/)!3 ;! 0." ;:.%!. 弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种人兽共患原虫病该病分布非常广泛全球约有三分之一的人口感染弓形虫弓形虫可通过胎盘感染引起孕妇流产胎儿的畸形死胎等目前弓形虫病的诊断包括多种方法如病原学免疫学和分子生物学等但病原学方法敏感性较差检出率低常导致漏检免疫学检测弓形虫方法也存在假阳性等近年来随着分子生物学技术的发展弓形虫诊断方法得到了改进和发展其中环介导等温扩增作为一种新的基因扩增方法具有简单快速敏感和特异等优点该方法现已应用于某些病原的检测中且在弓形虫检测中得到初步应用弓形虫 () 重复序列基因是一种在弓形虫基因组中重复拷贝的高度保守的基因且已被运用到弓形虫病的分子诊断中该基因较其他靶基因表现出更高的敏感 *+ 性和特异性基于上述情况本研究拟以刚地弓形虫 () 序列为靶基因建立弓形虫检测方法为弓形虫病的快速诊断提供一种新的方法材料与方法虫株刚地弓形虫,- 株速殖子由安徽农业大学动物寄生虫学与寄生虫病学实验室保存引物设计与合成根据已报道的弓形虫 () + 基因序列的保守区域利用日本荣研会社在线引物设计软件./ 0)"!/ 设计弓形虫 () 基因扩增引物运用 $"! 软件进行综合分析筛选出其中一套最佳引物表引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成表! 引物序列 "#$ %! '! 引物名序列./ 4/:;/%/ # 模板的制备利用已构建的 )# () 质粒作为和, 扩增模板反应体系的建立与优化反应体系的建立建立的 " 反应体系包括.!" ".!"2 ".!" ".!" 2 ".!" 3 混合液 " 反应缓冲液 ".!" 甜菜碱 ".!" 4$ " 模板 # " # 聚合酶 " 超纯水补至 " 混匀后点动离心水浴 + 水浴. 进行扩增反应扩增产物经 452, 6// 染色后紫外灯下观察添加环引物按中反应体系设置对照组和试验组各个平行组试验组添加对环引物和各 +.!" 个平行组分别保温.. 分光光度计测定扩增产物浓度扩增产物经 7 琼脂糖凝胶电泳置凝胶成像系统观察反应体系和反应条件的优化甜菜碱设置 + 和.!" 等个浓度 4$ 设置 +..!" 等个浓度反应温度设置等个温度所得产物经 7 琼脂糖凝胶电泳鉴定凝胶成像系统观察条带总亮度以确定最佳反应体系和反应条件引物设计梯度分别为 +.!" 2 +.!".!" 2.!" 特异性检测分别使用猪微小隐孢子虫! 猪等孢球虫 " 基因组 # 和超纯水以及阳性质粒为模板按照的最佳条件进行反应同时进行, 反应体系与条件参照文献 ", 反应体系为, 缓冲液 ".!" 3 " 8" # $ 酶 " 上下游引物各 " # 模板 " 33- $ 补至 ", 反应条件. * * 共个循环 *. 产物经 7 琼脂糖凝胶

!" # $% '!"! 电泳后观察灵敏性检测对模板质粒进行倍比稀释使质粒浓度达到和 %!()" 按照最佳条件反应同时进行 * 反应反应均为 " 扩增产物经 + 琼脂糖凝胶电泳后观察结果 0 /, -./ 扩增结果利用弓形虫 0 -./ 特异性引物对 /# 0 阳性重组质粒进行 -./ 扩增结果显示扩增出大小约 0 的目的条带图 -.

)9: 8 -./!47%! 0! : 8 %!!" ', 添加环引物扩增结果电泳结果显示添加环引物后反应 ) 的扩增产物条带与未添加环引物扩增 ) 所得条带浓度相当约为, ()" 图图 ' 扩增产物电泳结果 "# %$! $ ##!# 0 的 -./ 扩增产物阴性对照 8 -./!47%! 0: 8 %!!" 图扩增产物 ()*+,##! 染色结果 %$! $ $#!

, " 5(" #. 聚合酶, " 总反应体系为, " 反应条件 ) ), -./ 特异性分析结果分别以超纯水猪基因组微小隐孢子虫基因组猪等孢球虫基因组作对照以 /# 0 重组质粒为模板进行 -./ 和 * 扩增结果表明仅 /# 0 重组质粒所对应的泳道有条带出现与预期结果较为一致而对照组均未出现条带图, -./ 与 * 的灵敏性结果检测结果显示 -.

3 !" # $% '!"! 电泳后观察灵敏性检测对模板质粒进行倍比稀释使质粒浓度达到和 %!()" 按照最佳条件反应同时进行 * 反应反应均为 " 扩增产物经 + 琼脂糖凝胶电泳后观察结果 0 /, -./ 扩增结果利用弓形虫 0 -./ 特异性引物对 /# 0 阳性重组质粒进行 -./ 扩增结果显示扩增出大小约 0 的目的条带图 -./ 扩增产物经 * 染色后在紫外灯下发出绿色荧光而阴性对照组则为棕紫色图 0 / / #. 标志物未加环引物反应 ) 加环引物后反应 ) /8 #. )9: ; 8 *%!! 4 )! "!! ): 8 *%!! 4 ) %! "!! ) 图添加环引物扩增结果! "# # #!# $ % # / #. 标志物刚地弓形虫 0 基因的 -./ 扩增产物阴性对照 /8 #. )9: 8 -./!47%! 0! : 8 %!!" ', 添加环引物扩增结果电泳结果显示添加环引物后反应 ) 的扩增产物条带与未添加环引物扩增 ) 所得条带浓度相当约为, ()" 图图 ' 扩增产物电泳结果 "# %$! $ ##!# 0 的 -./ 扩增产物阴性对照 8 -./!47%! 0: 8 %!!" 图扩增产物 ()*+,##! 染色结果 %$! $ $#! $ ()*+,##!, 反应体系和条件的优化结果通过对甜菜碱 /$ 和反应温度扩增环引物浓度反应时间等条件的优化确定了 -./ 扩增最佳反应体系和反应条件具体如下, )!"(- 23, ", )!"(- 3, ", )!"(- 2, ", )!"(-, " )!"(- 4 混合液, " 反应缓冲液, " )!"(- 甜菜碱, ", ))!"(- /$, ", (" 模板 #., " 5(" #. 聚合酶, " 总反应体系为, " 反应条件 ) ), -./ 特异性分析结果分别以超纯水猪基因组微小隐孢子虫基因组猪等孢球虫基因组作对照以 /# 0 重组质粒为模板进行 -./ 和 * 扩增结果表明仅 /# 0 重组质粒所对应的泳道有条带出现与预期结果较为一致而对照组均未出现条带图, -./ 与 * 的灵敏性结果检测结果显示 -./ 方法可检测出的最低浓度为 %!()" 可扩增出目的条带而 * 仅对浓度为 %!()" 及以上的模板方可扩增出目的条带图 -./ 方法的效率为常规 * 方法倍讨论 0 基因序列是由 6!) 等鉴定并引入弓形虫的鉴定中的高度保守的重复序列其拷贝数达此外 #7 等也证实其比弓形虫基因更具有高敏感性和特异性等采用 -./ 方法伴有荧光 * 作对比试验分析了基因和 0 重复序列扩增 0 重复序列易于基因同时认为

" $ 方法检测弓形虫感染的效率高于荧光 + 方法故本试验选取弓形虫 ( * 作为靶基因目的是使试验中所建立检测方法更具有代表性本试验最初使用两对引物进行反应扩增时间需要 - 而后基于原有引物和靶基因扩增区域进行环引物的设计并使用在添加环引物后反应仅需 - 而 + 反应需 - 方可扩增出目的产物这与 -/ 等认为添加环引物后可使的扩增时间缩短一半的结论相一致本实验对影响

4 !" # $% '!"! * ( # 标志物扩增超纯水猪基因组 # 微小隐孢子虫基因组 # 猪等孢球虫基因组 # #()( * 结果 + 扩增 #()( * 超纯水猪基因组 # 微小隐孢子虫基因组 # 猪等孢球虫基因组 #, # -./0,!%! " / / /!-/ /!-/ /!-/ #() ( *0, +!%! #()( * " / / /!-/ /!-/ /!-/ 图特异性检测! " * 5 ( # 标志物扩增 2 %!/3-" #()( * 结果, + 扩增 2 %!/3-" #()( * 结果, # -./0 2,!%! #()( * %!%/!!4 2 2 %!/3-"0 2, +!%! #()( * %!%/!!4 2 2 %!/3-" 图 # $ 的灵敏性 % '! " $ 方法检测弓形虫感染的效率高于荧光 + 方法故本试验选取弓形虫 ( * 作为靶基因目的是使试验中所建立检测方法更具有代表性本试验最初使用两对引物进行反应扩增时间需要 - 而后基于原有引物和靶基因扩增区域进行环引物的设计并使用在添加环引物后反应仅需 - 而 + 反应需 - 方可扩增出目的产物这与 -/ 等认为添加环引物后可使的扩增时间缩短一半的结论相一致本实验对影响反应最重要的个因素即温度甜菜碱浓度和 6 优化发现甜菜碱的影响较大不同品牌产品和浓度具有一定影响其中以美国 5 - 公司生产的甜菜碱最为理想其最适浓度为 -!"3 而 6 浓度和温度影响较小 6 浓度达到 --!"3 时均可满足反应酶活性要求这一结果与陈道桢等报道存在差异本研究在弓形虫检测方法特异性方面选用猪基因组作为对照主要基于猪是最易感弓形虫的动物之一防止该方法用于猪弓形虫检测时因宿主本身影响因素而导致误差结果发现超纯水猪等孢子球虫基因组微小隐孢子虫基因组以及猪基因组之间无交叉反应初步可确定其具有较高的特异性同时所建立的方法灵敏性可达 %!/3-" 是 + 方法的倍这与陈道桢等 7/. 等 " 等 )/.!/ 等和余传信等报道敏高性要高于传统 + 方法至倍的结论较为一致同时本研究结合琼脂糖凝胶电泳比较分析发现反应扩增产物是梯形条带并且也可观察到所建立方法的敏感性明显高于 + 方法个数量级 589+ :// 染色法虽可直观地观察出结果但不适合开展敏感性试验主要由于低浓度的模板导致扩增的产物量少所发出的荧光较弱无法制定阴性和阳性判定标准若使用焦磷酸镁方法时可建立标准曲线易于设定判定标准的阈值虽可用于实时检测但受价格因素的影响不利于推广和使用此外因敏感性较高在打开反应管时进入的气体会导致扩增产物将以气溶胶的形式存在从而污染局域环境这是导致以后试验中出现假阳性的重要因素简而言之该方法检测弓形虫 ( * 基因具有较高的特异性和敏感性但需关注内外源性污染问题参考文献田梦圆黄韵红胡云飞等 ;75 检测白血病和淋巴瘤患者弓形虫抗体阳性率中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 骆方军姚洪锋王永明等鼠尿液中弓形虫 9 基因实时荧光定量 + 检测方法的建立中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 聂大平尤英霞申丽洁等 + 衍生技术在刚地弓形虫基因鉴定和分型中的应用中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 杨秋林张如胜伍和平等应用环介导等温扩增技术检测弓形虫中国寄生虫学与寄生虫病杂志, /"" 9 5 7!%/ :! "!"/%" / /%!!4 #$" % / -"/ 4!- 5%! " %!-! */ // / ( * /" -/ + 7)5 / / + / +/, "" 5 :/-! " ""/ "!! -/ /! /-" -"4%! /%/ 4! -!"/%" / /%!!4 #$" % % )! /, 5 )/.!/ $ *!/ :$! " #$" %, / </ / /%!!4 4/%! *= "!!-/ / 下转第页

5 !" # $% '!"! 报告在泰顺当地有煨烤生吃和醉吃溪蟹习惯本起家庭聚集性并殖吸虫病主要原因是生食溪蟹所致其中人未发病可能是食入未感染并殖吸虫囊蚴的溪蟹或个体免疫机制保护作用首发病例从发病到确诊历经了县市省三级医院时间长达半个月期间被误诊为结核病其余病例花费时间更长说明大多数医务人员和检验人员对并殖吸虫病缺乏足够认识就诊时未详细询问流行病史以致不能及时确诊给患者带来痛苦和经济负担因此需加强医务人员寄生虫病知识培训以免误诊漏诊以达到早发现早诊断早治疗的目的例患者均服用吡喹酮治疗个疗程个月后随访例症状和体征明显好转例嗜酸粒细胞仍较高可能与体内虫体未完全清除有关个月后再次进行治疗及随访治疗的同时开展健康宣传教育工作使患者和当地群众了解并殖吸虫病的传播途径感染方式及危害性并殖吸虫病防治关键在于防止生食或半生食第二中间宿主蟹蝲蛄以及保虫宿主鼠蛙类野猪等野生动物不生饮溪水通过健康教育减少发病率是最有效的防制措施因此广泛开展并殖吸虫病知识宣传培养居民的防病意识杜绝不科学饮食习惯以免病从口入温州市的生态环境适宜螺类和淡水溪蟹生长为了解该市整体并殖吸虫病流行趋势有必要在全市范围内开展流行病学调查深入了解疫源地分布情况为科学防治提供有力依据参考文献刘芸郑小蔚郭琪琼等并殖吸虫病诊断研究进展江西医学检验洪加林陈名刚徐聪琴等永嘉县东坑村肺吸虫病流行停止原因探讨中国人兽共患病杂志洪加林陈名刚常正山等浙江省永嘉县并殖吸虫 # 序列分析形态及核型研究中国寄生虫病防治杂志黄友全洪加林胡中华等卫氏并殖吸虫病例临床分析中国乡村医药杂志阮卫姚立农余可根等 ( 年浙江省部分地区并殖吸虫流行病学调查实用预防医学 ) ))* 阮卫林春萍姚立农等一起肺吸虫病群体暴发的调查报告疾病监测 * ) *** 中华人民共和国卫生部中华人民共和国卫生行业标准 +, ) 并殖吸虫的诊断, 北京中国标准出版社 ) 邢文鸾陈旭丹谢开婿等浙江省肺吸虫病中 - 高度疫源地在泰顺县的发现中国人兽共患病学报 * 潘起潜林宝楚蒋达生东坑村肺吸虫病流行病学调查报告寄生虫与寄生虫病杂志 * 陈胜则陈建平郑沛年永嘉县肺吸虫病感染率分析中国农村卫生事业管理吴观陵人体寄生虫学. 版北京人民卫生出版社 ) ) 宋昌存雷昌球柯士舫等绍兴兰亭防治肺吸虫病效果调查中华预防医学杂志 )* ) )) ) 刘明达陈名刚常正山等健康教育预防肺吸虫病的效果观察中国血吸虫病防治杂志 )) 收稿日期 ) 编辑衣凤芸上接第页! /0" 0"%!. 0/!!" * )) 宋慧群张德林廖申权等中国弓形虫虫株 * 2 重复序列的 3 扩增克隆及分析中国农业科学 * )))) * 袁恒青徐前明李培英弓形虫 * 2 基因的克隆及序列分析畜牧与兽医 ) ))) ) 4!0 + '/%00/. #/ 5/6/"// 7/ %!!!!" // 8/ * 2 # 90/ :/! 9! % ;: 8/ 3 7!" * #: /9 4 / 4,:8/! / %! 0!!!!% /!"! :2"% 6! +: '/!" 90/ 4/!!0 %%/"/ / /%! 2 "!! 0/ /! /0" 0"%! :9 "!! 0/.!" /""!2/ * 陈道桢许飞葛海燕等环介导等温扩增检测弓形虫方法的建立中国实验诊断学 7/6 4 " $ #/8/"!0/! 0:" "/ "!!0/ /! /0" 0"%!0. 0/!! / 0:" /!: / /%!! 2!8/ /.%!2!"./! "!8 0!0 8/ /8":!! / / 8!. 3 %:" :/ 0/!! / 9!! /;:/!"0!!" 3/ ) )))) ) /6!/ $. 7!:/ :2!6 8":!! "!! 0/ /! /0" 0"%!. 3!"!9%" /! / /%!!! //0/ "" /% / 9 '/!" ) ) 余传信殷旭仁李健等环介导同温 # 扩增技术快速检测弓形虫 # 的初步研究中国病原生物学杂志收稿日期 ))) 编辑张争艳

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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