Western Blot 实验报告项目名称 : 人皮肤成纤维细胞 sirna 瞬转 WB 验证客户姓名 : 石小玉报告时间 : 2013 年 08 月 26 日报告人 : 蒋楠复核人 : 如您对本报告有异议, 请于 10 个工作日内联系我们杭州赫贝科技有限公司技术部

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1 Western Blot 实验报告项目名称 : 人皮肤成纤维细胞 sirna 瞬转 WB 验证客户姓名 : 石小玉报告时间 : 2013 年 08 月 26 日报告人 : 蒋楠复核人 : 如您对本报告有异议, 请于 10 个工作日内联系我们

2 1. 实验材料人皮肤成纤维细胞 CCC-ESF-1: 中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心 DMEM-H 培养基,Lipofectamine 2000:GIBCO FBS:Hyclone Caveolin-1 sirna 套装 : 上海吉玛 Caveolin-1 Antibody:sc-894,santa cruz βactin Antibody:sc-47778,Bioworld PVDF 膜 :Millipore 脱脂奶粉 : 伊利彩色预染蛋白分子量标准 :Fermentas ECL Plus 发光试剂盒 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 (5 ) Western 及 IP 细胞裂解液 PMSF BCA 蛋白浓度测定试剂盒 : 碧云天 Tris-Hcl/SDS(1.5mM,PH 8.8) Tris-Hcl/SDS(0.5mM,PH 6.8): 上海生工 30% Acrylamide/Bis solution,29:1 甘氨酸:Bio-Rad Tris 碱 SDS 过硫酸铵:Biosharp 其余试剂均为国产分析纯 2. 仪器二氧化碳培养箱 :3111 型,Thermo 倒置荧光显微镜 :ECLIPSE Ti-S 型,Nikon 台式低速离心机 :80-2 型, 上海医疗器械 ( 集团 ) 有限公司细胞培养瓶 :Fisher Scientific 细胞培养板 :Fisher Scientific 微量加样器 :Thermo

3 台式高速冷冻离心机 :H1650R, 上海卢湘仪台式低速离心机 :TDZ6B-WS, 上海卢湘仪细胞培养塑料平板 (96 孔 ):Fisher Scientific 酶标仪 :SPECTRA max Plus 384,Molecular Devices 电泳系统 :Mini-Proten Tetra System,Bio-RAD 凝胶成像仪 :ChemiDoc XRS+ System,Bio-RAD 3. 相关试剂的配制 10% 过硫酸铵 (AP) 过硫酸胺 0.1 g 超纯水 1.0 ml 溶解后,4 保存, 保存时间为一周电泳缓冲液 Tris(MW ) 3.04 g 甘氨酸 (MW 75.07) g SDS 0.5g 蒸馏水至 1000 ml 转移缓冲液甘氨酸 (MW 75.07) g Tris(MW ) 3.04 g 甲醇 200 ml 蒸馏水至 1000 ml TBST 缓冲液 Tris(MW ) 1.22g NaCl 2.92g Tween20 0.5ml 蒸馏水至 1000 ml 封闭液 ( 含 5% 脱脂奶粉的 TBST) 脱脂奶粉 5 g TBST 缓冲液 100 ml

4 4. 实验步骤 4.1 细胞转染取对生生长期细胞, 接种 6 孔板待细胞贴壁后, 设置 CK 组 ( 正常细胞 ), NC 组 ( 正常细胞转染空载 ),MOCK 组 ( 正常细胞加入等量转染试剂 ), 转染组组 ( 正常细胞转染相应 sirna) 24h 后, 收集各组细胞 4.2 蛋白样品制备向各组细胞加入 70ul 裂解液,4 裂解 30min 4,12000rpm 离心 10min, 取 60ul 上清分装于 1.5ml 离心管中并置于 -70 保存 4.3 蛋白浓度及蛋白变性各组蛋白稀释 10 倍, 以 BCA 法测测定蛋白 OD 值, 根据标准曲线计算样品的蛋白浓度 1:6 加入上样缓冲液, 混匀,95 加热变性 5min, 样本 -70 保存 4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 10% 分离胶和 5% 浓缩胶的配制 (ml) Percent Gel 10% 分离胶 5% 浓缩胶 H 2O mol/l Tris-HCl (ph ) 0.5 mol/l Tris-HCl (ph ) 30% Acrylamide %SDS % AP TEMED (1) 制胶 : 清洗干净玻璃板, 固定在支架上, 在玻璃板之间灌入按上表配制的 10% 的分离胶, 立即用去离子水封闭表面, 于室温下聚合当水封层与分离胶层之间出现明显界面时, 表示分离胶的聚合已完成弃去离子水, 用滤纸吸干, 再灌入 5% 的浓缩胶, 插入梳子, 待胶凝固后, 小心拔去梳子, 备用 (2) 上样前样品的处理 : 加入 5 上样缓冲液混匀,95 放置 5 min, 迅速冰浴中冷却, 上样量为每泳道 30 μg

5 (3) 电泳 : 在电泳槽内加入电泳缓冲液, 接通电源,25mA 恒流电泳至溴酚蓝跑完浓缩胶层, 时间大约为 30 min 分离胶电泳电流为 30 ma, 当溴酚蓝迁移至分离胶下缘时, 关掉电源, 停止电泳 4.5 转膜 (1) 预先配置 1 L 转移缓冲液并冷却至 4 (2) 先将 PVDF 膜在甲醇中浸泡约 30 s, 再在转移缓冲液浸泡 10 min, 后与滤纸凝胶一起放入电转移缓冲液中 (3) 按夹心法依次将海绵滤纸凝胶 PVDF 膜滤纸海绵按顺序放好, 小心去除所有气泡,PVDF 膜位于阳极侧, 凝胶位于阴极侧, 插入电泳槽中, 倒入转膜缓冲液,200mA 稳流电转移, 根据所转蛋白分子量, 约 1 min/kd 4.6 封闭取出 PVDF 膜, 去离子水洗涤将 PVDF 膜浸入含 5% 脱脂奶粉或牛血清白蛋白的封闭液中, 置摇床上缓慢摇动, 室温封闭过夜 4.7 孵育一抗取出已封闭的 PVDF 膜, 浸于 1 TBST 缓冲液中, 于摇床上缓慢洗涤 5 min 然后移入含有一抗的小袋中, 室温孵育 2h 4.8 洗膜从小袋中取出 PVDF 膜, 浸于 1 TBST 缓冲液中, 于摇床上缓慢洗涤 3 次, 每次 15 min 4.9 孵育二抗将 PVDF 膜转移到含二抗的玻璃平皿中, 于室温摇床上孵育 1h 4.10 洗膜将 PVDF 膜浸于 1 TBST 缓冲液中, 于摇床上缓慢洗涤 3 次, 每次 15min 4.11 ECL 化学发光显影将 PVDF 膜置于保鲜膜上, 取适量 ECL 试剂盒中等体积的 A 液和 B 液混合, 混匀后加在膜的表面, 移入凝胶成像分析仪中, 化学光敏模式曝光显影照片以 TIFF 格式导出后在 Image J 软件下分析各条带光密度

6 浓度 μ g/μ l 5. 实验结果 5.1 蛋白浓度标准曲线 OD 浓度 μg/μl 组别 CK NC MOCK sirna439 sirna 548 sirna 710 蛋白 OD 蛋白浓度 μg/μl 标准曲线 y = x R 2 = 浓度 μ g/μ l OD

7 5.2 Western blot 5.3 蛋白表达分析 5.4 小结以 NC 组的表达量为 1.00, 比较各组 Caveolin-1 的表达, 三条 Caveolin-1 sirna 均使 Caveolin-1 蛋白表达量显著降低, 其中 sirna439 和 sirna548 作用最显著结合 Q-PCR 验证结果 ( 见 Q-PCR 验证报告 ), 我们建议以 sirna548 进行后续实验

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