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1 畜牧兽医学报 + 三株弓形虫对昆明鼠致病性的比较研究 李 李 星 周冰洁 李木子 马 磊 刘 群 刘 晶 中国农业大学动物医学院 北京 国家动物寄生原虫实验室 农业部动物流行病学重点实验室 北京 摘 要 刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫 弓形虫属仅有刚地弓形虫一种 但世界各地的分离株有着丰富的遗传多样性 作者以 型 % 和 型 < 虫株为研究对象 通过腹腔接种昆明小鼠 观察小鼠的临床表现 检测血清抗体水平 弓形虫在组织器官的动态分布及脑荷虫量等指标 比较不同虫株对小鼠致病性的差异 结果显示 型虫株接种小鼠表现出更明显的临床症状 监测小鼠血清抗体变化发现 型虫株感染小鼠在第 天即检测到弓形虫特异性抗体 随后抗体水平至第 天持续上升 感染 型虫株小鼠血清在感染后第 天达到峰值并维持在较高水平 并且 三种虫株在小鼠组织器官的动态分布趋势大体相同 感染早期 第 天 侵染肺 肾 肌肉 中期 第 天 多分布在心 肺 肌肉 脑中 后期 第 天 存在于脑中 脾 肾 肝中不易检测到虫体 成功建立了三种弓形虫虫株感染昆明小鼠模型 证明 型和 型虫株对昆明鼠致病力的具体差异 并发现不同基因型弓形虫速殖子感染小鼠后在小鼠体内的分布随时间呈现一定的规律性 为弓形虫致病力的研究和动物模型的建立提供参考 关键词 弓形虫 致病力 组织分布 脑荷虫量中图分类号 文献标志码 # 文章编号 "!#%(#'#%#1!%! %#%'%/ # 4 ' 4 (#! '(##+,%)( #"#0!"#'"#! %!#)( #%"'/0/3 3-/ //330+33/ 33+3+,3033/,30+ %<3/3 /3 /33+/,33/3/03? /0/330+0/0+ 3/3+00/3 3, //3//8033/3+ 3,333+ /,/33/3+,3,#%"/3+ /33,33/+3+,3 ////,33/330 33/ //0/33/ /0/33,/3//0+3/33/+ //3 330+/03/ //300// 3 33/+/30/33/+//30+33/,3 //33330/08,0+03 /#%",30,33//3/33 /33+3/0/3 3//3/0/0/3+/33/3,33/,3 收稿日期 基金项目 国家重点研发计划 ; 北京市自然科学基金 国家自然科学基金 作者简介 李 女 山东烟台人 硕士 主要从事畜禽寄生虫病诊断的研究 /00+ 通信作者 刘 晶 /003/

2 期 李 等 三株弓形虫对昆明鼠致病性的比较研究 #%" 3+,3 / /3 /03803,,#%" /33+/3/03,3//0,30 ()##%"' /33+333/, //3 刚地弓形虫 #%"' 是一种专性细胞内寄生原虫 能感染人及多种动物 弓形虫病在世界范围内广泛流行 可引起人和动物的流产 死胎等 尤其危害例如艾滋病人等患免疫抑制病的人群 甚至是致死性的 目前 弓形虫只发现刚地弓形虫一个种 但有 多种不同的基因型 3 根据它们对小鼠致病力的差异分为 型 型 型 其中 型虫株致病力最强 一个速殖子的有效感染便可以导致小鼠死亡 常与人先天性弓形虫病有关 而 型虫株是自然感染的主要虫株 致病力相对较弱 对小鼠的全数致死量 型虫株可引起慢性感染 是多数艾滋病患者感染的主要虫株 感染小鼠后可在脑内形成包囊 型虫株主要感染动物 对小鼠是低毒力 的 感染小鼠后主要引起神经症状 关于 型虫株致病力的具体差异以及在小鼠各个组织器官中的分布规律 目前的报道主要集中在对组织病理学的动态观察 而且 关于不同基因型弓形虫对我国特有远交鼠 昆明小鼠 致病性的研究较少 目前 仅有关于!5 株 () 株典型强毒株和 ;/+/ 株 #5 株 ) 弱毒株的报道 本试验用不同基因型弓形虫速殖子腹腔接种昆明鼠 观察感染小鼠的临床症状 血清抗体变化 以及用 %(! 方法检测虫体在组织器官的分布规律和脑荷 虫量的情况 比较分析各基因型弓形虫对小鼠致病力 以期丰富多种基因型虫株对小鼠致病特性的认识 为弓形虫入侵机制及防治提供参考 材料与方法 试验材料 弓形虫虫株 型虫株 和 % 型 < 虫株 < 细胞 由国家动物寄生原虫实验室培养和保存 实验动物 清洁级 周龄雌性昆明小鼠 购自北京华阜康生物科技有限公司 试剂及材料 全血组织细胞基因组 "# 快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物技术公司 %(! 相关试剂购自北京全式金生物技术有限公司 实时荧光定量 %(! 检测试剂购自宝生物 大连 工程有限公司 试验方法 试验动物分组和试验设计 将昆明小鼠随机分成 组 分别腹腔接种 型 % 株 个 株 个 型 < 株速殖子 个 另设一组对照组不攻虫 表 感染处理后 每天观察小鼠发病 饮食 活动和精神状态 并记录死亡情况 每隔 称小鼠体重 记录体重变化 在感染后第 天 每组感染小鼠随机取 只 % 组取 只 进行摘眼球采血 分离血清 并无菌取出心 肝 脾 肺 肾 脑及肌肉组织 保存至 M 冰箱待检 表 弓形虫感染小鼠分组情况 ##1'%1)!%! 试验设计 组别 % 株 %3/ 株 3/ < 株 <3/ % 对照 %30 小鼠数量 感染剂量 个 只 血清弓形虫抗体检测 间接 # 方法检测每组各时间点小鼠血清样品的抗体水平 碳酸盐缓冲液将弓形虫全虫抗原稀释至 0 M 包被过夜 > # M 封闭 > 的 %) 洗涤 次后 稀释待检小鼠血清 M 孵育 再次用 %) 洗涤后 用 > # 稀释 5!% 标记的羊抗鼠 M 孵育 同上洗涤 加入显色液 用酶标仪 0 美国!/ 公司 测定 8 值 组织中弓形虫分布的检测 利用 "# 快速提取试剂盒提取各组织器官的基因组 "# 以弓形虫特异性引物 上游引物 ;(() (#####(###)) 下游引物!(()(##(#(#)(#)()#))

3 %/1( 畜!牧!兽!医!学!报!扩增片段大 小 0/[#扩 增 弓 形 虫 0/[ 重 复 序列'%b 琼脂糖凝胶电泳观察 扩增结果' )( 卷! 降(被毛蓬乱(蜷缩发抖等 临床 症状' 其 中! \> 株 在 感染后第 ( 天体重开始下降!第 / 天出现死亡!死亡 %' 0' )! 弓形虫脑荷虫量检测!! 以 感 染 后 第 %( 0( )( (( %( 0( )(( ) 天 感 染 小 鼠 的 脑 组 织 <45 为 模 时间主要集中在第 /% 天!至第 天小鼠全部死 板!利用实时荧光定量 7@3 方法扩增脑组织中 弓形 0 天时降至 最 低!至 第 ) 天 体 重 始 终 维 持 在 低 水 平!第 ) 天后体重开始缓慢增加' " 型虫株感染小 虫 0/ [ 序 列 片 段 大 小 /)[#!扩 增 小 鼠 组 织 亡'感染 7O 株小鼠的体重第 %0 天开始下降!至第 鼠未出现明显的临床症状!与 7\; 对照 组 小 鼠 的 体 重变化无差别!呈缓慢上升趋势"图 %#' 0(;345 序 列 " Y!AT@@5ATTA55A@@A! T@A@5!! 增 片 段 大 小 为 1%[#为 内 参' 按 照 ;_\37 MFM BX + " A 34G, S 7 O,#试 剂 盒说明书进行反 应!反 应 程 序 为 / w 预 变 性,! 随后 / w 变性,! w 退 火 和 延 伸 ),!进 行 ) 个循环'反应结束后分别根据目的基因和内参基因 值计算出所含虫 体 的 数 量 及 组 织 <45 含 量! 运用 3# JN) 分 析 扩 增 曲 线 和 标 准 曲 线 计 算 小 鼠脑组 织 荷 虫 量!本 文 中 小 鼠 脑 荷 虫 量 表 示 为 每 %-L 脑组织 <45 中的虫体数量'!! 结! 果 图 #! 弓形虫感染小鼠体重变化 8 #!\ I9 0 I 17 (J (3 % #)('< 7 I 5 7 B!B!! 病理变化 感染+型虫株的小鼠腹水增多!脾肿大(淤血!肝肿!B #! 感染小鼠的临床症状 感染不同虫株所引起的小鼠症状有所差异' + 大( 淤血! 肺肿胀实变!脑沟回变平!心肿大充血!与对 型虫株感染后第 天 开 始 出 现 精 神 萎 靡 (活 动 性 下 肉变化不明显'感染"型虫株小鼠的病理变化不明显' 照组小鼠相比!试验组小鼠肾体积明显变大"图 0#!肌 5'心 <'肺 F'肾 Y'脑"左图为正常小鼠脏器!右图为弓形虫感染小鼠脏器# 5'S G Q \'? -<'?O-LF'c "-CY'\ G -" D Q, Q# DD,G -# G J # #LC! LO LG- # N# Q, QG B+F+<5 74 D J Q #- J # LN LG-,# 图!! 弓形虫感染小鼠脏器病理变化 8!!40 35 = 5 0 =307 /5 I /0 I 17(J(3 % #)('< 30 = = 7 B

4 期 李 等 三株弓形虫对昆明鼠致病性的比较研究 血清中弓形虫抗体变化感染两种 型虫株的小鼠血清抗体变化趋势大致相同 在感染后第 天检测到弓形虫特异性抗体 第 天后开始迅速增加 % 到第 天仍然保持上升趋势 但感染 < 株第 天达到峰值 之后维持在较高水平 图 图 小鼠血清弓形虫抗体变化!% #1 %-%! ' #1' 弓形虫在小鼠组织器官的分布情况以各取样时间点小鼠的心 肝 脾 肺 肾 脑和后肢肌肉组织 "# 为模板 %(! 扩增弓形虫 特异性基因 综合各取样点的 %(! 检测结果如表 所示 三种虫株感染小鼠后 在体内的分布趋势大体相同 最先扩增出弓形虫特异性基因片段的组织是肺 肾和肌肉 中期多分布在心 肺 肌肉 脑中 且存在时间可以达到一周以上 后期虫体仅在脑中检测到 其中 % 株在第 天时仍然可以检测到 对照组小鼠未在脾 肾 肝三种组织中检测到任何一种虫株 脑荷虫量检测用绝对荧光定量 %(! 检测小鼠在 % 感染后不同时间脑组织荷虫量 结果如图 所示 感染 % 株小鼠的脑组织在第 天检测到弓形虫 第 天脑荷虫量呈上升趋势 与感染初期相比差异显著 0 脑组织 "# 中的量达到约 = 个 表 三种虫株在小鼠组织器官的分布情况,#%#1!%#1%! %'#% 感染后 心 5/3 肝 脾 0 肺 肾?+ 肌肉 0 脑 / 时间 % % < % < % < % < % < % < % < @ 第 @ 第 图 小鼠感染弓形虫 " 株脑荷虫量检测,#%#1'%%#1 讨 论本试验中所选用的三种虫株 % 株 株和 < 株 是引起人和动物弓形虫病的主要虫株 其中 株属于 ( 型 ) 国际上已经确定在中国以 ( 型 ) 为优势 基因型 国内约 > 的弓形虫株基因型属于 ( 型 而流行于欧洲和北美地区的优势基因型为弓形虫原型克隆谱系 /3+0/0 0/ 即 )+ 和 其中 型虫株对小鼠的毒力最强 而 型的代表虫株是 和 % 型虫株有 <() 等 型是欧洲人源性弓形虫优势基因型 弓形虫不同基因型的虫株在基因水平的差异小 于 > 但是对小鼠的急性毒力表现却差异很大 这是由于不同基因型虫株的分子致病机制不同 引 起的小鼠免疫应答状态和疾病转归不同 有报

5 畜 牧 兽 医 学 报 卷 道显示 原型克隆谱系虫株致病性的差异与棒状体蛋白!8% 的多态性有着密切联系 )!8% 是弓形虫 型强毒株和 型弱毒株毒力差异的关键 因子?( 等证明致密颗粒蛋白也是重要的效应因子!# 能抑制!8% 产生精氨酸酶 而激活 "; 促使巨噬细胞向 极 化 导致小鼠两种不同偏向的免疫效应 另外 免疫相关 )% 酶! 也与弓形虫对小鼠致病力差异相关! 在 ;" 存在的情况下会大量表达 并聚集在纳虫空泡膜表面 使纳虫空泡膜破裂并导致弓形虫死亡 但对小鼠的保护作用只针对弱毒 株的侵袭 对强毒株无效 国际上 对基因型相关疾病或虫株特异性效应分子多态性相关疾病方面的研究已成为弓形虫病研究的前沿和热点 本试验用典型 型和 型弓形虫速殖子感染昆明小鼠 比较研究了弓形虫三种基因型虫株对昆明小鼠的致病性 结果显示 型和 型虫株两种弱毒株均可以引起昆明鼠发生特定的免疫反应 但 型致病性略高 与 型虫株对小鼠的侵袭力及其所造成的慢性感染差异显著 本试验同时还引入了弓形虫非典型虫株 株 发现 株对小鼠的致病力较 % 株强 一般来说 弓形虫非典型或自然重组的虫株对小鼠的毒力比典型的 型或 型要强 但由于基因组差异较大 很难放在一起比较 国内相关报道也比较少 本试验中所用 株为猫源非典型基因型 ) 在进化树上 株与典型虫株 型及其他非典型基因型位于不同的分支上 同源性分析显示 株 5%3!#!# 基因分别与!5 株 )((/ 虫株的相似性为 > 推测可能是由弓形虫古老克隆系 型 型 和 )((/ 之间重组演化而来 有报道显示 由两个基因型重组的虫株毒力或同母代虫株相似或高于母代虫株 这与两个母代虫株的基因比例有 关 本试验验证了 株对小鼠的毒力强于 型 % 虫株 为进一步研究基因重组弓形虫株毒力提供依据 目前诊断弓形虫病最常用的分子生物学检测方法就是聚合酶链式反应 %(! 利用的靶基因很多 例如 等 而使用频率最高且敏感性最好的靶基因是拷贝数为 长度为 的特 异性片段 本试验利用常规 %(! 方法 以 为靶序列 对弓形虫基因进行特异性扩增 %(! 结果显示 感染中期 第 天 为弓形虫在体内大量 增殖的时期 并广泛分布于内脏器官中 而此时 # 检测也发现小鼠血清弓形虫特异性抗体水平快速升高 说明感染中期 大量增殖并迁移的弓形虫引起小鼠强烈的免疫反应 导致小鼠产生典型的弓形虫病症状 甚至死亡 李亚飞等用 个 % 株包囊灌胃给不同品系的小鼠 发现昆明鼠存活率 > 检测 后小鼠脑组织包囊数为 O 适合做弓形虫耐受模型 吴升伟等给!( 小鼠腹腔注射 个 % 株包囊 只 病理切片观察到第 天小鼠脑组织有明显的神经元变性 卫星现象及噬神经现象 第 天起见神经胶质结节及较小的弓形虫包囊 第 天起珠网膜下腔见炎症细胞浸润 并利用!/03%(! 方法检测宿主脑组织中 ;" 和 )"; 细胞因子在感染第 或 天处于低表达水平 这有利于弓形虫逃避宿主 的免疫杀伤作用 上述结果均与本试验中脑组织的情况相似 据 %+ 报道 口服感染 < 株包囊 后 直接通过显微镜检即可在小 鼠脑内观察到组织包囊 此外 从第 天起 感染小鼠的抗体滴度和脑荷虫量均保持增长 但增长速度大大减慢 可能是机体在急性期耐过后 免疫系统对弓形虫强烈的抑制作用 导致弓形虫速殖子逐渐向缓殖子转变 从而与宿主形成动态平衡 李林杰等用!5 速殖子腹腔注射 大鼠 发现在第 周时血清 含量达到最高 %(! 检测结果也显示 除脑组织外 其他组织中的虫体减少至检测线以下 另外 本试验中采用的 %(! 方法经实验室验证 最低检测弓形虫的数量为 个 低于检测线时无法用肉眼观察到琼脂糖凝胶电泳的 %(! 扩增产物 因此 本试验中的阴性检测结果并非完全无弓形虫感染 有可能是虫体量在该感染时间和感染状况下未达到检测线 想要进一步精确判断组织当中有无弓形虫感染 需要用敏感性更高的检测方法进行检测 例如荧光定量 %(! 等 结 论本次弓形虫感染小鼠试验 通过观察感染小鼠临床症状和病理变化 比较了三种虫株对小鼠的致病力 发现 型比 型虫株的毒力强 非典型弓形虫 株毒力比 % 株强 通过分子生物学技术 初步了解三种基因型的弓形虫虫株在小鼠体内动态分布规律 为进一步研究弓形虫在脑内成囊过程及致病机制提供背景资料

6 期 李 等 三株弓形虫对昆明鼠致病性的比较研究 参考文献 1% 58? #%" ' 30/00/0/3, // 33+3//!% 88)5!8(<033/,#%"' /00/00 / #%%;8!%)5 #%"/ '3 3 //33, / 张艳茹 昆明鼠腹腔感染弓形虫速殖子病理学及 ( 在速殖子上分布的研究 郑州 河南农业大学 95#"!)3+, /30+? #%"'3/+-33/3/0, 3/333,(3/ / #03/0 43+ ( 付晓莹 孔阳光 梁宏德 等 昆明小鼠感染 () 型弓形虫卵囊的虫体分布及病理组织学研究 中国细胞生物学学报 ;4 7?8"#" 5 3/03 3,3/+-3/30/00?,3()3/,#%"' (%#! (# # ( 刘俊燕 杨秀珍 吴增强 等 弓形虫慢性感染鼠形成包囊的实验研究 天津医科大学学报 4#"7949'3/03++3,/3,#%"'/0+, 3#! ) '#+,%/ ( 鲁 敏 杨连第 陈昌源 等 急性弓形虫感染所致昆明鼠不孕的实验研究 中国人兽共患病学报 4 #" (5" ( 3/0//3+ /33, /3 30//,3?3/, (%#! %% ( 王 凯 冯永杰 付晓莹 等 ) 型弓形虫卵囊对昆明小鼠致病性的研究 中国人兽共患病学报 #"?;";473/0<0/ /33+,#%"' ) 3/+3? (%#!%%( (5"9 # /03+,#%"'0/3,/3,,3/,(/0%# #"(5" 54 53/03+ / 0,#%"'0/3,//0//(/0 刘婷婷 弓形虫中国分离株毒力相关的发病机制 巨噬细胞极化引起 (! 孕鼠不良妊娠结局 合肥 安徽医科大学 4 ) )<0//3 /3,( 0/3,#%"' 0/-/3, //333//0 /3 1!( 5,#/04 3+( #9"!!# 5#!)%3/0 3+, #%"'0/3//3 330/ /33 /0/3 30/0,! % 5#!)#)?44##)#4!#)4) 53/0%/+33,/3#, // #%" ' / / 333/ 8 ""? (#%/ #%"',3//30/3,3,0//3+'%0%# #%8%(8!3/0%0+ 3//+0,/3 30/ ""? (#" 8"8 )3 /0 #%" 0+,3 3 // 0/-/3/33/0,0//3 (#-%?5#")#54""%?L""##" 3/0(/30/,!3/) %/33#%"' //3 /0(## 钱伟锋 流浪猫体内弓形虫的分离 鉴定及抗弓形虫药物的筛选 北京 中国农业大学

7 畜 牧 兽 医 学 报 卷 '#" ;0/3///3-/3,/ #%"',3/+/3/,#3 ' (/ #03/0 43+( 4%)0/,//0// /!/3;(!(% )#?#)! #?!9%(9#? 3/0!3300//3,#%/ "',3(# #! 邵国青 杨莉莉 王继春 等 弓形虫 ) 序列 %(! 诊断方法的建立 中国人兽共患病学报 5#8 '#"#"(3/03/ 03,%(!//+,/,#%" ',3(%#! %% ( 58#" <!(#"!#?!(3/03,/3,/3,0 33 "# ;/3#%"/ '/3,/3/1/33/3%(! 0%# 李亚飞 王 寒 潘长旺 等 %!4 株弓形虫包囊感染小鼠模型的建立 中国人兽共患病学报 ;#" 5%#" ( 3/003/ 03,3 3 #%" (+3,%!43/(%#!/ %%( 吴升伟 胡国顺 王正蓉 等 %!4 株弓形虫感染小鼠后脑组织免疫病理的研究 中国人兽共患病学报 4 54 #"9!3/0(/0 /3,,33#%" '%!43/(%#!%% ( 4%33,3+3/, /3,#%"'+30%# 李林杰 包怀恩 弓形虫感染动物模型的建立及其特异性 抗体的研究 检验医学与临床 #8 5 3/03,//00,33#%"'///0+,, /3 '' (#( 编辑 白永平

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