第 1 期吴亮, 等. 基于 hxgprt 缺陷的弓形虫顶质体荧光突变株的构建 35 GFP) 融合用于标记顶质体, 建立检测虫体内顶质体的方法, 为后续研究提供技术保障 1 材料与方法 1.1 材料虫株弓形虫次黄嘌呤黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (hypoxanthine xant

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告豁攻芮
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1 第 22 卷第 1 期 2012 年 1 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.22 No.1 Jan.2012 基于 hxgprt 缺陷的弓形虫顶质体荧光突变株的构建吴亮, 姜旭淦, 李礼, 鞠爱萍, 沈进, 傅行礼, 陈盛霞, 周红 ( 江苏大学基础医学与医学技术学院, 江苏镇江 ) [ 摘要 ] 目的 : 构建绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein,gfp) 标记顶质体的弓形虫突变株, 建立检测顶质体的简便方法方法 : 扩增顶质体酰基载体蛋白 (acylcarierprotein,acp) 基因并构建转染载体 phx ACP GFP, 转入弓形虫 hxgprt - 株速殖子, 经霉酚酸和黄嘌呤筛选荧光突变株激光共聚焦显微镜和蛋白质印迹技术检测突变株 ACP GFP 融合蛋白的表达结果 : 通过霉酚酸和黄嘌呤筛选, 可以在 1 周内获得突变株激光共聚焦显微镜下观察到 ACP GFP 融合蛋白聚集于顶质体, 用抗 GFP 抗体能检测出 ACP 的转运肽型和成熟型蛋白结论 : 顶质体荧光突变株可清晰标记出顶质体的位置, 借助 GFP 标签即可检测融合蛋白的表达 [ 关键词 ] 弓形虫 ; 顶质体 ; 突变株 ; 绿色荧光蛋白 [ 中图分类号 ] R382.5 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2012) Constructionofapicoplastfluorescencemutantof hxgprt - deficienttoxoplasmagondi WULiang,JIANGXu gan,lili,juai ping,shenjin,fuxing li,chensheng xia,zhouhong (SchoolofMedicalScienceandLaboratoryMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013,China) [Abstract] Objective:ToconstructToxoplasmagondi(T.gondi)mutantforexpresionofgreenfluo rescentprotein(gfp)inapicoplastandestablishthesimplemethodsforapicoplastdetection.methods: Acylcarierprotein(ACP)genewasamplifiedfrom T.gondigenomicDNA andusedtoconstructthe transfectionplasmidphx ACP GFP,whichwastransfectedintoT.gonditachyzoites.Themutantwasse lectedbymycophenolicacidandxanthine.theexpresionofgfpwasdetectedbyconfocalmicroscopeand Westernbloting.Results:Themutantwasselectedbymycophenolicacidandxanthineforoneweek.The greenfluorescentaggregatedinapicoplastwasobservedbyconfocalmicroscope.thetransitpeptideandma tureacpsweredetectedusinganti GFPtagantibodybyWesternbloting.Conclusion:Apicoplastcouldbe labeledbyacp GFPfusionproteinwhichwasdetectedbyanti GFPtagantibody. [Keywords] Toxoplasmagondi;apicoplast;mutant;greenfluorescentprotein 刚地弓形虫 (Toxoplasmagondi) 是重要的人兽共患寄生虫, 全球近 1/3 人口被感染 [1] 免疫功能正常人群感染弓形虫并不会出现明显症状, 但免疫功能降低或免疫功能缺陷患者感染则可以引发严重并发症, 目前弓形虫感染已成为器官移植和 AIDS 患者重要死亡因素之一 [2] 现有的抗弓形虫药物对急性弓形虫病治疗效果较好, 但无法杀灭存在于组织内包囊状态的虫体, 治疗后复发率高, 临床急需一种新型高效药物用于弓形虫病治疗 [3] 顶质体 (apicoplast) 是顶复门寄生虫 ( 除隐孢子虫 ) 的一种类似植物叶绿体样质体, 人类及其他哺乳动物细胞中并无该质体顶质体为新型抗虫药物的研制提供了理想靶点, 已引起国内外学者的广泛关注 [4] 顶质体在普通光学显微镜下无法观察, 需借助电子显微镜等特殊设备, 给顶质体研究带来了一定困难本研究通过基因重组技术, 将弓形虫顶质体蛋白酰基载体蛋白 (acylcarierprotein, ACP) 与绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein, [ 基金项目 ] 江苏省研究生创新计划资助项目 (CX10B_282Z); 江苏大学科技创新团队项目 ( ) [ 作者简介 ] 吴亮 (1982 ), 男, 博士研究生 ; 陈盛霞 ( 通讯作者 ), 教授, 博士生导师,E mail:chensxia@ujs.edu.cn; 周红 ( 通讯作者 ), 教授, 博士生导师,E mail:hongzhou@ujs.edu.cn

2 第 1 期吴亮, 等. 基于 hxgprt 缺陷的弓形虫顶质体荧光突变株的构建 35 GFP) 融合用于标记顶质体, 建立检测虫体内顶质体的方法, 为后续研究提供技术保障 1 材料与方法 1.1 材料虫株弓形虫次黄嘌呤黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (hypoxanthine xanthineguanine phos phoribosyltransferase,hxgprt) 缺陷株 (hxgprt - ) 由瑞士日内瓦大学 DominiqueSoldati 教授惠赠细胞 HeLa 细胞为本室保存, 培养于含 10% 新生牛血清 RPMI1640 培养液, 胰酶消化传代培养于 37 5% CO 2 细胞培养箱中 [5] 菌种与质粒弓形虫转染质体 phx P30 GFP 由美国西雅图生物医学研究所 AmyDeRocher 博士惠赠 ptg19 T 载体购自上海捷瑞生物技术有限公司, 大肠埃希菌 (E.coil)DH5α 株由本室保存主要试剂和仪器 RPMI1640 培养液购自赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司, 小牛血清和胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司, 三磷酸腺苷二钠 (ATP Na 2 ) 还原型谷光苷肽购自美国 Sigma 公司胰蛋白胨和酵母提取物购自美国 Oxoid 公司霉酚酸 (mycophenolicacid,mpa) 和黄嘌呤 (xan thine,xan) 购自美国 Sigma 公司去内毒素质粒大量抽提试剂盒购自美国 Promega 公司,PCR 预混液购自北京百泰克生物技术有限公司限制性内切酶购自立陶宛 Fermentas 公司,T 4 连接酶购自宝生物 ( 大连 ) 有限公司基因组 DNA 提取试剂盒质粒小量提取试剂盒琼脂糖凝胶回收试剂盒和 DNA 标准参照物购自上海捷瑞生物技术有限公司兔抗 GFP 多克隆抗体购自北京奥博森生物技术有限公司辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG(HRP IgG) FITC 标记羊抗兔 IgG(FITC IgG) 抗荧光淬灭封片剂和硝酸纤维素膜 (NC 膜 ) 购自武汉博士德公司电转仪 (MicroPuls er) 和电转杯 ( 直径 2mm) 购自美国 Bio Rad 公司激光共聚焦显微镜为德国 Leica 公司产品 1.2 方法弓形虫的培养及基因组 DNA 提取弓形虫 hxgprt - 株速殖子培养于 HeLa 细胞中 [5], 待虫体涨破细胞后, 收集虫体, 以无菌磷酸盐缓冲液 (phos phatebufersaline,pbs) 洗涤 2 次, 按试剂盒操作方法提取虫体基因组 DNA, 保存于 -20 备用 acp 基因扩增与克隆根据 ToxoDB 基因库中弓形虫 RH 株基因组 acp 基因序列设计引物, 交由上海捷瑞生物技术有限公司合成 ACP F:5 TCATGAAGATCTATGGAGATGCATCCCCGCAACG 3 (BglI);ACP R:5 GATCGACCTAGGCTTGGCTTTCTC GATATAGCTCAGAGCGTC 3 (AvrI) 以弓形虫基因组 DNA 为模板 PCR 扩增, 条件 :94 预变性 1min, 94 30s,60 90s,72 90s, 循环 30 次,72 延伸 10min, 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收试剂盒回收 PCR 产物, 与 ptg19 T 载体 4 连接过夜连接产物转化感受态 DH5α, 涂布于含 100 μg/ml 氨苄西林 200μg/mlX Gal 和 100μg/ml IPTG 的 LB 琼脂平板 ( 含 10g/LNaCl,10g/L 胰蛋白胨,5g/L 酵母提取物和 15g/L 琼脂 ),37 培养过夜次日挑取白色菌落转入液体 LB 培养基 ( 含 10g/LNaCl,10g/L 胰蛋白胨和 5g/L 酵母提取物 ) 增菌, 提取质粒, 经 PCR 和双酶切鉴定, 阳性质粒送上海生工生物工程有限公司测序, 测序结果正确的质粒用于后续实验 phx ACP GFP 转染载体的构建质粒 ACP ptg19 T 和 phx P30 GFP 分别以 BglI 和 AvrI 酶切, 经 1% 琼脂糖凝胶电泳分离回收 ACP 插入片段和转染载体,T 4 连接酶 16 过夜连接次日将连接产物转化感受态 DH5α, 涂布于含 100μg/ml 氨苄西林的 LB 琼脂平板, 挑取单个菌落接种液体 LB 培养基增菌, 提取质粒, 经 PCR 和双酶切鉴定制备 phx ACP GFP 弓形虫突变株大量扩增含 phx ACP GFP 质粒 DH5α 菌, 以去内毒素质粒大量抽提试剂盒提取质粒, 乙醇洗涤沉淀质粒 DNA, 溶解于 20μl 灭菌双蒸水中备用取体外培养的弓 [6] 形虫速殖子, 以 Cytomix 电转缓冲液调节密度至 /ml, 吸取 300μl 速殖子悬液与 50μg 质粒 DNA 充分混匀, 转入 2mm 电转杯中 1.5kV,25μF 电击 1 次电转后室温下静置 1min, 立即接种 HeLa 细胞, 加入含 1% 胎牛血清 RPMI1640 培养液, 置于 37 5% CO 2 培养箱中继续培养,24h 后分别加入终浓度为 25μg/mlMPA 和 50μg/mlXAN, 每日于倒置显微镜下观察 2 次, 待虫体涨破细胞后转入新 HeLa 细胞中, 直至筛选出可以稳定传代的突变株速殖子, [6] 再经极限稀释法获得性状稳定的突变株激光共聚焦显微镜观察 phx ACP GFP 弓形虫突变株 HeLa 细胞中接种 phx ACP GFP 突变株 / 孔,24h 后 PBS 缓冲液洗涤 2 次以除去游离的速殖子,4% 低聚甲醛室温固定 5min, 经 DA PI 染色 10min 后, 滴加抗荧光淬灭封片剂于激光共聚焦显微镜下观察蛋白质印迹检测 phx ACP GFP 突变株 GFP

36 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷蛋白表达收集 phx ACP GFP 突变株速殖子 1 10 7 个, 于 2 SDS PAGE 上样缓冲液中煮沸 5min, 取上清进行 SDS PAGE 电泳, 湿法转移至 NC 膜 5% 脱脂奶粉中室温封闭 1h, 兔抗 GFP 抗体 (1

1 acp 基因克隆与转染质粒 phx ACP GFP 的构建和鉴定从弓形虫基因组 DNA 中扩增获得约 1400bp 产物 ( 图 1) 质粒 ACP ptg19 T 经 BamHⅠ 酶切后在约 1400bp 处出现目的条带 ( 图 2), 基因测序结果证实插入目的片段序列与预期一致转染质粒

IdentificationofACP ptg19 Tbyrestriction enzymedigestion M:DNA 标准参照物 ;P: 质粒 phx ACP GFP 图 3 质粒 phx ACP GFP 酶切鉴定 Fig3 IdentificationofpHX ACP

2 激光共聚焦显微镜观察 phx ACP GFP 突变株激光共聚焦显微镜下以 488nm 激发光可见绿色荧光聚集于顶质体, 少部分绿色荧光分布于虫体核周围, 虫体和宿主细胞核内无绿色荧光 ( 图 4) A: 顶质体绿色荧光 ;B:DAPI 染色 ;C:A 图与 B 图融合图 4 phx ACP

3 36 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷蛋白表达收集 phx ACP GFP 突变株速殖子个, 于 2 SDS PAGE 上样缓冲液中煮沸 5min, 取上清进行 SDS PAGE 电泳, 湿法转移至 NC 膜 5% 脱脂奶粉中室温封闭 1h, 兔抗 GFP 抗体 (1 100) 室温孵育 1h,HRP IgG(1 5000) 室温孵育 1h,ECL 发光试剂盒显影 2 结果 2.1 acp 基因克隆与转染质粒 phx ACP GFP 的构建和鉴定从弓形虫基因组 DNA 中扩增获得约 1400bp 产物 ( 图 1) 质粒 ACP ptg19 T 经 BamHⅠ 酶切后在约 1400bp 处出现目的条带 ( 图 2), 基因测序结果证实插入目的片段序列与预期一致转染质粒 phx ACP GFP 经 BglI 和 AvrI 双酶切, 在约 1400 bp 处出现目的条带 ( 图 3), 与预期相符, 表明转染质粒构建成功 M:DNA 标准参照物 ;P: 质粒 ACP ptg19 T 图 2 质粒 ACP ptg19 T 酶切鉴定 Fig2 IdentificationofACP ptg19 Tbyrestriction enzymedigestion M:DNA 标准参照物 ;P: 质粒 phx ACP GFP 图 3 质粒 phx ACP GFP 酶切鉴定 Fig3 IdentificationofpHX ACP GFPbyrestriction enzymedigestion M:DNA 标准参照物 ;1: 弓形虫基因组 DNA;2:HeLa 细胞基因组 DNA 图 1 PCR 扩增弓形虫 acp 基因 Fig1 AmplificationofacpgeneofT.gondibyPCR 2.2 激光共聚焦显微镜观察 phx ACP GFP 突变株激光共聚焦显微镜下以 488nm 激发光可见绿色荧光聚集于顶质体, 少部分绿色荧光分布于虫体核周围, 虫体和宿主细胞核内无绿色荧光 ( 图 4) A: 顶质体绿色荧光 ;B:DAPI 染色 ;C:A 图与 B 图融合图 4 phx ACP GFP 突变株激光共聚焦显微镜观察 (1000 ) Fig4 ObservationofpHX ACP GFPmutantbyconfocalmicroscope(1000 ) 2.3 蛋白质印迹检测 phx ACP GFP 突变株 GFP 蛋白表达抗 GFP 抗体可以识别和条带, 分别为 ACP 蛋白的转运肽型 (t ACP) 和成熟型 (m ACP), 未转染虫体未见上述条带 ( 图 5) 3 讨论顶质体是顶复门寄生虫内一种具有 4 层膜结构的细胞器, 内含一个约可自行复制的环状基因组 DNA [7] 研究表明该质体起源于被顶复门寄生虫

4 第 1 期吴亮, 等. 基于 hxgprt 缺陷的弓形虫顶质体荧光突变株的构建 37 吞噬的蓝绿藻, 在虫体内经长期内共生进化形成 [8] 虽然在长期进化过程中顶质体的绝大部分基因已转移至虫体核基因组, 但顶质体仍是虫体脂肪酸类异戊二烯和血红素合成的场所, 对虫体的存活和增殖具有重要意义, 是一个潜在的抗虫药物作用靶点 [4] 1:pHX ACP GFP 突变株 ;2:hxgprt - 缺陷株图 5 phx ACP GFP 突变株 ACP GFP 融合蛋白表达 Fig5 ExpresionofACP GFPinpHX ACP GFPmutant 顶质体研究对于新型抗虫药物的研制具有重要意义, 但由于无法在普通光学显微镜下直接观察, 同时也缺少明显的结构特征, 以至于长期以来顶质体一直被研究者误认为是高尔基体而未被发现 [9] 虽然透射电镜可以通过其重要鉴别标准 4 层膜结构辨认顶质体, 但为达到清晰分辨 4 层膜结构的效果, 对电镜标本制备要求极为苛刻, 显然无法在研究中常规使用某些荧光染料如 DAPI 虽然可以与顶质体基因组 DNA 结合并发出荧光 [10], 但其荧光强度弱, 且与细胞核荧光无差别, 实际使用中仍难以鉴别因此建立一种快速简便的检测方法已成为顶质体研究中迫切需要解决的难题之一附加表位标签技术为顶质体的检测提供了一条新途径弓形虫速殖子阶段为单倍体且可在体外连续传代培养, 是基因转染操作的理想生物材料 [11] 通过电转染法向速殖子导入转染质粒, 将所研究的蛋白与附加表位标签融合是国外研究弓形虫基因与蛋白质功能的常用技术 [12], 但国内目前仍未广泛使用弓形虫电转染后为获得纯系突变株需进行筛选, 常用的筛选标记有氯霉素乙酰转移酶 (chloram phenicolacetyltransferase,cat) 二氢叶酸还原酶胸苷酸合酶 (dihydrofolatereductase thymidylatesyn thase,dhfr TS) 和 HXGPRT, 其中 HXGPRT 是目前最理想的筛选标记 [13] 使用 HXGPRT 筛选只需 2 ~3 天即可杀死未转染的虫体, 而 CAT 则需要 10~ 15 天才能完全杀死未转染的虫体虽然 DHFR TS 也可以在 2~3 天内杀死未转染的虫体, 但所获得的突变株对现有的抗弓形虫药物高度耐药, 对研究者本身是一个潜在的危险在长期进化过程中顶质体大部分功能基因已转移至虫体核基因组中, 但由核基因组编码的顶质体蛋白 ( 如 ACP) 在翻译合成后仍转运至顶质体, 因此, ACP 等蛋白是顶质体的理想标记物本研究采用向弓形虫速殖子电击转化 phx ACP GFP 质粒的方法, 将 GFP 荧光蛋白编码基因导入虫体基因组, 使 GFP 荧光蛋白与顶质体蛋白 ACP 融合研究结果显示, 借助 GFP 荧光, 在激光共聚焦显微镜下可以清晰地观察到虫体内顶质体, 极大地方便了顶质体研究蛋白质印迹结果表明, 抗 GFP 抗体可以识别弓形虫 t ACP 和 m ACP, 这与顶质体蛋白在虫体转运过程相吻合 [14] 顶质体蛋白 N 端有一种特殊双引导序列 (bipartitetargetingsequence,bts) 结构,BTS 由一段信号肽 (signalpeptide,sp) 和转运肽 (transit peptide,tp) 组成, 顶质体蛋白先由 SP 引导进入内质网, 切除 SP 成为转运肽型, 在 TP 引导下进入顶质体, 切除 TP 变为成熟型采用蛋白质印迹技术, 能检测出转运肽型和成熟型顶质体蛋白的表达量, 以揭示该蛋白的转运情况同时, 借助抗 GFP 抗体, 可以检测融合蛋白, 而无需制备相应多克隆抗体, 节省了实验周期和费用 [ 参考文献 ] [1]TenterAM,HeckerothAR,WeisLM.Toxoplasmagon di:from animalstohumans[j].intjparasitol,2000, 30(12/13): [2]FleigeT,LimenitakisJ,Soldati FavreD.Apicoplast: keepitorleaveit[j].microbesinfect,2010,12(4): [3]WuL,ChenSX,JiangXG,etal.Toxoplasmagondi:a simplereal timepcrasaytoquantifytheproliferationof theapicoplast[j].expparasitol,2009,123(4): [4]Lim L,McFaddenGI.Theevolution,metabolism and functionsoftheapicoplast[j].philostransrsoclond BBiolSci,2010,365(1541): [5] 吴亮, 陈盛霞, 李琳婕, 等. 刚地弓形虫 RH 株速殖子在 HeLa 细胞系体外培养的实验观察 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2008,26(6): [6]RoosDS,DonaldRG,MoriseteNS,etal.Molecular toolsforgeneticdisectionoftheprotozoanparasitetoxo plasmagondi[j].methodscelbiol,1994,45:27-63 [7]DzierszinskiF,PopescuO,TourselC,etal.Theprotozo anparasitetoxoplasmagondiexpresestwofunctional plant likeglycolyticenzymes.implicationsforevolution aryoriginofapicomplexans[j].jbiolchem,1999,274 (35): ( 下转第 42 页 )

5 42 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷 [9]Lopez ValesR,ForésJ,Verdu E,etal.Acuteandde layedtransplantationofolfactoryensheathingcelspromote partialrecoveryaftercompletetransectionofthespinal cord[j].neurobioldis,2006,21(1): [10]WangYZ,MengJH,YangH,etal.Diferentiation indu cingandprotectiveefectsofadultratolfactoryensheat hingcelconditionedmediumonpc12cels[j].neurosci Let,2003,346(1/2):9-12. [11]BrasM,QueenanB,SusinSA.Programmedceldeath viamitochondria:diferentmodesofdying[j].biochem istry(mosc),2005,70(2): [12]ZamzamiN,MarchetiP,CastedoM,etal.Sequential reductionofmitochondrialtransmembranepotentialand generationofreactiveoxygenspeciesinearlyprogrammed celdeath[j].jeepmed,1995,182(2): [13]HalestrapAP,McStayGP,ClarkeSJ.Thepermeability transitionporecomplex:anotherview[j].biochimie, 2002,84(2/3): [14]TsujimotoY,ShimizuS.Roleofthemitochondrialmem branepermeabilitytransitioninceldeath[j].apoptosis, 2007,12(5): [15]BiJ,JiangB,LiuJH,etal.Protectiveefectsofcatalpol againsth 2 O 2 inducedoxidativestresinastrocytesprima rycultures[j].neuroscilet,2008,442(3): [16]DouceteRJ.Developmentofthenervefiberlayerinthe olfactorybulbofmouseembryos[j].jcompneurol, 1989,285(4): [17]LipsonAC,WidenfalkJ,LindqvistE,etal.Neurotro phicpropertiesofolfactoryensheathingglia[j].expneu rol,2003,180(2): [18]WoodhalE,WestAK,ChuahMI.Culturedolfactoryen sheathingcelsexpresnervegrowthfactor,brain derived neurotrophicfactor, gliacelline derived neurotrophic factorandtheirreceptors[j].molbrainres,2001,88 (1/2): [19]WaldmeierPC,ZimmermannK,QianT,etal.Cyclophi lindasadrugtarget[j].curmedchem,2003,10 (16): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 陈海林 ( 上接第 37 页 ) [8]K hlers,delwichecf,dennypw,etal.aplastidof probablegreenalgalorigininapicomplexanparasites[j]. Science1997,275(5305): [9]MarechalE,Cesbron DelauwMF.Theapicoplast:anew memberoftheplastid family[j]. TrendsPlantSci, 2001,6(5): [10]MatsuzakiM,KikuchiT,KitaK,etal.Largeamountsof apicoplastnucleoiddnaanditssegregationintoxoplas magondi[j].protoplasma,2001,218(3/4): [11]SibleyLD,MesinaM,NiesmanIR.StableDNAtrans formationintheobligateintracelularparasitetoxoplasma gondibycomplementationoftryptophanauxotrophy[j]. ProcNatlAcadSciUSA,1994,91(12): [12]LiX,HaoY,ChenD,etal.Expresionofthetandem enhancedyelow fluorescentmarkergeneintoxoplasma gondi[j].parasitolres,2009,105(1): [13]KimK,WeisLM.Toxoplasmagondi:themodelapicom plexan[j].intjparasitol,2004,34(3): [14]WalerRF,KeelingPJ,DonaldRG,etal.Nuclear enco dedproteinstargettotheplastidintoxoplasmagondiand Plasmodiumfalciparum[J].ProcNatlAcadSciUSA, 1998,95(21): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 郭欣

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽