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1 畜牧兽医学报 马泰勒虫新疆株 基因的原核表达及间接 2* 检测方法的建立 宋瑞其 王盼举 王振宝 瓦热斯 吐尔松 闻秀秀 张 杨 巴音查汗 新疆农业大学动物医学学院 乌鲁木齐 伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心 伊宁 摘 要 马泰勒虫裂殖子表面抗原 是用于马梨形虫病诊断的重要靶抗原之一 为建立实用有效的间接酶联免疫吸附试验方法 笔者根据马泰勒虫 基因序列设计并合成引物 将新疆株 全基因序列克隆于原核表达载体 3!<% 上 构建 3!<% 重组质粒 转化至 : 中 经 ;%! 诱导得到 融合蛋白 切胶纯化后作为包被抗原建立检测马泰勒虫抗体的 - 方法 结果显示!% 蛋白相对分子质量,0 与其理论值基本一致 通过 **-( 分析证明其具有很好的特异性和反应原性 以!% 蛋白作为包被抗原建立的 - 可明显区分马泰勒虫 驽巴贝斯虫阳性血清和健康马血清 使用建立的间接 与. 商品试剂盒分别对新疆伊犁马场收集的 份马血清样品进行检测 结果表明 基于原核表达的!% 蛋白所建立的 - 特异性 重复性好 检出率与马泰勒虫临床分离率接近 可为新疆马泰勒虫病 特别是隐性带虫马 的检测 监控提供有效手段 关键词 马泰勒虫 新疆株 间接 抗体 诊断中图分类号 文献标志码 文章编号.&.(&%+23.))%&'&'&%'9%'.%'&/ '2)-"%)'&'%.+2*+%&'& &! '0!;0!)* '%0*-0 <00! 5.)) )&&9&&(!) :&!3/,-:) *-).+%)**-)-..5*0-2.*3-*0*-/*5* -.*2-)***(3*25.5*2-*0*3-3(%)* 2)* 3-**0+*()-* (0*..-5)*3*.2.* 0*.*25**2*&3-23-*-+*5*)*/*%)* 5**2<5- +.(*)* +*-*)*3-,-.*.- 3!<%%)*-*.3( 3!<%+*-*-2-* &:)*!%3-* +*0.2;%!%)*20 3-*+30-2**-.5)*.(0*+)5*((.*)*30-2*3-*+ 0*.*5*2-)**()*2-*. *)**.)* *&%)*-*0(.*))**3-**)33-*(*.0(- 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金 新疆联合基金重点项目 作者简介 宋瑞其 男 河南人 硕士生 主要从事预防兽医学研究 (. 通信作者 巴音查汗 女 蒙古族 教授 博士 博士生导师 主要从事预防兽医学研究 (.))(.

2 畜 牧 兽 医 学 报 卷 2,:+).)+(-5*(.*+))*-*.((0**3-*23-*+ *2* **-(+).).2-*))*3-*))5)(3*.2.-*. 5*.)*30-2*-*.!%3-*+**2-)***. 2**)-*)*-*..0(.(*-(2*-**)** &.0(*-*((*05.5*2--*.*)3-*)* *2*2*.***.5-52-**3*.(-*.**2*.<5 /(&.)*&5**2<5--*.5 马梨形虫病 *0*3-3(; 是由马泰勒虫 *& 和 或驽巴贝斯虫 -& 引起的蜱传血液原虫病 该病主要感染马属动物 马 骡 驴和斑马 呈急性 亚急性或慢性发病等 患病时动物通常呈发烧 贫血 黄疸 肝 脾肿大 血管内溶血 可视黏膜黄染及血红 蛋白尿等表征 但慢性感染时临床症状不明显 患病马匹即使后期治愈后也会终身带虫 作为传染源传播给其他马属动物 该病广泛分布在热带和亚 热带地区 据联合国粮食和农业组织的数据显示 年世界范围内马匹存栏量约 亿匹 的马属动物分布在马梨形虫病流行 地区 近年来 多个国家有马梨形虫病的报道 如韩国 蒙古 委内瑞拉 突尼斯 苏丹 意大利 匈牙 利 沙特阿拉伯 墨西哥及美国德克萨斯等 对马产业造成重大经济损失 在国际马术竞技比赛中马 梨形虫病作为重要的检测项目之一 为保持健康良好的国际性马产业市场 对马梨形虫病的防控至关重要 补体结合试验 "9% 是常用于检测马泰勒虫病 的方法 然而因其低灵敏度和检测速率等因素对 检测造成一定的限制 间接荧光抗体试验 9 % 也可用于诊断马泰勒虫感染 但通常受到抗体的检测范围和交叉反应性的影响 除 "9% 和 9% 之外 基于马泰勒虫裂殖子抗原的 已被用 于抗体检测 近几年 通过重组抗原建立的几种 检测方法 已证明其诊断慢性马泰勒虫病感 染是非常有效的 新疆作为马泰勒虫病的流行疫区 制约着新疆马产 业的健康发展 笔者拟构建马泰勒虫新疆株 基因原核表达载体及其间接 方法 为马泰勒虫病的血清学诊断及地方疫区马梨形虫病的检测 监控及综合防控提供技术支撑 材料与方法 0 材料 马泰勒虫新疆流行虫株 %* 伊犁分离株 3!<% 表达载体及马泰勒虫标准阳性 阴性血清均由新疆农业大学动医学院寄生虫实验室提供 待检血清样品采自于新疆伊犁地区的放牧马 组织 全血 : 提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自德国! 公司 胶回收试剂盒购自美国 &! 公司 限制性内切酶 - '% 连接酶和 3:% 载体购自宝生物工程 大连 有限公司 大肠杆菌 : 感受态细胞为北京全式金生物技术有限公司产品 '; 标记的兔抗马 5!: 显色试剂盒和四甲基联苯胺 % 购自上海生工生物有限公司 马泰勒虫. 检测试剂盒购自美国 '=: 公司 其他常规试剂均为国产分析纯 所用水为超纯水 0 引物设计与合成 基于马泰勒虫虫株!*, 登录号 9 全基因序列设计的 ;"' 引物 ; "!!%""%!%%%""%" "% 和 ;%%!"!!""!"%%!% %!!%!!% 加下划线的序列分别对应 - 和 ' 酶切位点 基因片段大小为 3 引物由上海生工公司合成

3 期 宋瑞其等 马泰勒虫新疆株 基因的原核表达及间接 检测方法的建立 0- 基因的扩增使用 : 提取试剂盒提取马泰勒虫新疆株 %* 的基因组 : 通过 ;"' 技术对 全长基因 3 进行扩增 个循环 扩增的 ;"' 的琼脂糖凝胶电泳加以确证 并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收 0 表达载体的构建与鉴定将回收产物连接到 3:% 载体中 并转化至大肠杆菌 : 感受态细胞 挑取单菌落接种至含 5 D 氨苄青霉素的 液体培养基 收集菌液进行测序 对重组质粒和 3!<% 载体双酶切 - 和 ' 回收目的片段和空载体 用 %:(5* 于 过夜连接 转化至大肠杆菌 : 感受态细胞 测序和酶切验证正确的重组质粒 3!<% 转化至大肠杆菌菌株 : 0 重组 2* 蛋白的诱导条件筛选及鉴定在含 5 D 氨苄青霉素的 培养基 中小规模诱导 测定重组蛋白质的表达情况 于 - D 下进行诱导时间 和 ) 和诱导剂 ;%! 浓度 和 ( D 的最佳条件筛选 的十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 : ;! 分析蛋白质表达情况 0 重组蛋白质的纯化及其反应原性测定 蛋白质的纯化 根据高慎阳等的 "( 染色切胶纯化法稍作改进 收集最佳诱导条件下菌体 样品处理后进行 :;! 电泳 用适量的 ( D 的 "( 溶液染色后 切下目的条带碾碎加入 ; 涡旋混匀 置于 D 反复冻溶 次后 - D 离心 取上清 用紫外分光光度仪测定上清中蛋白质浓度 置于 D 保存备用 **-( 取 重组蛋白质样品 5 的蛋白质含量 进行 :;! 电泳后 半干转印于 " 膜上 脱脂奶 %+** 的 ; 稀释 封闭 ) 加马泰勒虫阳性血清 反应 ) 加二抗 '; 兔抗马 5! 温育 ) 最后 向膜上滴加 : 显色液 避光 孵育 观察结果 0 重组 2* 为包被抗原建立间接 2* 抗原包被浓度和血清稀释倍数的选择 采用九宫格的方法 包被质量浓度分别为 和 5 D 血清稀释倍数分别为 KK KK; 值最大的一组为最佳蛋白质浓度和血清稀释倍数 最佳酶标二抗稀释倍数的选择 以确定的包被浓度和血清稀释倍数为基础 按 KK KKKK 稀释二抗 ; 值最大的一组为二抗最佳稀释倍数 最佳包被液的选择 分别以碳酸盐缓冲液 ( D 3" 磷酸盐缓冲液 ( D 3;%-"( 缓冲液 ( D 3 & ( D 3 生理盐水 ( D 3 和双蒸水 & 作为包被液 按照优化好的最佳抗原包被浓度进行包被 每孔 过夜包被 按照优化好的最佳血清稀释浓度进行检测 以 ; 值最大为判定标准 即为最佳包被液 最佳封闭液的选择 作为封闭液 每孔 封闭 ) 按照上述优化好的条件进行检测 以 ; 值最大的一组作为最佳封闭液 血清稀释液的选择 分别以 ; 脱脂奶 %+** 的 % 作为一抗稀释液 选定最大 ; 值一组作为最佳稀释液 血清反应时间的选择 加入稀释的一抗后 分别在 孵育 ) 进行 检测 选定 ; 值最大时为最佳反应时间 酶标抗体反应时间的选择 加入稀释的酶标二抗后 分别在 孵育 ) 进行 检测 ; 值最大时选为最佳反应时间 % 底物反应时间的选择 避光环境下 加入 % 底物溶液后分别于 培养箱反应 加入 ( D & 终止反应 ; 值最大时选为最佳反应时间 判定标准的确定 用上述优化好的 检测方法 对实验室保存的 份马泰勒虫病阴性血清进行检测 每份血清做 个重复检测 取 份检测孔的平均值 计算检测样品 &: 的!3 根据统计学 当样品的 &: 值大于阴性样

4 畜 牧 兽 医 学 报 卷 品 &: 值的!3 时 即可判定样品为阳性 否则为阴性 敏感性试验 将马泰勒虫标准阳性血清按照 KKK 倍比稀释 其余条件同 特异性试验 用 方法同时检测马泰勒虫病 驽巴贝斯虫病阳性血清和健康马血清 判断 与其他马病的病原有无交叉反应 批内批间重复性试验 用同一批次和不同批次纯化的蛋白质包被 分别检测 份阳性血清和份阴性血清 重复试验 次 分别计算每个样品的平均值 标准方差和变异系数 确定 同批和不同蛋白质抗原的变异系数范围 符合性试验 对采集的 份马血清 分别用建立的间接 和. 检测试剂盒检测 结果以商品试剂盒的结果为标准 计算二者的符合率 对结果不一致的样品 以试剂盒的结果为准 结 果 符合率 02* 重组蛋白质表达质粒的构建 将新疆株 全基因序列克隆于原核表达载体 3!<% 构建 3!<% 重组质粒 并酶切鉴定 图 : : 相对分子质量标准 3!<% 重组质粒 3!<% 空载体 双酶切产物 酶切后片段 :: -,*-'*.3( 3!<%'*-.*5**-*.3( %)*5**5** 图 2* 重组表达质粒的酶切鉴定 5% 0'%%+%&'&'(%)%&'&2*.+&-%''")%) 02* 蛋白表达条件优化 测序和酶切验证正确的重组质粒 3!<% 转化至大肠杆菌菌株 : 进行蛋白质表达 最佳诱导条件 加入终浓度 ( D ;%! 在 - D 条件下诱导 ) 获得最佳表达 的 :;! 分析蛋白质表达情况 见图 蛋白质相对分子质量标准 诱导时间 );%! 诱导浓度 ( D ;-*-,*- 0.*+ )-*3*.-*(0...*-2;%! + ( D -*3*.-*( 图 诱导时间及 浓度对 2* 蛋白表达的影响 5% 02+&%'!+%&'%'+&'+'.%&'&'2*.&%'3.)%&' 0 蛋白质的纯化及其反应原性分析 纯化后重组蛋白质 :;! 鉴定 紫外分光光度仪测定纯化后蛋白质质量浓度在 5 D 取 处理后样品进行 : ;! 电泳验证 见图 **-( 结果表明重组蛋白质能 够与马泰勒虫阳性血清反应 具有很好的特异性和反应原性 图 02* 最佳反应条件的确定通过对抗原包被浓度 血清 酶标二抗稀释倍数 最佳反应时间的确定 以及包被液 封闭液 稀释液的选择 确定如下操作程序 酶标板每孔加入

5 !/ 期 宋瑞其等马泰勒虫新疆株 J=!! % 基因的原核表达及间接 >\V :; 检测方法的建立 Z'预染蛋白质相对分子质量标准( %' 0'纯化 后 不 同 浓 度 的 3:!>Z;% 蛋白 Z'Y, -"Q - D ( %!0'X -! - QH - 3:!>Z;%Q 图 I! 纯化的重组蛋白质的 << L=* 验证结果 S I!.> << L=*595 :N3 : 5 9 : -L 959 N 9 %&&,\),S+\h% 蛋 白 质! ) i 包 被 过 夜(% 每 孔 加入 0&&,\ Y<: 溶 液 洗 涤 2 次(& 加 入 %2&,\ &' &2d 脱脂奶 * i 封 闭 %!洗 涤 同 上( 每 孔 按 %u)&& 加 入 血 清 与 2d 脱 脂 奶! * i 反 应 *& -! 洗涤同上( 每孔按 %u%&&&& 加入 J9Y 标记兔抗 马V * i 反应 *& -!洗 涤同上( S3 与 2d 脱脂奶! * i 反 应 %2 各 孔 加 入 %&&,\ Z< 底 物 溶 液! h% -(9 每 孔 加 入 J0:) (: 在 )2&- 处测定各孔的 X 值& %)% Z'预染 蛋 白 质 相 对 分 子 质 量 标 准( %'纯 化 后 的 3:! >Z;% 蛋白( 0'阴性对照 Z'Y, -"Q - D ( %'YH - 3:! >Z;%Q -( 0'5S 图 %! 纯化的重组蛋白质的 Z 9 验证结果 S %!.> Z :N3 : 5 9 : -L 959 N 9!H (! 阴阳性临界值的确定 用上述优化好的 >\V:; 检测方法!对实验室 保 存的马泰勒阴性血清取 *. 份进行检测!每份血清做 * 个重复检测!取 * 份检测 孔的 平 均 值!计 算 检 测 样 品 X)2&- 的平均值和 标 准 方 差!根 据 统 计 学!当 样 h 品的 X)2&- 值 大 于 阴 性 样 品 X)2&- 值 的 Q c0 0 时!即可 判 定 样 品 为 阳 性& 临 界 值 为 &' *2*!大 于 &' *2*为阳性(小于 &' *2* 为阴性&见图 2& 图 (! 以 JL 蛋白为包被抗原的 I) 份马泰勒虫阴性血清 KT < 检测结果 S (!.> ; 9 :I)9 5 M 3- : LKT < 2H 2!H )!KT < 方法评测情况 0'.' %! 敏感性试验!! 将 马 泰 勒 虫 标 准 阳 性 血 清 0'.' 0! 特异性试验!! 用 >\V:; 方法检测的马 驽 巴贝斯虫病阳性血清和健 康马 血清! X)2&- 值 均 在 按照 %u%&&' %u0&&55%u%0(&& 倍比稀释!其余 条件同 >\V:;& 最 终 确 定 当 阳 性 血 清 稀 释 至 %u &' 0 以内!判断 >\V:; 与其他 马 病 的 病 原 有 无 交 叉 反应& %.&&时其结果仍为阳性& 0'.' *! 重复性试验!! 对采集的 %& 份马泰勒虫阳

6 畜 牧 兽 医 学 报 卷 性血清和份阴性血清 分别进行 次重复检测试验 其中同一批 蛋白抗原包被板批内变异系数在 不同批次 蛋白抗原包被板批间变异系数在 结果表明 蛋白的稳定性较好 具可重复性 符合性试验 对采集的 份马血清 分别使用建立的 和. 试剂盒进行检测 讨 论本试验首次对新疆马泰勒虫地方流行虫株 伊犁分离株 基因进行克隆 并成功构建了重组质粒 3!<% 经优化诱导时间和 ;%! 浓度后 以包涵体的形式高效表达 虽用尿素溶液变性纯化 但洗涤后蛋白质浓度低 杂蛋白质较多 故后期使用 "( 染色切 :;! 胶进行蛋白质回收 提高目的蛋白质的纯度和回收率 经 **-( 鉴定 重组!% 蛋白能够被马泰勒虫阳性血清特异性识别 说明 抗原能与抗体特异性结合 检测马泰勒虫抗体与其他血清学诊断 方法 "9%9% 相比 方法速度快 对实验条件要求不高 更适用于基层实验室血清学 诊断及大规模疫病普查 本研究所建立的间接 具有很好的特异性 敏感性和重复性 与. 商品试剂盒相比 与其他学者建立的间接 检测符合率的结果相符 结 论基于马泰勒虫重组 蛋白建立的间接 方法可以用于检测抗马泰勒虫血清抗体效价 虽然不能代表机体的中和抗体效价 但其检测速度快 对实验条件要求不高 安全便捷 在短时间内可以检测大量样品 非常适于基层大批临床马血清样品的检测 为患马泰勒虫病的马匹体内 5! 抗体水平监测与检测试剂盒的开发奠定了基础 参考文献.'+) &' " '** *-*& *)( )-.)*0&. ;;' %!' ' :& : '*("3-*5*.( 3)(5**.32*&-)% :'!%0*3-3(; / :'! %0*3-3()*.( /* '! ;;; ;;&%% *(.((* 5 -& - )*-33(. *-5 0&!'"M&"!''&% ':*(*-3-*(*.*-,2. -.* +) -& *& 2*.*0!!&!'*(3* (5.(*52*0*3-3(") */*(,*0-* ;;' ' * ('**+2*0*3-3(/ &&' ';!%' *(!* *.*-23-3( ;(/*- &"3*0/*- 0) 2-. 0& :" :'&! " *(;-0.2-*.3-* 33(.2-)*52*&0 5*/*0)-*2-;0 (*-/(.(-0& 9''" &'&& && 0*3-3(.3(**2*- 2)-*2*.*+)-&.!:;':''%*(;-3( **.-*(2)*-,2.- )*-3(.)*.-(2 %)*(*- *)-*0&. :" :":& '&%%& ;:

7 期 宋瑞其等 马泰勒虫新疆株 基因的原核表达及间接 检测方法的建立 %*(*/*(,*0-* 2-)***.25!*5- )-*).& 99' &:'9:: 9 *(.3-*02*-(5.(* ;"'2-)*52*0*3-3( 0&. 巴音查汗 马梨形虫在新疆地区的感染现状及其防治 " 中国 北京 国际马科技大会学术论文集 北京 中国畜牧兽医学会 " %)*2*.0.-(2* 0*3-3(2- <5-*"*5 ")**.2(.*.*=**-- *.*"= ")** 高慎阳 查恩辉 王 糰 等 一种 高性价比 切胶纯化原核表达蛋白的方法 中国农学通报!&! *(.*2 2*.**) ,-.*3-* 3-*5*((.*)&& -&")** ''!&*(:5.33(. 2-*. *0* *-/* 0-2.*5**(2-**.2*& 3*.2.*,. '& ' '!'= "& *(:**. 2*& - &2*.=**/0*()-*05.3* *) ;"'0& =!&':' ;: *(3-*")**-(5 **&* 0,.3*.(0(/"*0(5. ).& 曹增国 王化磊 盖微微 等 埃博拉病毒抗体间接 检测方法的建立及应用 畜牧兽医学报 "&!!! *(:**(3 *2-*.2-**.5(-0 33(. ") ** 沈 婷 周 斌 陈溥言 检测猪乙型脑炎病毒抗体间接 方法的建立与应用 畜牧与兽医 %& " ; :**(3* 33(.2-*. *)2-**. 23-.*3***.*3)(-0 &!! ")** 宫苗苗 曾 妮 程朝飞 等 狂犬病病毒基质蛋白的原核表达及其间接 方法的建立 中国人兽共患病学报!&!! "!"9*(:**( 3*2-*.2-**.2* 5-*-0*3-,-.*3-* 2-3-*)& ")** 夏平安 尹彦涛 李素平 等 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组 蛋白的高效表达及间接 方法的建立 中国兽医学报 <; %;*(5)(**(* 3-*2 3-*2;''= - *()*25*)*-*. 203-*)&! ")** 编辑 白永平

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