6 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 年 月第 卷第 期 ## ' ' (( ) * '$ +, #-./ 0-1($( 猪囊尾蚴病是重要的人兽共患寄生虫病 该病呈 世界性分布 广泛流行于非洲 拉丁美洲等地区 不仅对畜牧业造成较大经济损失 还严重危害人类健康 世界卫生组织将其列为 + 种易被忽视的热带 病

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1 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 年 月第 卷第 期 1 文章编号 论著!" #$ &'! 4 4 : 目的分析鉴定猪带绦虫 胰岛素受体 的结构特征 并对其配体结合结构域! 进行表达 方法参考! 数据库猪带绦虫基因组注释信息 设计特异性引物 克隆获得 基因 用 "()' 和 "() 分别对其核苷酸和氨基酸序列进行同源性比对 并用在线软件对该蛋白的信号肽和结构域进行预测分析 将其! 克隆至原核表达载体 #*)+, 表达 纯化后进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (!("* 分析 用猪囊尾蚴阳性血清和! 免疫兔血清进行蛋白质印迹 -. / 鉴定 结果 的开放阅读框为 0 1.# 编码 个氨基酸 与多房棘球绦虫 的同源性为 具有典型的酪氨酸激酶家族的结构特征和 & 型三级结构 (!("* 结果显示 所表达的重组蛋白相对分子质量 为 与预期一致 -. / 检测结果显示 重组蛋白可与猪囊尾蚴阳性血清及! 免疫兔血清发生特异性反应 在 处出现特异条带 结论克隆并鉴定了猪带绦虫 基因 其! 的表达产物可被猪囊尾蚴阳性血清所识别 具有良好的反应原性 中图分类号 文献标识码 "!"#"$ & ' -* / 2 "3/ 4 56"' (7 7/ / 2 97/ 4 :!! " #!! $& '!! " #!!! "!& ( #!! )!&( * +(,&- ",!&! && ( #(()$ +( *. + +! "!! - +! " */!, *"& 0-1 ( **+((, +( -. /.01 ) ;; 7;7 7 ;# 8# /./!$ / ;;/ /; 4 / #. ) 7; ; <7; / 7/ "()' "()4 #7= / ## 7;7 #; )! / ; #*)+, =; 8# ) 8# # #74 #. (!("* -. / 7/ ;;;7 ; 7 #= 7!7.. 7 ) # / 0 1.#4 ; # ; ; #; ;= > 4 /7! 4 &# 7;7 " 8#;4 (!("* 8# # / ;. # #;; ; ;;;7 ; 7 #= 7! / #;; ) / 7;;7 ; ) 8# #! ;. ;/. ;;;7 ; 7 #= 74 ; 7// / /; # 2!"" 基金项目 国家自然科学基金 ' 作者单位 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 甘肃省动物寄生虫病重点实验室 兰州 ++ 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 扬州 0++1 : 通讯作者 * 787/?;;

2 6 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 年 月第 卷第 期 ## ' ' (( ) * '$ +, #-./ 0-1($( 猪囊尾蚴病是重要的人兽共患寄生虫病 该病呈 世界性分布 广泛流行于非洲 拉丁美洲等地区 不仅对畜牧业造成较大经济损失 还严重危害人类健康 世界卫生组织将其列为 + 种易被忽视的热带 病之一 年流行病学调查显示 美国 墨西哥边境猪带绦虫 的感染率为 在美国加尼福利亚部分地区 猪囊尾蚴病的血清阳 性率为 $ 有重新抬头的趋势 我国每年因猪 囊尾蚴感染造成的经济损失达 $ 亿美元 保守估计全球每年因脑囊尾蚴感染而死亡的人数在 万 + 以上 该病已成为发达国家和发展中国家不可忽视的问题 胰岛素 胰岛素受体 (# 2 信 号通路进化非常保守 在寄生虫等多种生物的生长发育和代谢调控中起重要作用 2 为受体酪氨酸激酶 (# 超家族第 6 家族的成员 具有保守的结构组成 含有 亚基 其细胞外结构域为配体结合位点 单次跨膜的疏水 亚基和具有 245 活性的细胞内结构域 7-8 等的分析表明 从非洲有爪蟾蜍 到哺乳动物的进化过程中 2 序列高度保守 研究表明 寄生蠕虫不仅存在胰岛素 样 3 ## 9 基因 同时还存在与哺乳动物同源性很高的 2 及其下游分子 并且能利 用宿主胰岛素调节自身代谢和生长发育 王帅等 发现并鉴定了猪带绦虫 个 9 基因 5 等 和 等先后发现并鉴定了多房棘球蚴 的 2 5 等鉴定了曼氏血吸虫! 的两个功能差异的 2 酵母双杂交试验也证实 血吸虫和棘球绦虫的 2 可与人胰岛素发生相互作用 从而调节虫 体的葡萄糖代谢 : 等研究表明 日本血吸虫 "# $ 也存在两种不同的 2 "$2 和 "$2 " 等证明 血吸虫能利用宿主 人 胰岛素调节葡萄糖吸收 而且用重组胰岛素蛋白免疫小鼠能有效降低血吸虫的产卵率 这一研究结果有望将 "2 和 "2 作为疫苗的候选分子 用于血吸虫病的防控 同时也可将酪氨酸激酶作为特异性抑制剂的治疗药靶 目前 尚无关于猪带绦虫 2 的研究和报道 因此 本研究克隆并鉴定了猪带绦虫 2 基因 2 并对其配体结合结构域 - - / 9;! 进行了表达分析 为进一步研究其生物学功能和作用机制 开展基于猪带绦虫 2 蛋白的重组抗原疫苗和生物药物奠定基础 材料与方法 $ 虫株 实验动物猪带绦虫成虫节片由本实验室保存 家兔购于兰州生物制品研究所 $ 主要试剂大肠埃希菌 感受态细胞! ;9 购于北京全式金生物技术有限公司 2'" 抽提试剂 4 购自美国 - 公司!'" 聚合酶 #7!4 克隆载体 4!'" 连接酶 242 试剂等均购自宝生物工程 大连 有限公司 限制性内切酶 & 均购自美国 '.; 公司 &!) 膜购自美国 7 # 公司 兔抗猪辣根过氧化物酶标记 - 2- 山羊抗兔 2- 均购自美国 -/ 公司 原核表达载体 #.4 8 由本实验室保存 猪囊尾蚴阳性 阴性血清均为本实验室收集保存 $ 猪带绦虫 2 的克隆根据已经完成的猪带绦虫全基因组数据 设计两对特异性引物 对 2 的开放阅读框进行分段扩增 ) "4""""44444" 2 "44 44""44"444 ) ""444"" 444"4 2 4"4"4"4" 4"" 引物由苏州金唯智股份有限公司合成 参照 4 试剂的说明书提取猪带绦虫成虫的总 2'" 按逆转录试剂盒说明合成 (!'" 第一链 然后用 )2 和 )2 引物分别进行 2 扩增 扩增条件为 6 / 6 / / + 68 / 共 个循环 + 8 / 2 产物连接至 #7!4 克隆载体 转化大肠埃希菌感受态细胞! 2 鉴定阳性的克隆送生工生物工程 上海 股份有限公司测序 测序正确的重组质粒分别命名为 #7!2 和 #7!2 $ 2 的序列分析与鉴定将 #7!2 和 #7!2 的测序结果用 </ 软件进行拼接 去除重复序列 获得 2 完整的开放阅读框 ;9"4' 和 ;9"4 分别检索 分析 2 与其他生物 2 的核苷酸及氨基酸序列

3 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 年 月第 卷第 期 的同源性 用 和 "( 对氨基酸序列及其结构域进行分析预测 用在线软件 )*+!,- 预测其! 结构 用 ' $. 预测 * 可能存在的磷酸化位点 用 /-"( 检索 * 的同源氨基酸序列 0 $1 软件进行序列比对 计算遗传距离 以秀丽隐杆线虫 为外群 用 #$ 程序中的最大似然法 绘制系统进化树 $ * -/! 的表达 $ 引物的设计针对 * 的 -/! 设计引物 截去其信号肽序列 同时引入 2 酶切位点 下划线部分为酶切位点 3 44"("(4(4(" ((4((44(4(44(4 (4"4(" "4"4((4"44"4"""""( $$ 表达载体的构建以质粒 #!5* 为模板 用 36 引物进行 扩增获得 -/! 序列 回收的目的片段与表达载体 #,(1 7 分别进行 和 2 双酶切 连接后转化 /- 感受态细胞 经 及双酶切鉴定 阳性克隆送生工生物工程 上海 股份有限公司测序 将鉴定正确的阳性克隆命名为 #,(*-/! *-/! 的表达纯化取携带 #,(* -/! 质粒的重组菌液 11 接种于含有卡那霉素的 8( 培养基中 9. : 振荡培养至吸光度! 11 值 ;115 时 加入终浓度为 1 :- 的异丙基 " 硫代半乳糖苷 *(4 1 1 : 振荡培养 收集菌体 经反复冻融和超声波处理 分别收集上清和沉淀样品进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳!"4, 分析 按照蛋白质纯化试剂盒说明纯化目的蛋白 免疫兔血清的制备和蛋白质印迹 ) 0 分析用纯化后的 -/! 蛋白免疫家兔 每 周免疫 次 共免疫 次 首次免疫用福氏完全佐剂 抗原剂量为 1 0 第 次及第 次均采用福氏不完全佐剂 抗原剂量为 11 0 蛋白与佐剂 混合 乳化后皮下多点注射家兔 第 次抗原 11 0 直接进行耳缘静脉免疫 后颈动脉采血 分离血清 将纯化后的 *-/! 样品进行!"4, 电泳 转移至聚偏二氟乙烯 &!3 膜上 /( 洗 次 于 脱脂奶粉中 封闭过夜 分别加入 11 稀释的猪囊尾蚴阳性血清 猪囊尾蚴阴性血清和 *-/! 免疫兔血清 室温下振荡孵育 分别加入 的兔抗猪 2*04 和羊抗兔 2*04 室温下振荡孵育 加入!"/ 底物溶液 避光显色 结果 猪带绦虫 * 的鉴定 * 的克隆 * 的两段序列分别为 15 # 和 # 拼接后的开放阅读框全长为 # 编码 9 个氨基酸 与预期大小相符 图!'" 标志物!'" * 片段 30 = * * 片段 30 = * 图 猪带绦虫 片段的 扩增!"# " $#!& * 序列分析及系统进化 /-"( 分析显示 * 与人以及血吸虫的氨基酸序列同源性很低 约为 与多房棘球绦虫 #* 的氨基酸序列同源性为 5 * 具有典型的胰岛素结构特征 即 个 螺旋和 个 折叠 结构 螺旋为胞外区 包括 ' 端信号肽 由 91 位氨基酸 的 - 区和半胱氨酸富集区 组成的 -/! 和 端的 个纤连蛋白 型结构域 3' 为 1 3' 为 95 折叠包括跨膜区 ( 15 1 和酪氨酸激酶结构域 ( 5 5 为潜在的蛋白裂解位点 在 存在 * 底物 * 结合的 '8 序列 图 以氨基酸序列构建的 * 家族成员的系统进化树显示 绦虫和吸虫的两条 * 可以明显的聚为两类 * 和 * 而 * 与棘球绦虫的 * 聚在一起 说明它们间亲缘关系较近 图 以上分析均表明 * 为猪带绦虫的 * 基因 # * 蛋白二级结构分析及! 结构预测 预测结果显示 * 二级结构中 螺旋 2 占 折叠, 占 1 无规则卷曲 - 占 9 * 序列中有多个磷酸化位点 包括 个 个 ( 和 个 ( 对 < : (,/- 数据库进行模板 11

4 ! D$! 中国寄生虫学与寄生虫病杂志!"#$ 年 月第 & 卷第! 期 '()* +,-.-/)012,-.-/)0 3)/ 45.6!"7$! 8126 &! 916! 选 择 )7CU#F *! 以 序 列 同 源 性 为 &!V?FW 的 人 :; 晶 体 结 构 """7 ""?7 为 模 板 进 行 的 同 源 建 模 显 示! 2*:;!7&7$ 的 整 体 空 H7 "7"7 间 结 构 呈 + 8, 型 排 列! 而 BK 区 具 有 :; 保 守 的 空 间 "7?7 "!"7 构 型 图 $( '; "!?7 # "&"7 "&?7!V! 重 组 表 达 载 体 的 构 建 与 鉴 定 重 组 质 粒 5<B! 2*:; 经 5+X$ 和 67)$ 双 酶 切! 获 得 约 $ GGG N5 载 ""7 体 条 带 和 7 $7 N5 的 目 的 条 带 图? $! 说 明 2*:;! "?7 H>3 基 因 成 功 克 隆 到 了 表 达 质 粒 上 ( "?"7!V& I9!!7 "??7 重组蛋白的表达及鉴定 E3E!,4A< 分 析 显 示! 所 表 达 蛋 白 约 为 8.?D GGG! 与 预 期 一 致 ( "$"7 "$?7 YP/0P.* N2100)*L 分 析 结 果 显 示! 所 表 达 的 蛋 白 分 别 "C"7 与 猪 囊 尾 蚴 阳 性 血 清 和 2*:;! H>3 免 疫 兔 血 清 在 "C?7 8.?D GGG 处 发 生 特 异 性 反 应! 而 猪 囊 尾 蚴 阴 性 血 清 I9!!! "F"7 在 此 位 置 无 相 应 条 带 图 $ $( "F?7 "D"7! "D?7 7""7 BJ 7"?7 讨 论 胰岛素Z 胰岛素受体信 号 通 路 是 一 条 非 常 古 老 的 " 77"7 信号传导途径! 在控制细胞生长及代谢调控中 发 挥 77?7 重要作用! 并且可以影响细胞与外界环境的相互作 7!"7 用 ( 氨 基 酸 同 源 序 列 比 对 发 现! 2*:;!7&7$ 与 多 房 7!?7 BK 7&"7 棘 球 蚴 的!+:;!7 更 为 相 似 ( 血 吸 虫 和 多 房 棘 球 绦 7&?7 虫 均 具 有 两 个 :;! 并 且 同 一 物 种 的 两 个 :; 基 因 差 异 7"7 7?7 明 显 ( 多房棘球蚴 的!+:;!7 与日本血吸虫的 /0:;!7-7?"7 曼 氏 血 吸 虫 /+:;!! 与 /0:;!! 更 为 相 似 ( 2*:;!7&7$ 与 7??7!+:;!7 在 系 统 进 化 树 上 亲 缘 关 系 较 近! 推 测 2*:;! 7$"7 7$"? 7C"7 H7 & 配 体 结 合 环 7 H)L-*M N)*M)*L ' '; & 半 胱 氨 酸 富 集 区 'O/0P)*PQ.)R(.PL)1* ' I9! & 纤 连 蛋 白 ::: 型 结 构 域 I)N.1*PR0)* 0O5P! M1S-)* ' BJ & 跨 膜 结 构 域 B.-*/SPSN.-*P M1S-)* ' BK & 酪 氨 酸 激 酶 结 构 区 BO.1/)*P T)*-/P (!":;!<!<= 的 氨 基 酸 序 列 分 析 >-40*)#) 18 +'( 4,#-1 4.#5 )(67(-.() 812!":;!<!<= DD 前 期 研 究 已 证 实 猪 带 绦 虫 存 在 两 条 :H, 7"" 细粒棘球绦虫!" #$&'()*'* :; "<=>$!?@& # 多房棘球绦虫!" +'(,-().'($-* :;!! "'3A7?&!$ $ 日本血吸虫 /" 01)&-.'+ :;!7 4'B!"C7 $ 曼氏血吸虫 /" +&*)&- :;!7 "449&D7!" $ 7"" 多房棘球绦虫!" +'(,-().'($-* :;!7 "'3E7D&F $ 猪带绦虫 2" *)(-'+ 7&7$ 日本血吸虫 /" 01)&-.'+ :;!! "4'B!GC7? $ D$ 7"" 曼氏血吸虫 /" +&*)&- :;!! "448$?C? $ 3" 4(4#&* :; "44'CC7? $ 7 "#$!! 同时获 推 测 这 两 条 受 体 分 别 结 合 两 条 :H,! 进 而 发 挥 不 同 7"" 7"" ) 77 * 得 了 猪 带 绦 虫 的 两 条 :;! 即 2*:;!7&7$ 和 2*:;!F7G! 图9 "#$ 9 7&7$ 可 能 与!+:;!7 具 有 相 似 的 功 能 ( 线 性 动 物 门 和 节 肢 动 物 门 只 存 在 一 条 :;! 却 存 在 多 条 :H, ' 而 绦 虫 和 吸 虫 均 存 在 两 条 :H,! 推 测 绦 虫 和 吸 虫 祖 先 独 特 的 :; 进 化 模 式 与 其 寄 生 生 活 密 切 相 关 ( 本 课 题 组 图! 基 于 胰 岛 素 受 体 氨 基 酸 序 列 构 建 的 系 统 进 化 树 &'( )*)+(, $(-(+#. /'*01$(-(+#. +2(( 34)(5 1-4,#-1 4.#5 )(67(-.( 18 #-)70#- 2(.(/+12

5 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 年 月第 卷第 期 8 " 全序列结构预测 酪氨酸激酶结构域预测 " ( )# *+ (, - )$ " 图 的 结构预测! " #$$ # !'" 标志物 #/01! 双酶切产物 #/0 1! 质粒 1! 的 产物.!'" )- + ( #/01!, +,) ) # ) #/01! #+ ( 1!$ 图 重组质粒 &' 的双酶切鉴定!"! " (!! &)# &' (* $()!+* #! 蛋白质标志物 猪囊尾蚴阳性血清 1! 免疫兔血清 猪囊尾蚴阴性血清. )- 3 +) (, +) ))+, 1! '3 +) (,4 图 重组蛋白纯化后,#! ()! 分析,#! ()!!)*## " &$" (!! &! 的生物学功能 受体酪氨酸激酶在无胰岛素结合时以单体存在 没有活性 当胰岛素与受体的 亚基结合并改变了 亚基的构型后 自身酪氨酸磷酸化 经磷脂酰肌醇 激酶 5 途径及丝裂原活化蛋白激酶."5 途径等信号传导通路 促使葡萄糖转运因 8 子 6170 向细胞膜转位并摄取葡萄糖 存在 9 结合的 ':; 序列 而曼氏血吸虫 日本血吸虫和多房棘球绦虫的 都缺失 ':; 序列 暗示受体在进化过程中可能发生了功能分化 的 8 具有与人的 和 相似的 个酪氨酸残基 ;;; 参与 9 同源结构域 9 ), ) 9 的招募 与猪带绦虫的 相比 缺少 1 和 ' 区 但存在 ':; 基序 说明猪带绦虫的 和 可能与不同的胰岛素配体结合 从而发挥不同的功能 也有可能两者在猪带绦虫不同发育阶段差异表达 尽管 与人 的氨基酸序列有较大差异 但两者空间结构类似 进一步说明 结构的保守性 宿主胰岛素对多房棘球绦虫发育影响的研究表 明 外源性胰岛素对棘球绦虫发育有促进作用 可增加寄生虫 6170 基因的转录水平 促进葡萄糖吸收 如果阻断胰岛素 胰岛素受体信号通路 可能会导致寄生虫的发育受到影响 血吸虫的相关研究表明 用特异性 抑制剂和抗胰岛素受体 的抗体孵育成虫 成虫体内的葡萄糖水平大大降低 说明 与哺乳动物的 一样具有调节葡萄 糖代谢的能力 ;+ 等的研究证明 用日本血吸虫 配体结构区免疫小鼠 能够抑制日本血吸虫的生长 阻滞虫卵成熟 降低肝脏肉芽肿密度 大幅度减少粪便中的排卵量 2 效果优于一些已获得评估的日本血吸虫疫苗候选抗原 这表明基于阻断保守的胰岛素 胰岛素受体信号通路分子的疫苗或抑制性小分子 可能会成为防控人兽共患血吸虫病的有效生物制剂 基于相似的目的 本研究成功鉴定并表达了 的 1! 为进一步研究 在猪带绦虫不同发育阶段的表达水平 以及 1! 抗体体外封闭猪囊尾蚴 对其虫体葡萄糖吸收和糖原合成的影响 进而评价 1! 作为重组抗原疫苗的免疫效果 为研制基于 的新型疫苗和生物药物提供参考依据 参考文献 < + "93...+! $ 6 ), =, (

6 40 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 年 月第 卷第 期 #($ )* +,-./ ), '( * * $ 2 * 3 //4 1/ * 3 -*( * ( * #* 7 '( #! // 1 50 才学鹏 猪带绦虫基因工程疫苗的研究进展 第二届全国人兽共学术研讨会论文集 西安 中国畜牧兽医学会 // 54 1 ) " 8 9 : **** *2** # * * ( *# "* # // 0 5 ) " * -* * ## ** * ; *2** " " # , ' " " *2**; # ( " *- "* # " ) ( ( ( ( * # : ' // / 4 " ": ' ( ( ( 2 * : + #,* / 5 55: /, + ' & " *#- * * 2 *# 2 * #2 (* 7 //0 1 ( 7 <( )* #- 文章编号 ///5////40/ ## *# ( ( #2 #* # 2 2 ( *(:,3 / " # )* * ** ( *( *# 2 ) // / 6 # 6 ( ( #2 - - # 3 3 / 1 2 ' &*( " "!-* *# 2 #,3 // = 6 <( ( **! *# 7 // " " 2 ' &*( ) *# ( * # # // " * (2 ( ( )!,7 #* ' * //4 0 3! " * #* * (* ** // 411/ 44 4 沈稚舟 胰岛素受体及信号转导通路与胰岛素抵抗 第二军医大学学报 // // / = 6 + +'! + *# *( -2 -** ( *! ) / 4 0/0/5 收稿日期 //0 编辑 陈勤 病例报告 > 中图分类号 1$4 文献标识码! 患者 男 岁 黄石市阳新县龙港镇大坜村人 农民 年 4 月在黄石市中心医院诊断为 肾病综合征非典型膜性病变 一直口服曲安西龙 (; 1 年 1 月上旬起出现食欲下降 全身乏力 伴有恶心 呕吐 呕吐物为胃内容物 月 日出现腹泻 每日解黄色稀水样便 余次 至当地医院行粪检发现寄生虫 具体不详 予阿苯达唑 ( 口服 次 ; 并予补液治疗 1 效果欠佳 于 月 日以 肾病综合征 腹泻原因待查 收入黄石市中心医院普爱院区 入院查体 体温 5$5 脉搏 0 次 ; 呼吸 次 ; 血压 4;4 6( 6(? $ 全身多处可见瘀点 瘀斑 心肺腹未见明显异常 双下肢无水肿 入院当天检查 血常规示 白细胞 $5 4 ;7 中性粒细胞 01$@ 嗜酸粒细胞.:.. 4 A7 红 作者单位 湖北省黄石市中心医院普爱院区老年病科 黄石 1 > 通讯作者, E (2##2$* 细胞 :5/ A7 血红蛋白 (A7 血小板 0/ 4 A7 反应蛋白 /:0 (A7 电解质示 血钠 4: A7 血钾 :1 A7 血氯 05: A7 血钙 :0 A7 肝功能示 白蛋白 :4 (A7 粪常规 B 隐血示 颜色灰色 性状 黏液脓样 每个高倍镜视野下 红细胞 1 个 白细胞 // 个 虫卵阴性 潜血阳性 胃镜示慢性浅表性胃炎 入院后第 天复查血常规示 白细胞 /:/ 4 A7 中性粒细胞 5:0@ 嗜酸粒细胞 /:/4/ 4 A7 红细胞 :/ A7 血红蛋白 44 (A7 血小板 /4/ 4 A7 复查粪常规 B 隐血于新鲜标本中发现大量粪类圆线虫 C"#$ D 杆状蚴 图 " 体长约 50$1 宽约 $01 并见虫卵 图 3 遂予阿苯达唑 (; 驱虫治疗 在驱虫治疗第 5 天粪检未见该虫 但于第 天粪检再次发现该虫 继续驱虫治疗至第 天粪检未见粪类圆线虫 后反复多次复查未见该虫 驱虫治疗同时予以内科综合治疗 病情好转 下转第 / 页

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