1A) DTT kda HC 50 kda 1B) IdeS 1. IdeS 2. DTT kda Fc/2 Fd 图 1. 亚基的形成 1A) 使用 DTT 进行部分还原, 使得连接重链 (HC) 和轻链 () 的键被还原 1B) IdeS 酶解和还原, 可得到三种肽段

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戊巨芮
5 years ago
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1 使用 ACQUITY QDa 质谱检测器 Brooke M. Koshel Robert E. Birdsall 和 Ying Qing Yu 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势获取补充质谱数据, 使用 MassLynx 软件中的 MaxEnt 去卷积算法进行亚基分析对亚基数据进行常规监测可及时检测生产过程中的变化, 从而更有效地节省成本进行亚基糖型分析, 以快速筛查批次间一致性简介蛋白类治疗药物是一类快速发展的药物由于它们的生产工艺复杂, 在开发和生产过程中, 我们需要通过各种检测手段来监测其关键品质属性 (CQA), 以确保产品质量和安全性蛋白质糖基化修饰已成为一项重要的品质属性, 因为研究表明半乳糖基化修饰与某些市售重组单克隆抗体 (mab) 的细胞毒性有关 1 相关分析方法包括基于荧光和 MS 技术的释放 - 标记技术, 以及分别用于监测单个游离寡糖或糖蛋白的自下而上方法此外, 还可采用自中而下策略来评估 mab 亚基的主要糖型后一种方法在生产环境中尤其有用, 在这种环境下, 该方法能够以经济有效的方式及时报告糖基化分布的变化并进行纠正 ACQUITY QDa 质谱检测器是一款经济有效的工具, 可用作正交检测技术, 为现有工作流程增加获取质谱数据的功能本研究旨在评估将 ACQUITY QDa 质谱检测器应用于亚基分析的适用性曲妥珠单抗是一种 IgG1 抗体, 可以被二硫苏糖醇 (DTT) 还原为大约的轻链和大约 50 kda 的重链肽段 ( 图 1A) 采用 MassLynx 软件进行数据采集, 能够通过 MaxEnt1 去卷积算法解析复杂的谱图, 以便测定各个亚基的分子量 IdeS 酶解和还原可产生三种肽段, 每种肽段约 ( 图 1B) 由于 IdeS 酶解会使得抗体铰链区的单个位点处发生专属性的高效裂解, 因此它成为了治疗性 mab 的常用表征工具之一, 而在本例中, 我们将其作为监测主要糖型的一种替代方法沃特世解决方案 ACQUITY UP H-Class 系统 ACQUITY QDa 质谱检测器 ACQUITY UP 可变波长紫外 (TUV) 检测器带有 MaxEnt1 的 MassLynx 软件 4.1 版 ACQUITY UP BEH 蛋白分析专用柱关键词单克隆抗体, 亚基分析,IdeS 酶解, ACQUITY QDa 质谱检测器 82

2 1A) DTT kda HC 50 kda 1B) IdeS 1. IdeS 2. DTT kda Fc/2 Fd 图 1. 亚基的形成 1A) 使用 DTT 进行部分还原, 使得连接重链 (HC) 和轻链 () 的键被还原 1B) IdeS 酶解和还原, 可得到三种肽段 :Fc/2 和 Fd, 每种肽段的大小约为糖基化修饰发生在 Fc 区域, 因此, 对重链或 Fc/2 肽段进行质谱检测即可监测糖基化修饰谱图 83

实验条件系统 : 吸收波长 : 采样速率 : 色谱柱 : ACQUITY UP H-Class 系统 214 nm 5 Hz 柱温 : 80 C 流动相 A: 流动相 B: ACQUITY UP BEH C 4 蛋白分析专用柱, 1.7 µm, 2.1 mm x 50 mm ( 部件号 186004495) 0.1% (v/v) 甲酸的水溶液 0.

3 实验条件系统 : 吸收波长 : 采样速率 : 色谱柱 : ACQUITY UP H-Class 系统 214 nm 5 Hz 柱温 : 80 C 流动相 A: 流动相 B: ACQUITY UP BEH C 4 蛋白分析专用柱, 1.7 µm, 2.1 mm x 50 mm ( 部件号 ) 0.1% (v/v) 甲酸的水溶液 0.1% (v/v) 甲酸的乙腈溶液曲妥珠单抗的部分还原 : 将 10 µl 21 mg/ml 的曲妥珠单抗加入 190 µl 25 mm 的 Tris-HCl (ph 7.5) 中, 得到蛋白质浓度约为 1 mg/ml 的样品将浓缩 DTT 加入此样品中, 使溶液中的最终 DTT 浓度达到 1.0 mm 接下来, 将样品置于 37 C 下温育 20 min 加入等体积的 3% 乙腈和 0.1% 甲酸水溶液, 使蛋白质的最终浓度达到约 0.5 mg/ml 立即进样分析, 因为该样品不宜长期储存曲妥珠单抗的 IdeS 酶解和还原 : 将溶于 25 mm Tris 缓冲液中的 1 mg/ml 曲妥珠单抗样品与 IdeS 蛋白酶 (FabRICATOR ;Genovis, 美国马萨诸塞州剑桥 ) 一起置于 37 C 下温育 30 min 向经过 IdeS 酶解的样品中加入浓缩 DTT, 使溶液中 DTT 的最终浓度达到 1.0 mm 将所得的样品置于 37 C 下温育 20 min 在进样前, 向样品中加入等体积的 3% 乙腈和 0.1% 甲酸水溶液, 使蛋白质的最终浓度达到约 0.5 mg/ml 样品温度 : 10 C 进样体积 : 3 µl 梯度 : 时间 (min) 流速 (ml/min) %A %B %C %D 初始 QDa 设置采样速率 : 质量范围 : 电离模式 : 锥孔电压 : 毛细管电压 : 5 Hz Da ESI+, 连续 15 V 1.5 kv 探头温度 : 600 C 数据管理带有 MaxEnt1 的 MassLynx 软件 4.1 版 84

4 结果与讨论为了获得曲妥珠单抗的轻链和重链数据, 按照前文所述的方法对抗体进行部分还原光谱图如图 2A 所示为了测定每种肽段的质量数, 利用 MassLynx 软件的 MaxEnt1 算法将质谱数据去卷积为零电荷态使用统一高斯模型将 MaxEnt1 分辨率设置为 0.5 Da/ 通道, 峰宽 0.7 Da 从目标峰的中间到基线部分对谱图进行合并所用的最大迭代次数为 20, 以避免过度处理数据图 2B 和图 2C 分别为轻链和重链亚基的去卷积谱图轻链去卷积使得电荷包络坍缩为单个峰, 而重链去卷积鉴定出了四种主要糖型 2A) ACQUITY UP TUV HC (min) 2B) ACQUITY QDa 2C) ACQUITY QDa G0F G1F G0 G2F (Da) (Da) 图 2. 曲妥珠单抗的部分还原 2A) 为光谱图, 展示了轻链 () 和重链 (HC) 肽段的分离结果 2B) 和 2C) 为 ACQUITY QDa 质谱检测器采集到的对应质谱数据利用 MaxEnt1 算法对轻链和重链肽段进行去卷积轻链坍缩为单电荷态, 而重链则包含四种糖型 85

5 由于 ACQUITY QDa 质谱检测器的质量数范围为 m/z, 轻链和重链的低电荷态均超出了这一检测窗口图 3 叠加了根据 ACQUITY QDa 数据得到的轻链电荷包络与采用扫描范围更宽的高清 MS 得到的模拟电荷包络从叠加谱图中可以看到,ACQUITY QDa 数据仅仅是高清仪器产生的电荷包络的一部分为了确定这种关系对质量数测定的影响, 我们在表 1 中列出了由 MaxEnt1 生成的轻链和重链结果, 并将其报告为实验质量数, 并与理论平均分子量进行了对比 ACQUITY QDa mab m/z m/z 图 3. 轻链电荷包络的叠加谱图 ACQUITY QDa 质谱检测器的结果 ( 蓝色 ) 覆盖了高清 MS 生成的电荷包络 ( 虚线 ) 的一部分 ACQUITY QDa 数据包括电荷态部分还原 IdeS 酶解和还原轻链重链 Fc/2 G0 G0F G1F G2F G0 G0F G1F G2F 平均质量数 (Da) 实验质量数 (Da) Δ 质量数 (Da) 质量精度 (ppm) 表 1. 部分还原曲妥珠单抗和经过 IdeS 酶解并还原的曲妥珠单抗的实验质量数 ( 使用 MaxEnt1 进行去卷积所得 ) 与理论平均分子量对比质量精度的计算方法为 (Δ 质量数 / 平均质量数 ) *

6 仪器造成的质量误差与电荷态成正比, 较大的误差与较高的电荷态有关以的电荷态为例, 这个范围涵盖了使用 ACQUITY QDa 质谱检测器采集到的轻链和重链电荷包络对应的电荷态范围, 与这些电荷态相关的仪器质量误差在 ±3.8 Da -±10 Da 范围内 (±0.2 电荷态 ) 如果考虑曲妥珠单抗的轻链, 其电荷态在范围内, 预期质量精度为 150 ppm ppm 由于报告的轻链实验质量精度为 60 ppm( 表 1), 该值显然在仪器的预期范围内同样地, 重链的质量精度应在 ppm 范围内, 而所有肽段都满足此标准 ( 表 1) 为了进一步测试 ACQUITY QDa 质谱检测器在亚基分析中的适用性, 我们采用常用的 IdeS 酶, 通过第二种方法生成亚基片段通过 IdeS 酶解和还原, 产生了三种肽段 (Fc/2 和 Fd ), 每种肽段的大小约为图 4A 展示了经 IdeS 酶解和还原后的曲妥珠单抗样品的光谱图, 三种肽段清晰地彼此分离图 4B 展示了包含糖基化修饰位点的 Fc/2 肽段的去卷积质谱数据, 图中展示了之前从重链数据中鉴定出的四种糖型表 1 报告了来自 Fc/2 肽段的糖型的质量精度, 结果均处于仪器的预期范围内与部分还原类似,IdeS 酶解和还原也能对目标产品进行确证, 还能更轻松地确定生产过程中发生的变化 4A) ACQUITY UP TUV Fc/2 Fd (min) 4B) ACQUITY QDa Fc/2 G1F G0F G0 G2F (Da) 图 4. 曲妥珠单抗的 IdeS 酶解和还原 4A) 为光谱图, 展示了 Fc/2 和 Fd 肽段的分离结果 4B) 为 ACQUITY QDa 质谱检测器采集到的对应质谱数据通过去卷积鉴定出了四种 Fc/2 糖型 87

结论本研究证明, 使用 ACQUITY QDa 质谱检测器, 可通过两种不同的方法可靠地进行亚基水平的质量数测定将曲妥珠单抗样品部分还原, 得到完全处于仪器预期质量精度限以内的轻链和重链肽段通过 IdeS 酶解和还原, 获得具有较低电荷态的小分子抗体亚基片段通过监测约 50 kda 的重链肽段以及 IdeS 酶解和还原所得的 Fc/2 肽段 ( 约 ) 的主要糖型,

7 结论本研究证明, 使用 ACQUITY QDa 质谱检测器, 可通过两种不同的方法可靠地进行亚基水平的质量数测定将曲妥珠单抗样品部分还原, 得到完全处于仪器预期质量精度限以内的轻链和重链肽段通过 IdeS 酶解和还原, 获得具有较低电荷态的小分子抗体亚基片段通过监测约 50 kda 的重链肽段以及 IdeS 酶解和还原所得的 Fc/2 肽段 ( 约 ) 的主要糖型, 我们对比了两种处理方法所得的结果, 这两种方法均通过 ACQUITY QDa 质谱检测器进行了快速有效亚基数据采集, 最终可应用于验证产品一致性和产品成分的筛查方案中参考文献 1. Raju T.S. and Jordan R.E. Galactosylation variations in marketed therapeutic antibodies. mabs (3): 扫一扫, 关注沃特世微信沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters The Science of What s Possible ACQUITY MassLynx ACQUITY UP 和 QDa 是沃特世公司的注册商标 MaxEnt 是沃特世公司的商标其它所有商标均归各自的拥有者所有 2016 年沃特世公司中国印刷 2016 年 5 月 ZH AG-PDF 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

实验条件质谱条件质谱仪 : SYNAPT G2-S HDMS 毛细管电压 : 2.0 kv 试剂辉光放电电流 : 70 µa 源温度 : 100 采样锥孔电压 : 25 V 提取锥孔电压 : 3 V 试剂补偿气体流速 : 25 ml/min 脱溶剂气温度 : 200 锥孔气体流速 : 30.0

实验条件质谱条件质谱仪 : SYNAPT G2-S HDMS 毛细管电压 : 2.0 kv 试剂辉光放电电流 : 70 µa 源温度 : 100 采样锥孔电压 : 25 V 提取锥孔电压 : 3 V 试剂补偿气体流速 : 25 ml/min 脱溶剂气温度 : 200 锥孔气体流速 : 30.0 [ 应用纪要 ] Jonathan P. Williams Jeffery M. Brown Stephane Houel Ying Qing Yu 和 Weibin Chen 沃特世公司, 美国马萨诸塞州米尔福德方案优势由超级电荷试剂辅助的 ET D 碎裂技术可提高糖肽碎裂效率经证明配备 ET D 源的 SYNAPT G2-S HDMS 系统是蛋白糖基化分析不可缺少的工具引言蛋白质糖基化修饰是重组抗体药物生产的一个主要要求,