实验 样品制备 QTof 检测精确分子量, 偏差可控制在 1 ppm; 一针进样同时得到一级及二级质谱 称取 cefzon 样品 40 mg 于 25 ml 容量瓶中, 用醋酸铵溶液 ( 流动相 A 相 ) 溶解 超声后离心, 去上层清液进液质系统 与主峰结构相关的杂质 软件自动给出已鉴定出的杂质列

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1 [ 应用纪要 ] 市售头孢地尼 (Cefdinir) 药品中杂质快速自动鉴定 应用 ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof 系统及 UIFI 软件 王志英沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 应用优势 使用亚 2 µm 色谱柱, 提高分析效率 通过 UIFI 软件快速自动进行杂质鉴定 解析及报告, 节省人力及时间 简介头孢地尼 (Cefdinir) 属第 3 代头孢, 日本藤泽药品工业公司原研,1991 年首次在日本上市, 商品名 Cefzon 1997 年 12 月在美国上市,2001 年国产头孢地尼获准在中国上市 该品具有抗菌谱广 抗菌作用强 临床疗效高 毒性低 过敏反应少 方便使用等特点 近年来, 国内已准备开发其仿制药 但如今基于药品安全的考虑, 仿制药中的有关物质的检测越发引起注意, 中国药典上也明确规定, 药物中杂质含量高于 0.1% 的所有杂质均需对其杂质结构进行鉴别 ( 毒性药物限度则更低 ) 所以, 如何高效快速地测定药物中的杂质, 这一课题逐渐成为药物研究过程中亟待解决的难题 中国药典中头孢地尼有关物质检测方法所用的流动相为四甲基氢氧化铵 磷酸 (p5.5) 体系, 无法进 M 系统 ; 采用普通 PLC 色谱柱检测方法时间长, 约需 60 min, 且杂质较多 这都给头孢地尼杂质鉴定带来挑战 沃特世解决方案 本文采用沃特世 (Waters ) 超高效液相色谱飞行时间质谱联用 (ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof) 技术对市售头孢地尼样品杂质进行分析, 开发与质谱兼容的 UPLC 方法, 使整个分离时间缩短至 14 分钟, 且杂质得到有效分离 ; 应用 UIFI 软件, 自动得到包含各个杂质分子量 分子式及结构信息的杂质列表, 使整个杂质鉴定过程高效快速 节省人力 ACQUITY UPLC Xevo G2- QTof 质谱仪 UIFI 软件 ACQUITY BE C 18, mm,1.7 µm 色谱柱 2 C 2 关键词 图 1. 头孢地尼 (Cefdinir)C UPLC,QTof, 杂质鉴定,UIFI, 头孢地尼 1

2 实验 样品制备 QTof 检测精确分子量, 偏差可控制在 1 ppm; 一针进样同时得到一级及二级质谱 称取 cefzon 样品 40 mg 于 25 ml 容量瓶中, 用醋酸铵溶液 ( 流动相 A 相 ) 溶解 超声后离心, 去上层清液进液质系统 与主峰结构相关的杂质 软件自动给出已鉴定出的杂质列表, 通过 workflow 筛选杂质 与主峰结构无关的杂质 通过软件, 应用元素组成分析, 确定分子式 色谱条件 LC 系统 : ACQUITY UPLC 色谱柱 : BE C 18, mm,1.7 µm ( 部件号 : ) 柱温 : 25 进样量 : 4 µl 流速 : 流动相 A: 流动相 B: 梯度表 : 0.40 ml/min 10 mm 醋酸铵 ( 醋酸调 p4.6) 水溶液 Me/AC(1/1) 时间流速 %A %B 曲线 初值 M 条件 软件通过 Location 功能快速判断结构变化发生的位点, 再通过 Fragment 功能对二级质谱碎片结构解析, 相关杂质进行结构解析与确证 图 2. 实验流程图 结果与讨论 1. 本文使用 UPLC 亚 2 µm C 18 色谱柱, 流动相用质谱兼容的醋酸铵体系 本方法将药典中约 60 分钟的方法缩短至 14 分钟, 且杂质分离度较好 采用 M E 这种简单实用的专利技术采集样品, 可以实现进样一次便可同 时得到一级质谱图和丰富的离子碎片信息, 其中包括母离子扫描 子 离子扫描和中性丢失扫描的结果, 并且避免了杂质信号的丢失 图 3 为 一针进样同时得到 cefzon 样品紫外光谱图 一级质谱总离子流图 二级 质谱总离子流图 通过软件中在线和离线的数据库寻找匹配的可能结构 通过软件对可能结构进行二级质谱图碎片匹配, 进一步确定结构 M 系统 : Xevo G2- QTof 离子化模式 : EI+ 毛细管电压 : 2.0 kv 源温度 : 120 雾化气温度 : 500 雾化气流速 : 锥孔气流速 : 采集模式 : 900 L/h 50 L/h M E 采集质量范围 : 100~1200 PDA 检测器 紫外检测波长 : 254 nm 软件 UIFI 1.7 版本 市售头孢地尼 (Cefdinir) 药品中杂质快速自动鉴定 应用 ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof 系统及 UIFI 软件 2

3 UV 254 nm 色谱图 一级质谱总离子流图 二级质总离子流图 图 3. 一针进样即可得到头孢地尼 cefzon 样品的紫外光谱图 一级质谱及二级质谱总离子流图 2. 使用 UIFI 软件将数据进行自动处理后, 直接得到各杂质的提取离子流图 一级和二级质谱图 图 4 为主峰的分子量 分子式信息 提取离子流图 一级和二级质谱图 UIFI 软件自动对二级碎片进行匹配解析, 鼠标放置于标志上, 即可查看碎片结构 图 5 为主峰的二级碎片解析情况 分子式等信息 提取离子流图 主峰的一级质谱图 主峰的二级质谱图 图 4. UIFI 软件处理后直接得到主峰头孢地尼的提取离子流图 一级及二级质谱图 市售头孢地尼 (Cefdinir) 药品中杂质快速自动鉴定 应用 ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof 系统及 UIFI 软件 3

4 图 5. UIFI 软件自动对主峰二级碎片进行解析, 鼠标放置于 标志上, 即可查看碎片结构 3. UIFI 会自动给出已鉴定出的杂质列表, 可通过左侧的工作流程 (workflow) 快速筛选出与主峰相关的杂质 如图 6 是 UIFI 软件界面, 软件中质谱图上标志处均对应有结构式, 将鼠标放在标志上即可显示 图 7 为快速确定的杂质列表, 里面包含有 m/z 保留时间 分子量 分子式 质量偏差 响应 响应百分比及具体的结构信息等 图 7 中显示出质量偏差均小于 0.7 md, 说明了 Xevo G2- QTof 优良的准确性 另外,UIFI 最大的特点就是比较人性化, 其每一行列均可根据客户需求进行自定义增减 它还有多种视图方式使结果看起来更直观 如图 8 所示, 软件可对两针样品进行对比, 寻找差异组分或共同组分, 也可显示整个谱图的对比和某一组分在两针样品中的质谱图对比 杂质列表 工作流程 一级质谱图 提取离子流图 二级质谱图 图 6. UIFI 软件的人性化界面, 应用左侧工作流程快速得到杂质列表 市售头孢地尼 (Cefdinir) 药品中杂质快速自动鉴定 应用 ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof 系统及 UIFI 软件 4

5 图 7. 应用工作流程快速得到的杂质列表, 里面包含杂质峰 m/z 保留时间 分子量 分子式 质量偏差 响应 响应百分比及具体的结构信息等 样品一级总离子流图 空白一级总离子流图 样品与空白一级总离子流图差减后谱图 图 8. UIFI 软件的谱图对比功能, 可用来寻找差异组分或共同组分 市售头孢地尼 (Cefdinir) 药品中杂质快速自动鉴定 应用 ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof 系统及 UIFI 软件 5

6 4. 对于与母药结构无关的组分, 可通过手动鉴定出结构 思路为先由下拉框中 元素成分 判 断出其分子式, 再由 库搜索 或 Chempider 搜索 得到其可能结构, 最后通过 碎片离子匹 配 确定可能结构, 如图 9 图 9. 软件可以通过 说明 功能对杂质峰进行自定义结构确认, 具体功能包括 : 库搜索 同位素匹配 元素成分 碎片离子匹配 局部转化 中性丢失 碎片搜索等功能 UIFI 软件可通过 元素成分 功能确定最可靠的分子式 软件通过准确分子量 同位素分布及 二级碎片信息三要素, 得到最可能的分子式, 如图 10 再通过在线的或离线的数据库搜索分子 式可能的结构, 如图 11 最后通过 碎片离子匹配 功能对可能结构进行确认 碎片离子信息 同位素分布 质量偏差 图 10. UIFI 软件通过准确分子量 同位素分布及二级碎片信息三要素, 得到最可能的分子式 市售头孢地尼 (Cefdinir) 药品中杂质快速自动鉴定 应用 ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof 系统及 UIFI 软件 6

7 在线数据库结果 实时更新的 500 多个数据库 显示相应结构 图 11. UIFI 软件可通过离线的或实时更新的在线数据库搜索分子式可能的结构 在图 7 的杂质列表上, 给出的结构信息为母药加减某些官能团, 但官能团加在哪里? 如图 12 所示, 局部转化 功能会通过碎片对比, 给分子式上可能的位置打分, 分数越高, 显示绿色处为最可能发生反应处 杂质为 cefdinir+ 2, 2 加在什么地方, 软件可根据碎片对比对各位点进行打分, 分数约高处发生反应的可能性约大 图 12. UIFI 软件自动对反应位点进行打分 ( 局部转化 功能 ) 市售头孢地尼 (Cefdinir) 药品中杂质快速自动鉴定 应用 ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof 系统及 UIFI 软件 7

8 5. 通过 UIFI 软件智能的工作流程 人性化设计及强大的杂质解析功能, 可快速鉴定出各杂质的 具体可能结构, 如图 13 2 a a-2 2 Cefdinir-C2+2 C 2 Cefdinir Cefdinir- 2 a-2 Cefdinir+2 Cefdinir+2 Cefdinir-C+2 Cefdinir--C+2 图 13. 头孢地尼杂质的可能结构 6. 杂质鉴定, 应用 QTof 采集和软件鉴定过程得到的信息量巨大, 如何出具信息最全面的报告是分析工作者一直比较头疼的问题 UIFI 软件支持审计追踪, 可编辑 人性化的报告模板与其他同类软件相比, 功能更加强大, 更能满足需求 如图 14, 在报告模板中, 从右边工具栏处, 直接将需要的选项拖至左边图版上即可 UIFI 产生的报告中会显示您期望得到的任何信息, 图 15 为报告中 RT min 杂质的提取离子流图 一级和二级质谱图 强大而简单的编辑工具 图 14. UIFI 软件可编辑 人性化的报告模板 市售头孢地尼 (Cefdinir) 药品中杂质快速自动鉴定 应用 ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof 系统及 UIFI 软件 8

9 图 15. 举例 UIFI 报告中 RT min 杂质的提取离子流图 一级和二级质谱图 市售头孢地尼 (Cefdinir) 药品中杂质快速自动鉴定 应用 ACQUITY UPLC/Xevo G2- QTof 系统及 UIFI 软件 9

10 结论本实验采用亚 2 µm 的 UPLC 色谱柱, 应用质谱可兼容的醋酸盐体系对市售样品头孢地尼 cefzon 进行了检测, 采集时间缩短至 14 分钟, 且峰形和分离度较好, 大大提高了分离效率 通过 UIFI 软件分析了 cefzon 样品, 共鉴定出 20 个杂质 由于 Xevo G2- QTof 系统具有较高的准确性和稳定性, 鉴定出的所有杂质质量偏差均小于 0.7 mda 软件能自动给出杂质列表, 包括分子量 分子式 响应值及其结构信息 头孢地尼中的杂质多半为同分异构体, 有的为位置异构, 有的为光学异构 对比其二级质谱, 差异都不大 这种情况下, 通过质谱手段将具体手性结构与杂质峰一一对应可靠性不高 可借助分离纯化手段拿到对照品再进一步确定结构 随着药物质量标准要求的提高, 需要对药物中的有关物质进行定性分析 得到有关物质的可靠结构信息对药物质量控制和质量保证至关重要 本文采用沃特世 ACQUITY UPLC/ Xevo G2- QTof 系统, 对药物头孢地尼样品有关物质进行结构鉴定, 通过强大的软件功能, 将复杂的结构鉴定过程变得智能而快速, 大大节省了人力物力及时间成本, 对于药物的有关物质研究工作起到积极的推动作用 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters,ACQUITY UPLC,UPLC,Xevo,UIFI 和 The cience of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 其他所有商标均归各自拥有者所有 2014 年沃特世公司 印制于中国 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

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