5 期周舒扬等 : 黑龙江省玉米弯孢菌叶斑病病原鉴定及其产细胞壁降解酶和漆酶活性分析 127 菌分离形态学鉴定工作当前黑龙江省玉米主栽品种缺乏抗病品种, 玉米弯孢菌叶

Size: px

Start display at page:

Download "5 期周舒扬等 : 黑龙江省玉米弯孢菌叶斑病病原鉴定及其产细胞壁降解酶和漆酶活性分析 127 菌分离形态学鉴定工作当前黑龙江省玉米主栽品种缺乏抗病品种, 玉米弯孢菌叶"

蒂新耿
7 years ago
Views:

1 玉米科学 2010,18(5):126~130 Journal%of%Maize%Sciences 文章编号 : (2010) 黑龙江省玉米弯孢菌叶斑病病原鉴定及其产细胞壁降解酶和漆酶活性分析周舒扬 1, 杨洪一 1, 赵敏 1, 梅丽艳 2 (1. 东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 ; 2. 黑龙江省农业科学院植物保护研究所, 哈尔滨 ) % % % % 摘要 : 对黑龙江省感染玉米弯孢菌叶斑病的叶片进行采集, 利用组织分离法对病原菌进行分离, 并进一步单孢纯化, 经形态学特征并结合真菌核糖体 (Internal%Transcribed%Spacer,%ITS) 序列分析确认病原菌为新月弯孢菌 (Curvularia lunata) 细胞壁降解酶和漆酶活性测定显示, 病原菌可产生多聚半乳糖醛酸酶 (PG) 聚甲基半乳糖醛酸酶 (PMG) 纤维素酶 (β-1,4- 内切葡聚糖酶,Cx) 和漆酶 (Laccase),PG 和 PMG 的活性在第 4 天有一个峰值, 在第 10 天 PG 有一个小峰值 ; 而 Cx 的活性较低且变化幅度不大新月弯孢菌生长到 72%h 漆酶酶活达到最高峰, 随后酶活逐渐下降 ; 各种酶可连续产生, 首先是漆酶酶活迅速增加, 其次是 PMG, 再次是 PG, 而 Cx 的变化较小研究首次发现新月弯孢菌产漆酶, 推断其可能也在病菌侵入过程中发挥了重要作用关键词 : 玉米弯孢菌叶斑病 ; 细胞壁降解酶 ; 漆酶 ; 黑龙江省中图分类号 : S % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % 文献标识码 : A The Pathogen Identification of Maize Curvularia Leaf Spot and Analysis on the Enzyme Activity of the Cell Wall-degrading Enzyme and Lactase ZHOU%Shu-yang 1,%YANG%Hong-yi 1,%ZHAO%Min 1,%MEI%Li-yan 2 (1.%College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin ; 2.%Plant Protection Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin ,%China) % % % % Abstract:% The% leaves% of% maize% infected% by% Curvularia% leaf% spot% were% collected% from% Heilongjiang,% and% the% pathogen%was%isolated%by%tissue-isolate%methods,%and%purified%from%the%individual%spore.%curvularia lunata was%testified%as%the%pathogen%by%combining%morphological%characteristics%with%the%fungal%ribosomal%its% (Internal%transcribed% spacer)%sequence%analysis.%the%pathogen,%curvularia lunata,%could%produced%poly-galacturonic%acid%enzyme(pg),%poly% methyl%galacturonic%acid%enzyme (PMG),%β-1,4-endo-glucan%enzyme (Cx)%and%laccase.%There%was%a%peak%of%the%PG% and%pmg%activities%in%the%4th%day%and%a%small%peak%in%the%10th%day%of%pg%activity.%the%cx%activity%was%low%with%little% fluctuating.%the%activity%of%laccase%of%curvularia lunata reached%a%peak%in%the%first%72%hours,%and%followed%by%a%gradual% decline.%various%enzymes%were%continuously%produced,%there%was%a%rapid%increase%of%laccase%activity,%followed%by%the% PMG,%then%the%PG,%while%there%were%little%changes%for%the%Cx.%This%was%the%first%report%laccase%could%be%produced%by% Curvularia lunata.%laccase%is%likely%to%play%an%important%role%for%the%incursion%of%pathogen. % % % % Key words:%curvularia%leaf%spot;%its;%cell%wall-degrading%enzyme;%laccase;%heilongjiang%province 玉米弯孢菌叶斑病是近年我国发现的一种新病收稿日期 : 作者简介 : 周舒扬 (1983-), 女, 辽宁庄河人, 硕士, 主要从事植物病原鉴定的研究 Tel: zhoushuyang1983@163.com 害, 该病在欧洲美洲亚洲及非洲玉米产区均有发生, 严重时产量损失可达 60% [1,2] 近年来, 在陕西河北山东山西北京辽宁吉林等省 ( 市 ) 也有此病发生, 其危害程度有超过玉米大斑病和玉米小斑病的趋势 1996 年该病在辽宁省暴发流行, 玉米总 [3] 产量损失达 25 万 t 梅丽艳等报道了黑龙江省玉米弯孢菌叶斑病的危害情况, 并进一步开展了病原

2 5 期周舒扬等 : 黑龙江省玉米弯孢菌叶斑病病原鉴定及其产细胞壁降解酶和漆酶活性分析 127 菌分离形态学鉴定工作当前黑龙江省玉米主栽品种缺乏抗病品种, 玉米弯孢菌叶斑病危害日益严重, 但相关研究较少, 对病原菌的种类分布致病型分化等了解较少, 影响了抗病育种的开展, 同时对病菌的致病机理尚不了解禾本科植物的细胞壁主要由纤维素木聚糖和果胶质等成分构成, 这些成分构成了植物体的天然屏障, 阻碍了病菌侵入然而, 病菌在侵入寄主的过程中产生多种细胞壁降解酶, 如纤维素酶木聚糖酶果胶质酶等, 这些酶软化分解寄主细胞壁, 促进 [4] 了病原菌侵入近年来, 漆酶 (Laccase) 也被发现在病原菌侵入过程中起着重要作用漆酶是一种含铜的多酚氧化酶, 具有较强的氧化还原能力, 能够氧化 [5] 酚类物质, 催化木质素的降解本研究对玉米弯孢菌叶斑病病原菌进行分离鉴定, 并对病菌产生的细胞壁降解酶和漆酶进行分析, 进一步明确病原菌类别, 并初步了解病原菌的侵入机理 1% % 材料与方法 1.1% % 实验材料 1.1.1% % 菌株新月弯孢菌菌株分离自哈尔滨地区玉米田, 保存于本实验室 ; 大肠杆菌 DH5α 菌株保存于本实验室 1.1.2% % 培养基 [6] 液体 PDA 培养基配方 : 葡萄糖 20%g,KH 2 PO 4 %3% g,mgso 4 7H 2 O%1.5%g, 马铃薯 200%g 煮汁,VB 1 % 微量, 定容至 1%L, 自然 ph Czaper 液体培养基配方 :KNO 3 %2.0%g,KCl%0.5%g, FeSO 4 %0.01%g,K 2 HPO 4 %1.0%g,MgSO 4 7H 2 O%0.5%g, 果胶 ( 或甲基纤维素钠 CMC)%10%g, 水 1%000%mL 1.2% % 实验方法 1.2.1% % 病原菌分离及形态学鉴定将染病玉米叶片用蒸馏水冲洗干净, 经 0.2% 升汞表面漂洗 10~30%s, 无菌水冲洗 3 次,75% 乙醇消毒 1%min, 再用无菌水冲洗干净 ; 将处理好的叶片组织在无菌条件下切成小块接种到固体 PDA 培养基 [7] 上,(28±1) 静置培养在显微镜下进行单孢纯化, 获得纯化菌株后 4 试管斜面保存将菌株于 PDA 平板活化,4~5%d 后观察其菌落特征, 并挑取其分生孢子制片在显微镜下检测 1.2.2% % 病原菌的分子鉴定将供试菌株转接到 PDA 平板上活化培养 5%d, 取菌丝块 ( 直径 5%mm) 接种至液体培养基上,30 下 [8] 150%r/min, 培养 3%d, 收集菌丝, 用 CTAB 法提取基因组 DNA 采用引物 :ITS1:5 -TCCGTAGGTGAACCTGCG-% G-3,ITS4:5 -GCATATCAATAAGCGGAGGA-3, 扩增真菌核糖体 DNA 的 ITS1+5.8S+ITS2 片段反应程序为 94 预变性 5%min,94 变性 1%min,54 退火 1%min,72 延伸 1.5%min,36 个循环 ;72 延伸 10% min 采用博大泰克公司生产的胶回收试剂盒, 对目的片段进行回收回收 PCR 片段连接至 pmd18-t 载体中后转入大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中, 经菌落 PCR 剔除假阳性, 将阳性克隆送上海生物工程有限公司测序相关具体操作参见文献 [9] 经测序获得菌株完整的 ITS 序列 ( 包括 5.8S% rdna), 经过在 GenBank 中进行 BLAST 搜索后下载相关菌株的 ITS 序列, 所得序列用 Clustal%X%1.81 程序进行多序列比对, 应用 MEGA%4.0 软件中的临近 [10] 法 (neighbor-joining,nj) 构建系统发育树 1.2.3% % 细胞壁降解酶的培养和提取 [11] 采用改良的 Czaper 液体培养基病菌在 25 下 PDA 平板上培养 7%d, 用打孔器在菌落边缘打下菌片 ( 直径 5%mm), 每个三角瓶 (250%mL) 含 100%mL% PDA 液体培养基, 加 4 个菌片, 培养温度 25 不同处理分别在培养第天过滤除去菌丝,4 下 10%000%r/min 离心 25%min, 取上清液作为活体外待测果胶酶和纤维素酶液 1.2.4% % 细胞壁降解酶活性测定 [12] 采用紫外 - 可见光分光光度计法测定反应混合液为 1%mL 酶液 1%mL 醋酸 - 醋酸钠缓冲液 (50% mol/l,ph 值 5.0) 1%mL 底物 (1% 果胶酸钠或 1% 果胶或 1% 羧甲基纤维素钠, 用 ph 值 5.0 的 50%mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液配制 ), 分别用来测定多聚半乳糖醛酸酶 (PG) 聚甲基半乳糖醛酸酶 (PMG) 和纤维素酶 (β-1,4- 内切葡聚糖酶,Cx)% 活性, 于 30 水浴锅中反应 30%min, 立即加入 3,5- 二硝基水杨酸 1.5% [13] ml 中止反应, 并按 DNS 法测定反应释放的还原糖量对照中止反应后加入底物, 其余操作同上根据酶反应所释放的还原糖量计算 PG PMG 和 Cx 的活性,PG PMG Cx 的酶活单位为 30 下催化底物释放 1%μg/min 还原糖所需酶量所有酶活测定均 3 [14] 次重复酶蛋白浓度按考马斯亮蓝 G250 法测定 1.2.5% % 漆酶 (Laccase)% 酶活的测定采用 ABTS[2,2 -azinobis(3-ethylbenzthiazoline-%

3 128 玉米科学 18 卷 [15] 6-sulphonate)] 法测定, 用分光光度计在 420%nm 波光下检测漆酶与底物 ABTS 在 30 反应 3%min 的吸光度, 计算漆酶活性酶活单位定义为 l%min 氧化 1% μmol 底物所需的酶量为 1 个酶活单位 (U) 测定吸光度体系为 : 空白对照管中加 1.95mL 柠檬酸 - 磷酸盐缓冲液 (ph 值 3.0),0.05%mL 稀释后灭活的酶液 1%mL 的 ABTS(1%mmol/L); 检测管中加 0.05%mL 稀释后的酶液, 其他同空白管, 测定值与稀释倍数的乘积即为待测样品的酶活力所有测量均重复 3 次, 取平均值 2% % 结果与分析 2.1% % 病原菌分离及形态学鉴定选取典型病害样本进行分离, 经分离纯化得到菌株 5 个, 初步认定其皆为同种菌选取其中的一个菌株进行进一步研究, 命名为 zz2 菌株 zz2 在 PDA 固体培养基上 27 培养 3%d 后菌落直径超过 5%cm, 6%d 就长满直径 9%cm 的培养皿菌丝绒毛状, 最初为白色, 随着培养时间增加, 由中央向边缘逐渐转变为底部灰黑色, 上面布满灰白色绒毛状菌丝 ( 图 1); 培养基背面从第 2 天起中间灰黑色, 靠近边缘鲜黄色, 后逐渐全部转变为墨绿色挑取菌株 zz2 分生孢子制作玻片进行镜检分生孢子梗深褐色, 有横隔, 顶端多屈曲 ; 分生孢子淡褐色, 梭形, 有 3 个隔膜, 从基部向上数第 3 个细胞特大, 直径 (15~30)%μm% (5~19)%μm( 图 1) 依据上述形态学特征, 根据真菌鉴定手册 [16] 中弯孢菌属 (Curvlaria) 及新月弯孢菌 (Curvularia lunata) 的描述, 初步确认该菌为新月弯孢菌注 :a 为 PDA 培养基中的菌落 ;b 为分生孢子梗 ;C 为分生孢子 Note:%a:%the%lawn%in%PDA%culture%medium;%b:%conidiophore;%c:%conidia. 图 1% % 菌株 zz2 形态学特征 Fig.1% % The%morphology%characteristic%of%strain%zz2 2.2% % 病原菌分子鉴定采用改进 CTAB 法提取真菌总 DNA, 利用引物 ITS1/ITS4 扩增出了预期的真菌核糖体 ITS 片段 ( 图 2), 并经测序证实其为真菌核糖体 ITS 特异片段图 3 为 ITS 序列构建的与分离病原菌亲缘关系较近的几株弯孢菌属 (Curvlaria) 真菌的系统发育树 ( 菌种名称后为 GenBank 登录号 ), 以突脐孢属 (Exserohilum) 的玉米大斑病菌 (Exserohilum turcicum) 作为外群经 BLAST 显示, 其与弯孢菌属 (Curvlaria) 几株真菌序列相似性较高, 与 GenBank 中已报道的新月弯孢菌有性阶段异旋孢腔菌 (Cochliobolus lunata) 聚为一枝, 与弯孢菌属 (Curvlaria) 中的近缘弯孢 (Curvularia affinis) 薏苡生弯孢 (Curvularia coicicola) 车轴草弯孢 (Curvularia trifolii)% 亲缘关系较近结合形态特征进一步确认该菌为新月弯孢菌注 :M 为 DL2000% Marker;1 2 为新月弯孢菌菌株 Note:%M:%DL2000%Marker;%1,%2:%the%strains%of%Curvularia lunata 图 2% % 新月弯孢菌核糖体 ITS 扩增结果 Fig.2% % The%result%of%amplification%of%ribosomal ITS%for%Curvularia lunata

4 5 期周舒扬等 : 黑龙江省玉米弯孢菌叶斑病病原鉴定及其产细胞壁降解酶和漆酶活性分析 129 图 3% % 基于 ITS 序列的几株弯孢菌属 (Curvlaria) 真菌的系统发育树 Fig.3% % Phylogenetic%tree%based%on%the%nucleotide%sequences%of%ITS%of%some%fungus%of%Curvlaria 2.3% % 菌株活体外细胞壁降解酶及漆酶活性测定!"# $! 分别采用 DNS 比色法和 ABTS 方法对各种酶的活性进行了测定图 4 显示, 随培养天数的增加, PG 和 PMG 的活性在第 3 天有一个峰值, 且 PMG 的活性大于 PG, 同时在第 10 天 PG 有一个小峰值 ; 而 Cx 的活性较低, 变化幅度不大 %& % & ( 图 4% % PG PMG Cx 酶活变化与培养时间的关系 Fig.4% % The%relationship%of%the%enzyme%activities%of PG,%PMG,%Cx%and%culture%time% % %!! "! # $ 图 5% % 漆酶酶活与培养时间的关系 Fig.5% % The%relationship%of%the%laccase%activity%and%culture%time 对漆酶的测定结果显示, 新月弯孢菌生长到第 72%h 漆酶酶活达到最高峰 ( 图 5), 随后酶活逐渐下降总体来说, 各种酶可连续地产生, 首先是 PMG 酶活迅速增加, 其次是 PG, 再次是漆酶, 而 Cx 的变化较小漆酶 PG PMG 前期活性高, 后期活性低, 可能与培养后期培养基的酸度降低有关 3% % 结论与讨论植物受病原菌侵染后, 其体内的过氧化物酶 (Peroxidase) 多酚氧化酶 (Polyphenoloxidase) 苯丙氨酸解氨酶 (Phenylalnine%ammonialyase) 等氧化酶的活性增强, 其中过氧化物酶与多酚氧化酶能够促进木 [17] 质素和酚类氧化物的形成, 加强细胞壁的结构, 苯丙氨酸解氨酶还参与酚类化合物的形成以往研究有较多对 PG PMG 和 Cx 协同作用促进病菌侵入的 [18] 报道, 研究显示病菌通过产生细胞壁降解酶来软化分解寄主细胞壁, 从而促进侵入本研究首次发现新月弯孢菌产漆酶, 并能氧化酚类物质, 催化木质素的降解, 推断其可能也在病菌侵入过程中发挥了重要作用, 但其与细胞壁降解酶的协同作用还有待进一步研究证实漆酶是一种重要的多酚氧化酶, 由于在环保轻工等领域应用较多, 因而对产漆酶高产菌种菌株的需求也日趋增强, 以往的研究工作多集中于对白腐 [19] 菌中菌种进行筛选以期获得漆酶高产菌种本研究中显示新月弯孢菌可产漆酶, 且其酶活较高, 说明新月弯孢菌属乃至科中可能存在漆酶高产菌种, 从而丰富了漆酶的来源, 进一步对相关种属菌株进行

5 130 玉米科学 18 卷筛选诱变可能获得漆酶高产菌株在真菌学研究中, 传统的病原菌种类鉴定主要依靠病原菌菌落的培养特征分生孢子的形态以及子实体的种类和形态特征来鉴定, 但真菌种类多分布广形态特征复杂, 而且形态特征容易受到培养条件和其他因素影响而不稳定, 给鉴定工作带来困难真核生物的 DNA 碱基组成具有遗传稳定性, 受环境影响较小, 在其任何生长阶段利用少量 DNA 即可进行鉴定 ITS 是核糖体 DNA 中介于 18S 与 5.8S 之间的 ITS1,5.8S 及 5.8S 与 28S 之间的 ITS2 的内转录间隔区, 进化速率较快且片段长度适中 ( 高等真菌一般小于 1%000%bp), 加上协调进化, 使得该片段在基因组不同重复单元间十分一致, 常被应用于真菌分类 [20] 鉴定及系统分类学研究以往对玉米弯孢菌叶斑病病原鉴定主要是以形态学鉴定为基础, 本研究将形态学鉴定与分子生物学手段相结合, 其结果相对更准确目前研究显示, 对玉米弯孢菌叶斑病缺乏抗病品种, 在病害调查中发现, 一些品种发病较重, 但邻近地块却并未受病菌侵染, 其是否与品种抗性有关还有待于进一步研究此外,2008 年在长春地区未采集到病害样品, 但 2009 年长春地区却大面积发病, 说明在东北地区该病的危害可能日趋严重, 有必要加强抗病机制研究, 加强抗病品种选育, 进一步减轻病菌危害参考文献 : [1]%% 戴法超.% 玉米弯孢菌叶斑病研究 [J]%.% 植物病理学报,1998,26(2): %. [2]%% 戴法超.% 一种值得注意的新病害弯孢菌叶斑病 [J]%.% 植物病理学报,1997,25(3):330-%331%. [3]%% 梅丽艳, 郭梅, 李志勇, 等.% 玉米弯孢菌叶斑病病原菌与症状初步研究 [J]%.% 黑龙江农业科学,2003(3):5-6%. [4]%% 康振生, 黄丽丽, 等.% 禾谷镰刀菌侵染引致小麦穗组织细胞壁成分变化的细胞化学研究 [J]%.% 植物病理学报,2007,37(6): %. [5]%%Thurston%C%F.%The%structure%and%function%of%fungal%laccase[J].%Microbiology,%1994,%140:% [6]%% 方中达.% 植病研究方法 [M]%.% 北京 : 中国农业出版社,1998%. [7]%% 崔晋龙, 郭吉刚, 范黎.% 远志内生真菌分离鉴定及活性筛选 [J]%.% 微生物学通报,2007,34(5): %. [8]%% 肖敏, 张志宏.%PCR 检测草莓镶脉病毒的稳定性研究 [J]%.% 果树学报,2005,22(5): %. [9]%% 金冬雁, 黎孟枫, 侯云德.% 分子克隆实验指南 ( 第二版 )[M]%.% 北京 : 科学出版社,1996%. [10]%% 章群, 施苏华, 黄椰林, 等.% 金缕梅族 ITS 序列分析及其系统学意义 [J]%.% 中山大学学报 ( 自然科学版 ),2000,39(1):73-77%. [11]%% 冯晶, 陈捷, 等.% 玉米弯孢霉叶斑病菌产生的细胞壁降解酶的致病作用研究 [J]%.% 杂粮作物,2002,22(3): %. [12]%% 钱万英, 余嗣明.% 基础生化实验指导 [M]%.% 合肥 : 安徽大学出版社,1997%. [13]%%Swinborne%T%R,%Corden%M%E.%A%comparison%of%the%polygalacturonases% produced%in%vivo%and%in%vito%by%penicillium%expansum%t%hom[j].%j.%gen.% Microbiol,%1969,%55(1):% [14]%% 袁晓华, 杨中汉.% 植物生理生化实验 [M]%.% 北京 : 高等教育出版社,1982%. [15]%% Johannes% C,% Majcherczyk% A.% Laccase% activity% tests% and% laccase% inhibitors[j].%j.%biotechnol,%2000,%78(2):% [16]%% 魏景超.% 真菌鉴定手册 [M]%.% 上海 : 上海科学出版社,1979%. [17]%% 陈捷, 高洪敏, 朱有釭, 等.% 酚类物质和代谢对瓜果腐霉菌产生的细胞壁降解酶活性的影响 [J]%.% 植物病理学报,1996,26(2): %. [18]%% 陈捷, 高洪敏, 朱有釭, 等.% 黄瓜腐霉病菌苗期猝倒病致病机制研究 [J]%.% 植物病理学报,1996,26(1):57-63%. [19]%% 王佳玲, 余惠生, 付时雨, 等.% 白腐菌漆酶的研究进展 [J]%.% 微生物学通报,1998,25(4): %. [20]%% 郑雪松, 杨虹, 李道棠, 等.% 基因间隔序列 (ITS) 在细菌分类鉴定和种群分析中的应用 [J]%.% 应用与环境生物学报,2003,9(6): %. ( 责任编辑 : 朴红梅 )

兽医临床诊断学实验指导

兽医临床诊断学实验指导兽医临床诊断学实验指导河北科技师范学院动物科学系临床兽医学实验室 2009 年 2 月目录学生实验守则... 3 实习一动物的接近保定和基本检查法...4 实习二临床基本检查法及一般检查...10 实习三循环系统的临床检查...15 实习四

5 期 周 舒 扬 等 : 黑 龙 江 省 玉 米 弯 孢 菌 叶 斑 病 病 原 鉴 定 及 其 产 细 胞 壁 降 解 酶 和 漆 酶 活 性 分 析 127 菌 分 离 形 态 学 鉴 定 工 作 当 前 黑 龙 江 省 玉 米 主 栽 品 种 缺 乏 抗 病 品 种, 玉 米 弯 孢 菌 叶

5 期周舒扬等 : 黑龙江省玉米弯孢菌叶斑病病原鉴定及其产细胞壁降解酶和漆酶活性分析 127 菌分离形态学鉴定工作当前黑龙江省玉米主栽品种缺乏抗病品种, 玉米弯孢菌叶