2013,33(3) 王晶等 : 重组蛋白 NtA PACAP 在大肠杆菌中的表达纯化及活性测定 29 连, 并加入 His 标签, 将得到的重组序列片段转入表达载体 pet 3c 中, 转化 E.coliBL21(DE3),IPTG 诱导表达 ; 表达的蛋白经离子交换层析和镍离子亲和层析纯化, 之

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艮颜
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(3):28 33 重组蛋白 NtA PACAP 在大肠杆菌中的表达纯化及活性测定王晶吴陆生陈小佳董濠軻沈巍张敏仪洪岸 ( 暨南大学生物医药研究院生物工程药物广东省重点实验室基因工程药物国家工程研究中心广州 ) 摘要目的 : 通过构建 PACAP38 与 Agrin 的 N 端结构域 (NtA) 相连的重组基因的原核表达载体, 获得重组 NtA PACAP 蛋白, 并验证其生物学活性, 为未来的规模化制备奠定基础方法 : 将 PACAP38 与层粘连蛋白的受体蛋白 Agrin 的 N 端通过连接肽相连, 合成重组蛋白的基因片段, 并在此基因片段末端连上 6 个组氨酸标签密码子, 然后将此重组基因片段克隆至大肠杆菌表达载体 pet 3c 中, 转化 E.coliBL21(DE3), 获得重组工程菌并摸索发酵和纯化条件,IPTG 诱导表达后收集菌体破碎离心, 收集上清液, 经阴离子交换层析和 Ni NTA 树脂亲和层析两步纯化法获得目的蛋白 ; 通过 PC12 细胞饥饿损伤后修复实验模型来检测 NtA PACAP38 的生物学活性结果 : 成功表达并获得纯度 90% 以上的 NtA PACAP38 蛋白, 生物学活性实验证明 NtA PACAP38 具有促饥饿损伤后的 PC12 细胞增殖能力结论 : 获得的重组蛋白 NtA PACAP38 具有生物学活性, 表达系统和纯化工艺可以用于下一步的规模化制备关键词 PACAP 重组蛋白基因表达蛋白纯化中图分类号 Q782 垂体腺苷酸环化酶激活多肽 (pituitaryadenylate [1] cyclase activatingpolypeptide,pacap) 是 Miyata 等于 1989 年在研究下丘脑促垂体激素时发现的一种具有广泛生物学活性的多肽, 是促胰液素 / 高血糖素 / 血管活性肠肽 (vasoaetiveintestinalpeptide,vlp) 家族中的新成员, 是一种非常保守的多肽, 鸟类两栖类鱼类和被囊动物 PACAP 的氨基酸序列与哺乳类的同源性均很高 [2], 而迄今研究的所有哺乳动物的 PACAP 氨基酸序 [3] 列则都完全相同又有 Vaudry 等报道, 哺乳动物的 PACAP 广泛存在于中枢神经系统外周感觉神经节及支配呼吸系统消化系统内分泌系统等的神经纤维中, 在肝脏胰腺淋巴肾上腺呼吸道消化道睾丸卵巢等器官中也发现有 PACAP, 分布及其广泛近年来研究表明,PACAP 除了在肿瘤 [4] 免疫 [5] 繁殖 [6] 能 [7] 量平衡等方面具有重要作用, 还具有神经递质 / 神经收稿日期 : 修回日期 : 广州市科技计划项目 (2011J ) 通讯作者, 电子信箱 :tha@jnu.edu.cn 调质的作用, 神经保护和神经营养作用也非常明显 NtA, 即层粘连蛋白的受体蛋白凝集素 (Agrin) 的 N 端结构域 Agrin 是存在于细胞外基质的一种蛋白聚糖, 最早由 Godfrey 在富含突触的电鳐电器官细胞外基质中分离获得 [8] Agrin 信号通路具有某种介导轴突向其靶细胞生长功能, 尤其是在神经肌肉接头形成的过程中, 引导运动神经元轴突向其肌肉细胞生长以建立突触联系 [9] Agrin 对突触后结构的构建和诱导分化具有十分重要的作用它由运动神经元轴索合成和转运, 释放至突触基底层后集聚在近突触囊泡处, 活体中它主要存在于发育和成熟的突触基底层中它能够刺激培养肌管中突触蛋白如乙酞胆碱醋酶突触受体集聚蛋白 (rapsyn) 细胞骨架蛋白 (utrophin) 神经调节蛋白 (neuregulin) 等积聚 [10 11] [12] 2009 年,Sun 等报道了, 利用层粘连蛋白的结合蛋白 Agrin 的 N 端 (NtA) 连接 NGF 构建的融合蛋白 ( 称为 LBD NGF) 获得成功, 融合蛋白促神经再生修复的效果增强本研究将 PACAP38 通过连接肽与 Agrin 的 N 端相

2 2013,33(3) 王晶等 : 重组蛋白 NtA PACAP 在大肠杆菌中的表达纯化及活性测定 29 连, 并加入 His 标签, 将得到的重组序列片段转入表达载体 pet 3c 中, 转化 E.coliBL21(DE3),IPTG 诱导表达 ; 表达的蛋白经离子交换层析和镍离子亲和层析纯化, 之后对其生物活性进行分析, 为后续将 NtA PACAP 制备为外用神经修复药物铺垫基础 1 材料与方法 1.1 菌株与质粒大肠杆菌 E.coliDH5α 和 BL21(DE3) 表达载体 pet 3c 以及克隆载体 pmd18 T 由本所保存 1.2 实验细胞 PC12( 大鼠嗜铬瘤细胞 ) 购于中科院上海细胞库 1.3 主要试剂与仪器限制性内切酶质粒小提试剂盒和普通 DNA 产物回收试剂盒蛋白定量试剂盒均购自 TaKaRa 公司 ; Ligationhigh 连接酶购自 ToYoBo 公司 ;PCRMix 以及各种 DNAMarker 和蛋白 Marker 均购自广州东盛生物科技有限公司 ;QSepharoseFastFlow 和镍离子亲和层析柱购自美国 GE 公司, 其它试剂均为国产分析纯 1.4 NtA PACAP 基因的扩增克隆载体构建将 PACAP38 的 C 端与 Agrin 的 N 端 (NtA) 通过连接肽相连, 并加入 His 标签, 将改造后的衍生物命名为 NtA PACAP, 将该基因序列交由上海生工生物工程公司合成将 NtA PACAP 核苷酸序列与 pmd18 T 连接构建重组克隆载体 pmd18 T/NtA PACAP, 转化 E.coli DH5α, 加氨苄青霉素筛选挑取长出的单克隆菌落, 摇菌扩增, 抽质粒, 进行 PCR 验证和 EcoRI 和 Hind I 的双酶切验证, 同时送华大基因公司测序, 确定目标片段的存在和序列正确性 1.5 重组表达质粒 pet 3c/NtA PACAP 的构建将转化重组克隆载体 pmd18 T/NtA PACAP 的 E. ColiDH5α 扩增后, 提取重组质粒进行 XbaI 和 BamHI 双酶切酶切产物经 1% 低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后将目的片段用 DNA 切胶回收试剂盒进行切胶回收, 然后再与同样进行 XbaI 和 BamHI 双酶切的载体 pet 3c 连接成重组表达载体 pet 3c/NtA PACAP 将连接产物转化 E.ColiDH5α 并行氨苄青霉素 (0.1mg/ml) 筛选, 挑取阳性菌株, 摇菌抽质粒, 进行 PCR 验证和 EcoRI 和 Hind I 的双酶切验证, 确定重组载体构建成功 1.6 NtA PACAP 基因的诱导表达条件摸索将重组表达质粒 pet 3c/NtA PACAP 转化 E.Coli BL21(DE3), 挑取单菌落, 接种于 5ml 含有 0.1mg/ml 氨苄西林和 34μg/ml 氯霉素的 LB 液体培养基中, 37,180r/min 振荡培养 10~12h, 得到菌液诱导时间摸索将得到的菌液以 1 50 接种于 5ml 含同上抗生素的 LB 液体培养基中,37,180r/ min 摇菌 2h 后, 加入终浓度为 1mmol/L 的 IPTG,32 诱导表达至 5h 每小时取样一次, 每次 1ml, 得到的菌液 8000r/min 离心 1min 后去上清, 菌体加入 40μl 灭菌水及 10μlLoadingbufer(5 ), 混匀后煮沸 5min 进行 SDS PAGE 分析 IPTG 浓度摸索将重组菌 BL21(DE3)/pET 3c/NtA PACAP 分别用终浓度为 0.2mmol/L,0.4mmol/ L,0.6mmol/L,0.8mmol/L,1mmol/L 的 IPTG 进行诱导, 32,3h, 同上取样, 处理, 进行 SDS PAGE 分析诱导温度摸索将重组菌 BL21(DE3)/pET 3c/NtA PACA38 在终浓度为终浓度为 1mmol/L 的 IPTG 诱导下, 分别于 25,28,30,32,37 诱导 3h, 同上取样处理, 进行 SDS PAGE 分析 1.7 NtA PACAP 蛋白的分离纯化菌体的溶解将 16.0g 发酵菌体以 1 10 比例重悬于 160ml 缓冲液 (20mmol/LTris,pH8.0) 中, 以 65% 振幅超声破碎 8min 后,20000r/min,4, 离心 1h 收集上清液阴离子交换层析先以 1~5 倍层析柱体积的缓冲液 (20mmol/LTris,pH8.0) 平衡柱子, 然后以含不同盐浓度的洗脱缓冲液 (20mmol/LTris,0.05mol/L~ 1mol/LNaCl,pH8.0) 进行洗脱, 收集具有吸收峰的洗脱液选定以含盐浓度 0.05mol/L 的缓冲液进行洗脱, 得到洗脱液, 将其在亲和层析 Bindingbufer 中进行透析 Ni NTA 树脂亲和层析先以 5 倍 NTA 体积的 Bindingbufer 平衡 (50mmol/L NaH 2 PO 4,300mmol/L NaCl,pH 8.0, 流速 1ml/min), 然后用 5mmol/L~ 250mmol/L 浓度咪唑的 Elutionbufer 连续洗脱收集具有吸收峰的洗脱液, 进行 SDS PAGE 分析选定以含 5mmol/L 浓度咪唑的 Elutionbufer 过柱洗脱得到目的蛋白, 纯度在 90% 以上透析后冻干将得到的蛋白纯水透析 36h 达到脱盐, 最后用 Milipore 超滤管 (3K) 进行浓缩,4, 6000r/min,90min 然后将超滤浓缩液分装至小瓶冻干 1.8 NtA PACAP 蛋白活性检测采用 CCK8 法测定 NtA PACAP38 蛋白对饥饿损伤

30 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.32013 后的 PC12 细胞的增殖能力的影响以 8 10 3 个细胞每孔的量铺 96 孔板待细胞长至 50% ~60%, 换含 0.5% 的 FBS 的饥饿培养基培养 24h, 然后加入不同浓度的以 0.

1 pmd18 T /NtA PACAP 重组克隆载体的构建与鉴定将公司化学合成的 NtA PACAP 基因通过 PCR 扩增的方法获取 NtA PACAP 6his + 片段, 然后将此片段与 pmd18 T 载体连接, 获得重组克隆载体 pmd18 T/NtA PACAP, 并转化 E.

PACAP 重组子双酶切验证结果 Fig.2 DoubleEnzymedigestionasayof pmd18 T /NtA PACAP M:DNAMarker;1~3:DoubleenzymedigestionofNo.

3 30 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 后的 PC12 细胞的增殖能力的影响以个细胞每孔的量铺 96 孔板待细胞长至 50% ~60%, 换含 0.5% 的 FBS 的饥饿培养基培养 24h, 然后加入不同浓度的以 0.22μm 滤器过滤除菌的 NtA PACAP38 蛋白, 以不做任何加药处理的细胞孔作为对照 (CT), 培养 24h 后, 每孔加 CCK8 试剂 10μl, 培养 1h 后, 在酶标仪上以 450nm/630nm 双波长测定吸光度值, 以蛋白浓度为 X 轴, 促细胞增殖率为 Y 轴, 绘制曲线 2 结果 2.1 pmd18 T /NtA PACAP 重组克隆载体的构建与鉴定将公司化学合成的 NtA PACAP 基因通过 PCR 扩增的方法获取 NtA PACAP 6his + 片段, 然后将此片段与 pmd18 T 载体连接, 获得重组克隆载体 pmd18 T/NtA PACAP, 并转化 E.ColiDH5α, 对克隆菌落随机挑选 3 个, 标记为 1 号 2 号和 3 号, 进一步扩增抽提质粒, 进行 PCR 验证 ( 图 1) 及 EcoRI 和 Hind I 双酶切验证 ( 图 2), 从结果可知,3 号克隆为阳性结果, 最后对 3 号克隆进行测序处理, 测序后结果显示 3 号克隆与源序列均完全匹配, 未出现任何点突变, 表明重组载体构建成功图 2 pmd18 T /NtA PACAP 重组子双酶切验证结果 Fig.2 DoubleEnzymedigestionasayof pmd18 T /NtA PACAP M:DNAMarker;1~3:DoubleenzymedigestionofNo.1~3clones 并 PCR 验证, 验证得到正确目的 DNA 片段的重组菌 ( 图 3), 进一步测序结果为正确, 表明重组表达载体重组载体 pet 3c/AGN PACAP38 构建成功图 3 pet 3c/NtA PACAP 重组子 PCR 验证结果 Fig.3 IdentificationofpET 3c/NtA PACAP bypcrasay M:DNAMarker;1~4:Positiveclones;5:pET 3cemptyvector. 图 1 pmd18 T /NtA PACAP 重组子 PCR 验证结果 Fig.1 PCRasayofpMD18 T /NtA PACAP M:DNA Marker;1~3:PCR productionofno.1~3positive clones;4:pcrproductionofpmd18 Temptyvector 2.2 重组表达质粒 pet 3c/NtA PACAP 的构建与鉴定重组克隆载体 pmd18 T/NtA PACAP 经 XbaI 和 BamHI 双酶切后回收目的片段, 与经同样双酶切的载体 pet 3c 连接, 获得重组表达载体 pet 3c/NtA PACAP 转化 E.coliDH5α, 涂布氨苄青霉素抗性平板,12~18h 后, 随机挑选 4 个克隆扩增进行质粒抽提, 2.3 NtA PACAP 基因的表达诱导条件摸索诱导条件摸索实验表明 : 将 pet 3c/NtA PACAP 转化表达菌株 BL21(DE3), 获得重组表达菌 BL21 (DE3)/pET 3c/NtA PACAP 重组菌扩增至 OD 600 为 0.6 左右, 加入 1mmol/L IPTG 诱导, 不同诱导时间收集菌体, 结果表明诱导 4h 后,NtA PACAP 蛋白达到最高水平, 延长诱导时间不能更促进目的蛋白的表达见图 4, 黑色箭头表示目的蛋白重组菌经系列浓度 IPTG 诱导 4h 后, 经 SDS PAGE 电泳结果发现各组诱导的 NtA PACAP 蛋白表达并无明显的差别见图 5, 黑色箭头显示目的蛋白, 因此,IPTG 终浓度对蛋白的表达影响不大重组菌在含 1mmol/LIPTG 的 LB 培养基中分别于 28,30,32 诱导 3h, 发现在这三种温度条件下诱

2013,33(3) 王晶等 : 重组蛋白 NtA PACAP 在大肠杆菌中的表达纯化及活性测定 31 图 4 不同诱导时间作用下的表达结果 Fig.

6 Theexpresedresultsofdiferenttemperature M:Proteinmarker;1 3 5:TheexpresedresultsofNtA PACAP withoutiptg at28,30 and32 ;2 4 6:Theexpresed resultsofnta PACAPinducedbyIPTGat28,30 and32 图 5 不同 IPTG

8mmol/L, 1mmol/L respectively 导,NtA PACAP 蛋白表达量差别不大如图 6, 黑色箭头显示目的蛋白所以, 经综合考虑, 最后选用的表达条件是 :30, 1mmol/LIPTG 诱导 4h 以此条件获得了足够量的蛋白, 用于后续实验 2.

4 2013,33(3) 王晶等 : 重组蛋白 NtA PACAP 在大肠杆菌中的表达纯化及活性测定 31 图 4 不同诱导时间作用下的表达结果 Fig.4 Theexpresedresultsof diferentinductiontime M:ProteinMarker;1:Control;2~6:Theinducing timeis1h,2h,3h,4h,5hrespectively 图 6 不同温度作用下的表达结果 Fig.6 Theexpresedresultsofdiferenttemperature M:Proteinmarker;1 3 5:TheexpresedresultsofNtA PACAP withoutiptg at28,30 and32 ;2 4 6:Theexpresed resultsofnta PACAPinducedbyIPTGat28,30 and32 图 5 不同 IPTG 浓度作用下的表达结果 Fig.5 Theexpresedresultsofdiferent IPTG concentration M:ProteinMarker;1:Control;2~6:TheIPTGconcentrationis0. 2mmol/L,0.4mmol/L, 0.6mmol/L, 0.8mmol/L, 1mmol/L respectively 导,NtA PACAP 蛋白表达量差别不大如图 6, 黑色箭头显示目的蛋白所以, 经综合考虑, 最后选用的表达条件是 :30, 1mmol/LIPTG 诱导 4h 以此条件获得了足够量的蛋白, 用于后续实验 2.4 NtA PACAP 蛋白的纯化离心收集经诱导表达后得到的菌体, 经缓冲液溶解, 超声破碎离心, 取上清进行离子交换层析, 用不同盐浓度缓冲液洗脱, 取洗脱液进行 SDS PAGE 分析, 得到最适盐洗脱浓度结果显示如图 7, 黑色箭头显示目的蛋白按照最适盐浓度洗脱得到的蛋白结合缓冲液, 透析后, 过 10ml 体积 Ni NTA 层析柱, 用含不同浓度咪唑的 Elutionbufer 洗脱, 收集出现洗脱峰条带的洗脱液进行 SDS PAGE 分析, 确定目的条带的洗脱峰位置, 结果图 7 离子交换层析过程中对盐浓度的摸索 Fig.7 Theexplorationonthesaltconcentration inanionexchangechromatography M:ProteinMarker;1:Precipitation;2:Supernatant3:Theresult ofpenetrativeproteinwithoutbindingcolumn;4~9:theresultsof elutionbuferatsaltconcentrationis0.05mol/l,0.1mol/l,0. 2mol/L,0.4mol/L,0.8mol/Land2mol/Lrespectively 显示如图 8, 黑色箭头显示故根据上述摸索的层析条件, 确定先上阴离子交换柱, 以含 0.05mol/LNaCl 和 20mmol/LTris(pH8.0) 的缓冲液收集粗提物, 再上 Ni NTA 层析柱, 以含 5mmol/L 咪唑 50mmol/LNaH 2 PO 4 及 300mmol/LNaCl (ph8.0) 组成的缓冲液洗脱得到目的蛋白 2.5 NtA PACAP 蛋白活性检测根据 CCK8 法检测 NtA PACAP 对饥饿损伤后 PC12 细胞的促增殖实验结果 ( 图 9), 表明 :NtA PACAP 的浓度等 5 倍稀释, 在 1.6nmol/L~200nmol/L 情况下, 均有明显的促增殖作用, 最高与空白对照组比较提高了 35% 左右, 且在阳性对照组 (control 组,1.6nmol/L 野生型 PACAP) 的基础上提高了 11% 左右, 而高浓度反而降低了其活性率结果说明原核表达的 NtA PACAP 蛋白具有类似于 PACAP 的生物学活性功能, 能

32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.32013 图 8 Ni 柱亲和层析过程中 elutionbufer 中咪唑浓度的摸索 Fig.

4:Theresultsofelutionbuferat imidazoleconcentrationis5mmol/l;5~7:theresultsofelution buferat imidazole concentration is 50mmol/L, 120mmol/L, 250mmol/L 够促进 PC12 细胞增殖 [13] 将通过体内体外实验,

5 32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 图 8 Ni 柱亲和层析过程中 elutionbufer 中咪唑浓度的摸索 Fig.8 Theexplorationontheelutionbuferat imidazoleconcentrationinni NTA afinitychromatography M:ProteinMarker;1:Supernatant2:Theresultofpenetrative proteinwithoutbindingcolumn;3 4:Theresultsofelutionbuferat imidazoleconcentrationis5mmol/l;5~7:theresultsofelution buferat imidazole concentration is 50mmol/L, 120mmol/L, 250mmol/L 够促进 PC12 细胞增殖 [13] 将通过体内体外实验, 对该融合蛋白的促神经再生能力与非融合野生型 PACAP 进行比较分析, 并分析连上了 NtA 的融合蛋白是否能使 PACAP 更好地束缚于损伤部位神经组织上发挥作用大肠杆菌表达系统是开发最早, 技术最成熟的外源蛋白原核表达系统 pet 系列质粒因其克隆表达重组蛋白的高效性以及带有多种可选择的融合标签, 因此是目前应用最广泛的原核表达载体系统 [16] 本研究中 NtA PACAP 蛋白的获取采用表达载体为 pet 3c, 其在大肠杆菌中可以快速而有效地表达重组蛋白, 它利用 T7 启动子和终止子进行高效表达表达菌株为 E. colibl21(de3), 该宿主是以 T7RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主实验进行了重组蛋白的表达条件的优化, 包括诱导时间 IPTG 诱导浓度诱导温度的依次摸索实验, 确定了最佳的可溶性重组蛋白的表达条件, 即以 IPTG 终浓度为 0.8mmol/L 情况下 30 诱导 4h, 在此条件下培养的工程菌可以获得较高量的可溶性目的蛋白的表达采用此系统的优化表达条件后小规模表达 NtA PACAP 蛋白, 每升发酵液可获得 24mgNtA PACAP 蛋白通过摸索纯化条件, 我们利用离子交换层析和镍柱亲和层析两步纯化法, 得到纯度大于 90% 的有活性的蛋白相关发酵纯化工艺的确定和建立为此系统规模化表达 NtA PACAP 蛋白奠定了基础参考文献图 10 CCK8 法测定 NtA PACAP 对饥饿损伤后的 PC12 细胞的增殖的影响 ( x,±sn=5) 珔 3 讨论 Fig.10 EfectsofNtA PACAPonPC12 celsproliferation( x±s,n=5) 珔 PACAP 在神经系统发育中起着神经递质 / 调质和神经营养因子的双重作用, 可促进多种神经细胞的再生与分化 [14] [15] Deutsch 等报道,PACAP38 能诱导 PC12 细胞突起生长本研究表明,NtA 与 PACAP 融合后, 重组多肽具有 PACAP38 的促 PC12 细胞增殖的能力, 实验证明重组肽 NtA PACAP 虽然是 PACAP 的分子量 4 倍, 本研究加入连接肽有效的避免因空间位阻影响到 PACAP 的生物学活性, 因此我们可以进一步的对该融合蛋白进行研究开发在接下来的研究中, 我们 [1]MiyataA,ArimuraA,DahlRR,etal.Isolationofanovel38 residue hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclaseinpituitarycels.biochembiophysrescommum,1989, 164(1): [2] SherwoodN M,KruecklSL,McRoryJE.Theoriginand functionofthepituitaryadenylatecyclase activatingpolypeptide (PACAP)/glucagonsuperfamily.EndocrRev,2000,21(6): [3] VaudryD, Faluel MorelA, BourgaultS, etal. Pituitary adenylatecyclase activatingpolypeptideand itsreceptors:20 yearsafterthediscovery.pharmacolrev, (3): [4]LelievreV,SeksenyanA,NobutaH,etal.Disruptionofthe PACAPgenepromotesmeduloblastomainptelmutantmice.Dev Biol,2008,313(1): [5]BikW,Wolinska WitortE,PawlakJ,etal.PACAP38asa modulatorofimmuneandendocrineresponsesduringlps induced

6 2013,33(3) 王晶等 : 重组蛋白 NtA PACAP 在大肠杆菌中的表达纯化及活性测定 33 acuteinflammationinrats.jneuroimmunol,2006,177(1 2): 76 84; [6]ReglodiD,GyarmatiJ,ErtlT,etal.Alterationsofpituitary adenylatecyclase activatingpolypeptide likeimmunoreactivityin thehumanplasmaduringpregnancyandafterbirth.jendocrinol Invest,2010,33(7): [7]YiCX,SunN,AckermansM T,etal.Pituiataryadenylate cyclase activatingpolypeptidestimulatesglucoseproductionvia thehepaticsympatheticinnervationsinrats.diabetes,2010,59 (7): [8]LiM,MaderdrutJL,LertoraJJ,etal.Intravenousinfusionof pituitaryadenylatecyclase activatingpolypeptide(pacap)ina patientwithmultiplemyelomaandmyelomakidney:acasestudy. Peptides,2007,28(9): [9] Gautam M, Noakes P G, Moscoso L, etal. Defective neuromuscularaunaptogenesisin agrin deficientmutantmice. Cel,1996,85: [10]NitkinR M,RothschildTC.Agrin inducedreorgnanizationof extracelular matrix components on cultured myotubes: relationshiptoachraggregation.jcelbiol,1990,111: [11]CohenI,RimerM,LomoT,etal.Agrin inducedpostsynaptic likeapparatusin skeletalmuscle fibers in vivo. MolCel Neurosci,1997,9: [12]SunW,SunC,ZhaoH,etal.Improvementofsciaticnerve regenerationusinglaminin bindinghumanngf b.plosone4 (7):e6180.doi: /journal.pone [13] 董艳, 倪鑫, 鲍璇, 等. 垂体腺苷酸环化酶激活肽诱导 PC12 细胞突起生长的作用. 中国药理学通报.1999,15(5): DongY,NiX,BaoX,etal.Theefectofpituitaryadenylate cyclase activatingpeptideoninducingneuriteoutgrowthinpc12 cels.chinesepharmacologicalbuletin,1999,15(5): [14] FristadI,HeyeraasK J,KvinnslandIH.NeuropeptideY expresioninthetrigeminalganglionandmandibulardivisionof thetrigeminalnerveafterinferioralveolarnerveaxotomyinyoung rats.expneurol,1996,142: [15]DeutschP,SunY.The38 aminoacidformofpituitaryadenylate cyclaseactivatingpolypeptidestimulatesdualsignalingcascades inpc12celsandpromotesneuriteoutgrowth.jbiolchem, 1992;267:5108~13. [16]RobertM,KeithY.ThepETsystem:Yourchoiceforexpresion. AdwancedProductsandProtocolsforMolecularBiologyResearch, 1994,1(1):3 36. ExpresionofFusionProteinNtA PACAPinE.coli anditspurificationandbiologicalanalysis WANGJing WULu sheng CHENXiao jia DONGHao jun SHENWei ZHANGMing yi HONGAn (BiomedicineInstitute&CelBiologyDepartmentofJinanUniversity,NationalEngineeringResearchCenterofGeneticMedicine, GuangdongProvincial,KeyLaboratoryofBioengineeringMedicine,Guangzhou ,China) Abstract Objective:ToobtainafusionproteinNtA PACAP,whichPACAP38linkswiththeN terminal domainofagrin(nta),inarecombinantprokaryoticsystem andtoanalysisitsbioactivity.methods:the nucleotidesequenceencodingfusionnta PACAPproteinweredesignedandsynthesizedaccordingE.colicodon bias,andhis tagwasaddedtothec terminal,thenthesequenceclonedintovectorpet 3c.Andthis recombinantplasmidsweretransformedtoe.colibl21(de3)forexpresionbyiptg induction.thetargeted proteinwasgotbytwo steppurificationmethods,whichanionexchangechromatographyandthenni NTA afinitychromatography.finalyitsbioactivitywasevaluatedbythecelinjuryrepairexperimentsinvitro. Results:NtA PACAPproteinisobtainedsuccesfuly.BioactivityasayresultshowsthatNtA PACAPcould promotepc12celsproliferationafterstarvationinjury.conclusion:thefusionnta PACAP38proteinisworthof developingtoacandidatedrug. Keywords PACAP Recombinantprotein Geneexpresion Proteinpurification

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌