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1 第 30 卷第 4 期 2011 年 8 月 华中农业大学学报 JuaHuazhgAguuaUvy V.30 N.4 Au2011,393~397 水稻纤维素合酶多克隆抗体的制备和鉴定 张苗苗 陶章生 陈婷婷 夏涛 2,3 彭良才,4 丰胜求 2,4 1. 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 武汉 ;2. 华中农业大学生物质与生物能源研究中心, 武汉 ; 3. 华中农业大学生命科学技术学院, 武汉 ;4. 华中农业大学植物科学技术学院, 武汉 摘要 纤维素合酶是参与纤维素 β-1,4- 葡聚糖链延伸的主要催化亚基, 为进一步研究水稻中纤维素合酶的 作用机理, 采用 DNA 重组技术, 将纤维素合酶基因 CA1 CA2 CA3 克隆入表达载体 pgex-4t-3, 构建重组质粒在大肠杆菌 JM109 中, 经异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导后在原核细胞中成功表达了 3 种纤维素合酶的融合蛋白, 通过谷胱甘肽巯基转移酶 (GST) 纯化系统获得融合蛋白, 以此作为抗原免疫家兔, 制备出效价高 特异性强的多克隆抗体 关键词 水稻 ; 纤维素合酶 ; 融合蛋白 ; 多克隆抗体 中图分类号 Q754 文献标识码 A 文章编号 (2011) 纤维素合酶 (uyha,ca) 是参与 纤维素 β-1,4- 葡聚糖链延伸的主要催化亚基 1996 [1] 年,Pa 等通过序列的同源性比对在棉花中发现 了第 1 个纤维素合酶基因纤维素合酶基因的大小 范围为 3.5~5.5kb, 有 9~13 个内含子, 基因的差 异主要在于内含子的多少 [2] 所有纤维素合酶都有 相似的结构,CESA 蛋白的氨基端有 1 个锌指结构 的氨基酸结构域, 能促进蛋白质 - 蛋白质相互作用, 在 CESA 蛋白聚合中发挥作用 [3] ; 锌指结构域和 N 端跨膜结构域之间有 1 个蛋白序列的高变区 Ⅰ, 在 2 个跨膜结构域之间是酶的中央结构域, 其间有 1 个蛋白序列高变区 Ⅱ, 高变区 Ⅱ 两边各有 1 个保守 基序,DxD 和 QxxRW, 它们的功能主要与底物的结 合和催化相关 [4] 纤维素合酶通常以复合体的形式存在于细胞膜 上 1 个纤维素合酶复合体可以合成由 36 条糖链 组成的微纤丝 [5-6] 遗传学的研究表明, 每个花环至 少由 3 种不同的 CESA 蛋白组成, 在拟南芥中,CE- SA4 CESA7 CESA8 为次生壁沉积所需 [7-9],CE- SA1 CESA3 CESA6 为初生壁的生物合成所 需 [9-10] 在水稻中已证明 CESA4 CESA7 CESA9 为次生壁的生物合成所需 [11] [12] [13] A 等和 Tay 等分别发现了温度 敏感型突变体 (w1) 和不规则木质部突变体 (x3), 通过对突变基因的研究, 证明了拟南芥纤维 素合酶参与纤维素的合成目前, 纤维素合酶的作 用机理仍不清楚本文通过生物信息学分析, 选取 与其他已知蛋白同源性较低的片段, 采用原核表达 的方法表达水稻 CESA1 CESA2 和 CESA3 融合蛋 白, 免疫新西兰大白兔, 制备出纤维素合酶的多克隆 抗体, 为研究水稻纤维素合酶的作用机制提供参考 1 材料与方法 1.1 试验材料 1) 质粒与宿主菌大肠杆菌 DH5α 和 JM109 菌株 原核表达载体 pgex-4t-3 由笔者所在实验室 保存 2) 主要试剂逆转录试剂盒 (RT K) Taq 酶 高保真 DNA 聚合酶 KODpu 限制性内切酶 BamHⅠ ERⅠ SaⅠ XhⅠ 购自 TOYOBO 公 司 ;T4DNA 连接酶和 DNA 分子质量 Mak 购自 TaKaRa( 大连 ) 公司 ; 硝酸纤维素膜 (u mmba,nc 膜 ) 购自 Pa 公司 ; 亲和层析 填料 Guahpha4aw 蛋白分子质 量 Mak 购自 Gp 公司 ; 预染蛋白 Mak 购自 ma 公司 ; 还原型谷胱甘肽 (dudlguah) Mp 缓冲液购自 Bhap 公司 ; 弗式完全佐剂 (CA) 弗式不完全佐剂 (IA) 苯甲基 收稿日期 : 基金项目 : 国家转基因生物新品种培育科技重大专项 (2009ZX B) 张苗苗, 硕士研究生. 研究方向 : 生物化学与分子生物学.E-ma:zmm @yah.m. 通讯作者 : 丰胜求, 博士, 副教授. 研究方向 : 植物细胞壁合成相关基因的功能研究.E-ma:gq@ma.hzau.du.

2 394 华中农业大学学报第 30 卷 磺酰氟化物 (PMS) 蛋白酶抑制剂 (ppa A upp) 琼脂糖蛋白 A (pa-aga) 洋 地黄皂苷 (dg) 和凝血酶购自 Sgma 公司 ; HRP 标记的羊抗兔 IgG 购自武汉三鹰生物技术有 限公司 3) 试验动物成年雄性新西兰大白兔购自华中 农业大学动物实验中心 1.2 试验方法 1) 原核融合表达载体的构建根据 NCBI 提供 的序列, 首先进行序列比对, 然后进行跨膜区的预测 (hp://aamm.bak.u-k.d/), 在非 跨膜区选择同源性低的区段 3 种抗原所选择的区 段在 DNA 上的位置分别为 :OCA1 位于第 366~801 个碱基的位置 ;OCA2 位于第 276~780 个碱基的位置 ;OCA3 位于第 345~804 个碱基的 位置 3 种抗原区段之间的同源性为 12% 利用 Pm5 设计引物, 上下游引物分别引入酶切位点 及保护碱基,OCA1 引物上下游的酶切位点分别 为 BamHⅠ 和 SaⅠ,OCA2 引物上下游的酶切 位点分别为 ERⅠ 和 SaⅠ,OCA3 引物上下游 酶切位点分别为 ERⅠ 和 XhⅠ 引物合成由奥 科生物技术有限公司完成 OCA1 上游引物 :5 - AAAGGATCCAAAGGTCCAGAGTGGCAGAT- AC-3, 下游引物 :5 -AAAGTCGACCTGGTTT- GAAGGGATAGGCA-3 ;OCA2 上游引物 :5 - AAAGAATTCAGGCAACCAGGACCATAAGC- 3, 下游引物 : 5 -AAAGTCGACAATTG- GCACTTTTCTCGATAGA-3 ;OCA3 上游引 物 : 5 -AAAGAATTCAAGGGACAGGAAT- GACTCGC-3, 下游引物 : 5 -AAACTC- GAGGACTTTTCTGGACAATGGCTG-3, 划线部 分为酶切位点 将 PCR 扩增产物双酶切回收后连接到 pgex- 4T-3 的表达载体上, 经酶切鉴定后对所获得的阳性 克隆进行测序验证结果表明 3 个重组质粒读码框 正确, 均无碱基突变, 可用于融合蛋白的表达 2) 重组蛋白的诱导表达将重组质粒转化大肠 杆菌 JM109 的感受态细胞, 挑取双酶切为阳性的单 菌落接种于 5mL 的 LB 培养基中活化过夜, 次日以 体积比 1 50 的比例将活化培养物转入 10 ml 的 LB 培养基中扩大培养, 菌液的 D 值达到 0.6 后, 取 出 3mL 作为对照, 其余加入 IPTG 至终浓度为 0.5 mm/l, 诱导 3h 后离心收集菌体细胞并超声波破 碎, 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 检测重组蛋 白的表达量, 并分析蛋白的可溶性 3)GST 亲和层析分离纯化重组蛋白大量诱 导重组蛋白, 超声波破碎收集上清上清加入到 GST 纯化柱中,PBSbu 洗脱出去非特异结合的 杂蛋白, 然后加入 10mm/L 的还原性谷胱甘肽洗 脱目的蛋白分光光度计测量蛋白浓度, 保存读数 大于 200 的样品蛋白样品经 PBSbu 透析, PEG20000 浓缩后, 放入冷冻干燥机中冷冻抽干 4) 兔抗血清的制备将纯化好的蛋白与 CA 充分乳化至终质量浓度为 1mg/mL, 作为免疫原进 行初次免疫, 按每只兔子 0.5 ml 的剂量进行背部 脊柱两侧皮下注射间隔 2 周,IA 与纯化蛋白充 分乳化作为免疫原进行加强免疫, 剂量为初次免疫 的 50%, 共加强 2 次后进行心脏取血 [14] 分离血 清, 加入叠氮化钠,-80 冷冻保存 5) 抗血清效价检测确定抗原与抗血清的最佳 工作浓度包被液稀释抗原至 10μg/mL, 取 1 ml 加入酶标板的反应孔中, 抗血清稀释 倍, 取 1 ml 加入反应孔中, 加入新鲜 稀释的酶标二抗,37 孵育 1h, 然后加入底物显色 液 ( 四甲基联苯胺,TMB) 反应 20 m,2 m/l 硫 酸终止反应 450m 的波长下测其 D 值 6) 抗血清的纯化兔血清稀释 1 倍后加入层析 柱内 ( 柱床为琼脂糖蛋白 A),TBS 洗脱杂蛋白, 洗 脱缓冲液 (50 mm/l Gy-HC,pH2.7) 洗脱目的 蛋白, 以中和缓冲液 (1m/L T-HC,pH 8.0, 1.5 m/l NaC,1mm/L EDTA,0.5% 叠氮化 钠 ) 中和目的蛋白, 测定蛋白浓度后分装保存 7)Wṉbg 检测抗原与抗血清的特异 性凝血酶处理后切除 GST 的抗原进行 SDS- PAGE, 控制每个泳道约 5μg 总蛋白, 通过电泳仪 转至 NC 膜上, 利用制备的免疫血清为一抗 (1 500), 用辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗 兔二抗进行 Wṉbg 检测 8) 水稻原生质膜提取水稻孕穗期茎秆 -80 保存, 液氮中磨碎, 加入 4 预冷的提取缓 冲溶液 (50 mm/l Mp/NaOH 缓冲液 ph7.5; 0.25m/L 蔗糖,1mm/LPMS,1μm/LppaA,1μm/Lupp), 充分混匀 ; 冰浴超声 波处理 20m;4,12000/mm 离心 10 m; 取 上清 ;4,150000/mm 离心 50m; 沉淀加提 取缓冲溶液 ( 含 0.05% dg) 重悬匀浆 ;4,

3 第4期 张苗苗 等:水稻纤维素合酶多克隆抗体的制备和鉴定 395 /m /mm 离 心 30 的 DNA 片 段OC 60 溶解 30 m ; 4, A1 OC A2 OC A3 的 /Sa /Sa m ;上清加 5 上样缓冲液,沸水浴加热 10 m PCR 扩 增 产 物 分 别 经 BamHⅠ Ⅰ E RⅠ Ⅰ /XhⅠ双酶切,片段纯化回收后克隆到 pgex9) OCESA抗体特异性分析蛋白样品 SDS - E RⅠ PAGE 后,恒流电转印蛋 白 至 NC 膜( 4, 70V, 60 4T3 的 表 达 载 体 上,得 到 重 组 质 粒 pgexoc ma, 12h)用 5% 的 脱 脂 牛 奶 封 闭 1h;洗 膜 3 次 A,对 双 酶 切 鉴 定 片 段 大 小 正 确 的 阳 性 克 隆 进 行 ( 3 m /次);加 入 OCESA一 抗(稀 释 度 1/300)室 DNA 测序,结 果 表 明 pgex4t3载体中插入的基 /次);加入 HRP 羊抗兔 温孵育 1h;洗膜 3 次( 5 m 二抗(稀释度 1/1000)室温孵 1h;洗膜 3 次, TBS 洗 /次);二氨基联苯胺( 膜 1 次( 5m DAB)显色 2 结果与分析 2.1 原核表达载体的构建及鉴定 提取分 蘖 期 水 稻 茎 杆 的 总 RNA,经 RT-PCR,经胶回收 得到 DNA,高保真酶扩增目的片段(图 1) 因片段序列及读码框完全正确(图 2) 2.2 重组 OCESA 的诱导表达 将 pgexoc A 重 组 载 体 转 化 大 肠 杆 菌 JM109 菌株,在 37, 0. 5 mm IPTG 诱导 3h,蛋 白量显著 增 加 (图 3) 超 声 波 破 碎 后 离 心,分 别 将 全菌 上清 沉淀进行 SDS -PAGE(图 4)发现 3 种 试 剂 盒 纯 化 回 收 得 到O C A1 OC A2 OC A3 M:蛋 白 质 标 记 P ma k ;1,3,5,7:细 胞 混 合 物 (-IPTG)Thwh p du dbyiptg; 2, 4, 6, 8: 细胞混合物(+ IPTG)Thwh p du dbyiptg; 显示的是融 合 蛋 白 GST-OCESA hwd mb a GST-OCESAp. M: DNA2000p uma k. 图 1 RT -PCR 扩增产物电泳图谱 图 3 GST -OCESA 诱导表达的 SDS -PAGE 检测 3 I d a GST -OCESAp ka y xp bysds -PAGE 1 E ph hp du amp dbyrt -PCR M: 2000p udna ma k ;CK:空载体 pgex4t3pgex4t- 3v ;1, 2:经 BamHⅠ 和 Sa Ⅰ 双酶切的表达载体 pgexoc- A1pGEXOC A1d d w h BamHⅠadSa Ⅰ ;3, 4:经 g E RⅠ 和 Sa Ⅰ 双 酶 切 的 表 达 载 体 pgexoc A2pGEXOC - A2d dw he RⅠadSa Ⅰ ;5, 6:经 E RⅠ 和 XhⅠ 双 g 酶 切 的 表 达 载 体 pgexoc A3 pgexoc A3 d d w h g E RⅠadXhⅠ. 图 2 重组质粒 pgex -OCA 双酶切鉴定 2 R aa hpgex -OCA p am d y M:蛋白质标 记 P ma k ;CK:空 载 体 (-IPTG)pGEX- OC A du dbyiptg;1, 3, 5:沉 淀 (+IPTG)I up du dbyiptg;2, 4, 6:上清(+IPTG)S g up g du dbyiptg. 图 4 GST -OCESA 可溶性 SDS -PAGE 检测 4 SDS -PAGEd y GST -OCESA d a GST -OCESA ka xp bysds -PAGE p y

4 396 第 30 卷 华 中 农 业 大 学 学 报 pgex-ocesa 均在上清中表达,为可溶性蛋白 2.3 重组蛋白的纯化 重组蛋白IPTG 诱 导 后 离 心 收 集 菌 体,超 声 波 明 OCESA1 OCESA3 抗 体 都 是 特 异 的,而 OCESA2 的抗体出现了非特异性条带 破碎后收集上清经亲和层析柱纯化后得到纯度较 高的重组蛋白(图 5) M:蛋白质标记 P ma k ; 显 示 的 是 OCESA hwdocesa. 图 7 抗体特异性分析 M:蛋白质标记 P ma k ;1, 2, 3:纯 化 产 物 Pu a ; 7 Sp aa OCESAa bd y 显示的是 OCESA hwdocesa. 图 5 亲和层析纯化 GST -OCESA 蛋白 5 Pu a GST -OCESA bya ma g aphy yh 2.4 OCESA 抗体的制备与效价检测 用纯 化 的 重 组 蛋 白 免 疫 新 西 兰 大 白 兔,获 得 兔 抗血清抗血清进行 ELI SA 效价检测,底物为四甲 基联苯胺( TMB),在 分 光 光 度 计 在 波 长 450m 下 测定 D 值计算样本 D 值与对照 D 值的 比 值比 3 讨 论 为了制备高质量的免疫血清,在抗原引物设计 免疫动物选 择 佐 剂 使 用 免 疫 剂 量 等 方 面 进 行 控 制首先通过植物膜蛋白质数据库对纤维素合酶进 行分析,选取蛋白的非跨膜区,然后通过 B a 比对 选择基因的特异区段,综合 2 个区段设计引物,保证 了抗原的特异性和高效表达免疫动物选择新西兰 值大 于 2. 1 为 阳 性 试 验 结 果 表 明 OCESA1, 家兔,其对抗原的 反 应 性 好 产 生 的 抗 体 亲 和 力 高 OCESA2, OCESA3 抗体的效 价 分 别 为 价格低廉 易于采血进行免疫注射时,加入了弗式 佐剂,可以改变抗原 的 物 理 状 态 而 延 长 其 在 体 内 的 2.5 OCESA 抗体的 W-bg 分析 滞留时间,使抗原缓慢释放,同时非特异性的促进局 用凝血酶 切 割 重 组 GST-OCESA,分 离 GST 部吞噬细胞反应来增强动物的免疫效果对于抗原 和 OCESA, 12%SDS -PAGE,控 制 每 个 泳 道 约 的免疫剂 量,在 首 次 免 疫 时 选 择1 mg/ml,加 强 免 5μg总蛋白;转到 NC 膜上;W b g(图 6) 疫时剂量减半,因 为 在 一 定 范 围 内 ( 0. 5~2. 0 mg/ 结果表 明: OCESA1 OCESA2 OCESA3 可 与 抗 ) ml 剂量越大产 生 的 免 疫 应 答 越 强,一 方 面 引 起 机 原特异结合 体强烈的特异性免 疫 应 答,另 外 还 可 以 避 免 机 体 产 生免疫抑制 选用 pgex4t3 作为 载 体 构 建 了 3 个 纤 维 素 合酶的重组 质 粒,在 大 肠 杆 菌 JM109 中 获 得 表 达, 并且表达产物以可溶形式存在以亲和层析柱纯化 图 6 抗体特异性检测 Sp a bd yd OCESA 抗体特异性检测 提取水稻孕 穗 期 茎 秆 的 原 生 质 膜,加 5 上 样 缓冲液,沸 水 浴 加 热 10 m 10% SDS -PAGE,转 到聚偏氟乙烯膜上,W b g (图 7)结果表 - 后 获 得 的 蛋 白 为 免 疫 原 制 备 了 融 合 抗 体 经 ELISA 检测融合抗体的效价为大于 ,可 以用于试 验 研 究 W g 表 明 融 合 抗 体 -b 可特异性识别水 稻 中 的 纤 维 素 合 酶 至 此,我 们 制 备了 3 种纤维素合 酶 的 抗 体,这 为 进 一 步 研 究 纤 维 素的合成机制奠定了基础

5 第 4 期张苗苗等 : 水稻纤维素合酶多克隆抗体的制备和鉴定 397 参考文献 [1] PEARJR,KAWAGOE Y,SCHRECKENGOST W E,a. HghpaahmghbaaAgṉ dghaayuuyha[j].pna AadSUSA,1996,93: [2] RICHMOND T.Hghpauyha[J].Gm B,2000,1(4):vw [3] KUREKI,KAWAGOEY,JACOB W D,a.Dmza buyhaaayuuvaxdahzḇdgdma[j].p NaAadS USA,2002,99: [4] RICHMONDTA,SOMERVILLECR.Thuyha upamy[j].paphy,2000,124: [5] LEROUXELO,CAVALIERD M,LIEPMAN A H,a.Byhpawapyahad:ampxp [J].CuOpPaBgy,2006,9(6): [6] BOWLINGAJ,BROWNR MJR.Thypamdma hu-yhzg mpx vaua pa[j]. P-pama,2008,233: [7] TAYLORNG,GARDINERJC,WHITEMANR,a.CuyhhAabdpdaywa[J].Cu-,2004,11: [8] SOMERVILLEC R.Cuyhhghpa[J]. AuRvCDvB,2006,22: [9] MAREK M,SETH D,STAAN P.Cuyh:a mpxmpx[j].pabgy,2008,11: [10]ROBERTSA W,ROBERTSE,DELMER DP.Cuyṉ ha(cesa)ghgagamaumadaum [J].EukayC,2002,1: [11]TANAKA K,MURATA K,YAMAZAKIM,a.Thduyhaaayugqud uyhhday wa[j].paphy, 2003,133: [12]ARIOLIT,PENGL,BETZNER AS,a.Muaaay yh Aabdp[J].S,1998, 279: [13]TAYLORN G,SCHEIBLE W R,CUTLERS,a.Thguaxym3uAabdpdauyha quddaywayh[j].pac,1999, 11(5): [14] 田斌, 张昌毅, 佘群新, 等. 泉古菌 Suadu PC- NA1 的原核表达及其多克隆抗体的制备 [J]. 华中农业大学学报,2010,29(1): Ppaaaddapyaabd uyha ZHANG Ma-ma TAOZhag-hg CHEN Tgṯg XIA Ta 2,3 PENGLag-a,4 ENGShg-qu 2,4 1.NaaKyLabayCpGImpvm,HuazhgAguuaUvy, Wuha430070,Cha; 2.BmaadBgyRahC,HuazhgAguuaUvy,Wuha430070,Cha; 3.CgLSadThgy,HuazhgAguuaUvy,Wuha430070,Cha; 4.CgPaSadThgy,HuazhgAguuaUvy, Wuha430070,Cha Aba Cuyhaaaaayuhuyhampx.T udyuca g,habdwppad.,mbapamdw udwhghuyhaghxpvpgex-4t-3.thmbapamdwhamde.jm109adhmbapwbad. Thupwpud wh GSTayhmagaphyym adjdabb gagpyaabd.ay,aabdwddby Wbgaaywh pbadadhghav. Kywd Oyzaava;uyha;up;pyaabdy ( 责任编辑 : 陆文昌 )

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