% 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 毒防御 造血过程 器官形成 细胞增殖和凋亡 脂肪代谢 肿瘤发生等 也有一些研究报道指 / 在调节植物对环境胁迫如干旱 盐害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用 ' 目前在拟 与硫同化途径中的第 个关键酶 /+

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1 南京农业大学学报 $! "!" # 张芸 李会 车丽玲 等 - " 基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化 - 南京农业大学学报 $ 拟南芥 / % 基因的克隆和过表达载体构建 及其在油菜中的转化 张芸 李会 车丽玲 黄思齐 邱承祥 杨志敏 南京农业大学生命科学学院 江苏南京 $ 摘要 3 # (@ / 是一类内源性长度约为 5, 个核苷酸 在基因表达 生长发育 / 研究表明 / 的靶基因分别为 /+ 硫酸化酶和硫转运体 6 1+@ 两者在硫同化及转运中起着重要的作用 的功能 本研究利用 2@ " 前体基因 并与 2/3& /, 载体连接 " 前体基因的过量表达载体 通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选, 号中 目前已获得了转基因植株 " 前体 /+ 硫酸化酶 硫转运体 6 1+@ 过表达载体 转基因中图分类号 0' 文献标志码 / 文章编号 2# ' 1 "/ %' /!" $ %!! ' " 1! $ % $ /$ # $ "% / ) /.6? 0 2! ) ) 9/. 2(!)!( 1!6#! #! )/) #! : )$ 2 $! 3 # (@ /!! "()! (, #!( "! )! / " : ( (! )!!!! ( "!! (! #! #:#! "! (!! / "(<!)!! " #!(! / : ( # ( #! : ( (!! ( " (# ( " )!!! ( ( /+ :!/ 6 "! (! 6 1+@- ( "! (! (!! # ( ( " (# " )!!< # (!" ( #!! < 2@ ( # "!!" (!#(! ( " )!(! 2/3& /,!!!(! ( " <! (" #!" (!!: # 2 3 3!"!" ( #-+! )! # "!! (!"- " /+ :!/ 6! (! 6 1+@ (!!! (!#( )! # 3 # (@ / 是一类内生 非编码蛋白长度约为 5, / 在生物体内起着基因转录后的调控作用 / 作用机制研究显示 / / " #!"! # )#(! 的复合物结合 / 结合 / 配对结合 / 的降解 / / /, / 的 F 端非翻译区 F +@ 结合阻止其转录后的翻译 / / 具有高度的碱基互补性 / / 的作用方式对靶基因进行降解 % 相反 在动物细胞中 / / / / 的 F 端非翻译区 F +@ 结合阻止转录后的翻译 从而起到负调节其靶基因的表达作用 / 参与生命过程中一系列的重要进程 包括生长发育 信号转导 病 收稿日期 $, 基金项目 国家自然科学基金项目 %,$ 江苏省自然科学基金项目 & % 作者简介 张芸 硕士研究生 通讯作者 杨志敏 教授 研究方向为植物逆境分子生物学 : )*!" #

2 % 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 毒防御 造血过程 器官形成 细胞增殖和凋亡 脂肪代谢 肿瘤发生等 也有一些研究报道指 / 在调节植物对环境胁迫如干旱 盐害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用 ' 目前在拟 与硫同化途径中的第 个关键酶 /+ / * ( * ) * 4 存在互补序列 $ 经初步 (! 杂交分析显示 被诱导表达 而 * ( 的积累量明显减少 在缺硫条件下参与对其靶基因 * ( 的负调控 此外 F@/2 结果显示 编码拟南芥的一个低亲和硫转运体! (! /6+%' / 的 一个靶基因 在植物硫同化和转运途径中可能起到了非常重要的调节作用 油菜作为一种重要的油料和经济作物 在硫的吸收 转运及代谢中同样需要硫转运体和 /+ 硫酸 化酶的协助 目前由于油菜的核酸序列库相对较小 前体序列 而油菜与拟南芥同属于十字花科 亲缘关系比较近 在各物种间序列保 守 对油菜中! (! 和 /+ 硫酸化酶的作用机制 提高油菜 在缺硫等逆境中的适应性 本研究采用 2@ " 前体基因 并构建了过 表达载体 " 前体基因导入甘蓝型油菜特选, 号中 目前已获得 了转基因植株 () 材料与方法 (*() 材料 (*(*() 植物材料 ) 供试材料为拟南芥哥伦比亚生态型 甘蓝型油菜品种特选, 号 (*(*+) 质粒及菌株 ) 大肠杆菌菌种 农杆菌菌种 / 表达载体质粒 2/3& /, (*(*) 酶和化学试剂 ) 酶 " + 限制性内切酶 和 3 $ +E!#( 3 =! 1 均购自 公司 +, / 连接酶购自 (!) 公司 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自博飞生物公司 (*+) 方法 (*+*() 拟南芥 93 的提取 ) 用 2+/& 法从幼嫩的拟南芥叶片中提取 / (*+*+) 拟南芥 / % 前体基因的克隆 ) " 前体基因序列设计引物 " 过表达载体的构建 在上游引物的 F 端加入了 酶切位点 下游引物 F 端加入了 酶 切位点 以拟南芥 / 为模板 2@ 扩增,%% " 前体基因 引物序列如下 上游引物 6 F /./+2+/+.+2/222/+22+/ / F 下游引物 6 F /2+/.+2//22+2./ / /22+.+/ F 2@ 反应体系 A 缓冲液 含 3) 7 1 ( 1 " + 1 ( 1 引物各 1 # / 第 链模板 1 酶 1 1 "" ;' 1 扩增条件如下 $,, $, ' 个循环 (*+*)72 产物的回收与测序 ) 2@ 产物经琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后与克隆载体 3 $ + E!#( 连接 转化 感受态细胞 在含有 ( ( : () #( "! +. ) 和 / 的 1& 平板上挑选单克隆 单克隆经鉴定后送金思特生物公司测序 (*+*) 拟南芥 / % 前体基因过表达载体构建 ) 用限制性内切酶 和 对 2/3& /, " 分别进行双酶切 酶切产物进行凝胶电泳后回收 将回收产物用 +, / 连接酶连接 % 过夜 得到过表达载体 命名为 2/3& " 对重组子进行 2@ 和序列测定 (*+* ) 根癌农杆菌介导法转化油菜 ) 无菌苗培养 选取籽粒饱满的油菜种子用 4 乙醇表面消毒 再用 ) 1 )2 消毒 无菌水冲洗 次 接种于种子萌发培养基 36 上 置 光照培 养箱中 每天光照 预培养 待无菌苗长至第 天, 分别切取子叶和下胚轴为转化的外植体 置于预培养基 36 7 ) 1 % &/7 ) 1, % 中 黑暗预培养 " 农杆菌对外植体的侵染与共培养 " 过表达载体的农杆菌接种于 1&7 ) 7 ) 1 液体培养基中 1 ' 振荡培养过夜 再转入, 1 新鲜的上述液体培养 基中振荡培养 5 当菌液处于对数生长期 % 为 5, 时 % 离心 弃上清液 加入 倍体积的 36 液体培养基悬浮菌液备用 将预培养 " 的外植体浸入侵染液中 子叶 浸泡 下胚轴浸泡 用滤纸吸去多余液体 紧密排列在 36 固体培养基中 黑暗培养 "

3 第 期 张芸 等 " 基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化 脱菌培养和筛选培养 将共培养 " 的子叶和下胚轴转移至脱菌培养基 36 7 ) 1 % &/7 ) 1 //7% ) 1 /) ; 7 ) 1 +! % 中 % " 后转入筛选培养基 36 7 ) 1 % &/7 ) 1 //7% ) 1 /) ; 7 ) 1 +! 7 ) 1 :) ( :# 潮霉素 % 中 " 更换 次培养基 将分化约 5 # 的绿芽切下转入壮苗培养基 36 7 ) 1 % &/7 ) 1 //7% ) 1 /) ; 7 ) 1 +! % 中 待分化芽苗长至 5 # 时转入生根培养基 36 中 (*+* ) 转基因油菜 72 检测 )2+/& 法提取油菜总 / 并用 6 启动子序列设计上游引物 6 F +.+./ /++./. F " 下游引物 6 见 进行 2@ 扩增片段长度为 ' 左右 2@ 阳性对照模板为质粒 2/3& " 阴性对照为未经转化的油菜基因组 / +) 结果与分析 +*() 拟南芥 / % 在拟南芥基因组中有 % % 均定位于染色体 ",$ 为研究对象 图 " 前体基因序列设计引物 拟采用 2@ 扩增出,%% 的片段 以拟南芥总 / 为模板 用 6 和 6 引物进行 2@ 扩增 电泳结果如图 片段经回收 连接 转化 测序及比对 发现所得序列与.! & = " 前体基因序列同源性为 4 表明已成功克隆出该序列 图 () 拟南芥 / % 前体茎环发夹图 '*() /"# 1!!" / %1! " 成熟序列 +!! #!( "! "! "!!"- 图 +)/ % 前体基因的 72 扩增结果 '*+)7 %! 1 "/ %' $/1# % 72 +*+) 拟南芥 / % 前体基因过表达载体构建将含有目的片段的重组 3 $ + 质粒用 和 双酶切 图 并回收目的片段 将回收的目的片段插入表达载体 2/3& /, 中 用引物 6 和 6 对过表达载体 2/3& " 进行 2@ 验证 预期得到 ' 左右的条带 电泳结果如图, 和图 " 前体基因已成功导入农杆菌 可用于油菜转化 图 ) 表达载体 12.,-(> 的 "93 区结构 '*)&! "93 ' 1! 12.,-(>

4 ' 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 图 ) 重组质粒的酶切鉴定 ) '*)2&$ $! $ &! / $ 1#$/ % ))))))) 图 ) 农杆菌 5 (> 菌液 72 '* )72 %! 5 (> % ' %! / +*) 根癌农杆菌介导法转化油菜油菜外植体经预培养 农杆菌侵染 共培养 脱菌培养 生根培养等一系列过程后部分长成了潮霉素抗性植株 在转化的 $' 个外植体中共获得了 % 株潮霉素抗性植株 再生率为 % 4 +*) 转基因油菜 72 检测提取 % 株潮霉素抗性植株及阴性对照的 / 以质粒 / 为阳性对照 进行 2@ 扩增 扩增产物用 4 琼脂糖凝胶电泳检测 图 % 结果发现 % 株抗性植株中 有 株能扩增出与质粒 / 大小一致的 ' 左右的条带 而阴性对照和另外, 株均未扩增出任何条带 " 前体基因已整合到油菜基因组中 阳性率为 4 图 图 ) 转基因油菜总 93 的 72 分析 '* )72 $ $# & $#93 / $ '! $1 3- / 标准 5- 具有潮霉素抗性的 + 代植株 - 野生型油菜,- 质粒 3- / =! -+<(! ( +!!" )! (:) ( :# -8 ":!!,- " ) 讨论 图 ) 转基因油菜表型 '* )7& 1 $ '! $1 / 在植物响应营养胁迫方面起着重要的调节作用 可能参与植物硫转运和同化途径 的功能研究至今尚未见有报道 另外 相关靶基因的功能包括缺营养素环境的响应等机制还不清楚 需要深入的研究 因此 本试验是在该领域中的一个重要探索 目前 我们已经在油菜中首次克隆到 的靶基因 * ) * 4 和 -( 的全长序列 相关序列已经递交.! & = 并获得正式序列号 * ) ##! (! > %%' * 4 ##! (

5 第 期 张芸 等 " 基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化 $! > %%' -( ##! (! >, $ 经生物信息学分析和 F@/2 验证 的靶标基因 资料待发表 初步表达验证结果表明 随着缺硫时间的延长 靶基因的表达均下调 在油菜硫转运及同化途径中起了重要的作用 在不同物种间功能的保守性 在植物硫代谢途径中的作用 " 前体基因转入甘蓝型油菜特选, 号中 经 2@ 检测发现 转化后再生得到的 % 株潮霉素抗性植株中有 株能扩增出目的基因条带 其他, 株未扩增出任何条带 其原因可能是由于潮霉素筛选浓度低导致部分非转化苗的逃逸 从而增加了假阳性率 目前 有关转基因植株的生理生化功能正在研究之中 另外 我们还在鉴定 分离和获得 + + 代种子 届时根据转基因植株的表型特征以及各项分子与生理学指标的测定 " 调节油菜缺硫及耐 2" 反应的相关功能 参考文献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孙雪梅 杨志敏 - 植物的硫同化及其相关酶活性在镉胁迫下的调节 - 植物生理与分子生物学学报 % $ % + (< & =! (!/ > 1! " /! - ( : ( 1!#! ( )( )!! ( #!" :!! ( '% "!!! -.!! $$ $,,,, 何云 万光龙 唐桂香 等 - 提高甘蓝型油菜下胚轴外植体植株再生的研究 - 浙江大学学报 农业与生命科学版 %,% 王艳 曾幼玲 贺宾 等 - 农杆菌介导 基因转化甘蓝型油菜的研究 - 作物学报 % ' ' % 6 = )- (! "!!)!" # (@ / " / ( / "( -+! 2!, % $ < 2. 9( (( 3 : = /! -6 ( " #!!!! ( ( # (@ / $ " (!( )!)!! "!! #! :! -+! ( $ 责任编辑 夏爱红

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