西安交通大学学报 医学版 第 卷 干扰素诱导的跨膜蛋白 &!#-8#-/!+&!"# -1!%0#0-1!#-/#&! 也称 #"+ 或 + 位于人类 染色体区 其蛋白相对分子质量为 " 近年研究报道 在结肠癌 肺癌 直肠癌 胃癌及头颈部鳞癌高表达 其在恶性肿 瘤中的作用正日益受到广泛关注 在卵巢癌

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 基础研究 沉默 基因对卵巢癌 细胞增殖和侵袭能力的影响 杨 蓉 高婷婷 姚念玲 王 建 陈必良 陕西省第二人民医院妇产科 陕西西安 第四军医大学唐都医院妇产科 陕西西安 $ 第四军医大学西京医院妇产科 陕西西安 摘要 目的 探讨 %&' 沉默 基因表达对卵巢癌 () 细胞增殖和侵袭的影响 方法 利用脂质体转染法将靶向 的小干扰 '%&' 转染卵巢癌细胞株 ()*'+)(' 和,#%#-!./ 观察转染后 () 细胞 0' 和蛋白表达的变化 平板克隆形成实验和 -1!%#. 小室分别检测各组细胞增殖和侵袭能力的变化 结果 转染组 () 细胞的 0' 和蛋白表达明显受抑制 转染组 阴性对照组及转染试剂对照组形成克隆数分别为 $$$ 克隆形成率分别为 $ 迁移出的细胞分别约为 个 个 个 转染组结果与其他两组之间有统计学差异 说明转染 %&' 抑制了卵巢癌 () 细胞增殖和侵袭能力 结论 沉默 可以降低卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力 可能成为卵巢癌治疗的潜在新靶点 关键词 小干扰 ' 卵巢癌 细胞增殖 细胞侵袭中图分类号 ' 文献标志码!"#$%&' $""$'$" " %$"($"$"''" '/! 2 &!+&! 2 &1!+.&!,3&1! (456&+.&1! 7#1-0#!/8!#/./1!2%#-&%911!&)-/:&!&1.9#/!)#/.#;%4/%&1. &;1!7#1-0#!/8!#/./1!2%#-&%1!"4/%&1./8/"- &.&1- #&1.!&:#-%&&;1!$7#1-0#!/8!#/./1!2%#-&% &&!4/%&1./8/"- &.&1- #&1.!&:#-%&&;1!(&!1 )*+,) ##"#" ()(!*'+"###,-& *'+ "()(!.#",-# /#! &01()(! *'+".1" *-,*" &-# ".#. "",-#&()(!*'+# " 1()(! ###,- *'+ " &# "#"#.$()(!*'+.#. #.$ #"$##&###,)0.& "$# &.#.""#." # *'+ # "" #. "# "."()(!1 "",-#& #".()(!"",-#&()(!# ##& -. /,+ "#" ()(!*'+## ## 收稿日期 ++ 修回日期 ++ 基金项目 国家自然科学基金资助项目 /$$4 陕西省重点课题资助项目 /(+$ 9"/-##1&/!1.1"-1./"!1&/!/8(&!1 /$$41!# #)-/-10 /8911!&)-/:&!# / (+$ 通讯作者 陈必良 5+01&..800"#"! 优先出版!&!# 0%#1&.'$0.++!"#"!

2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 干扰素诱导的跨膜蛋白 &!#-8#-/!+&!"# -1!%0#0-1!#-/#&! 也称 #"+ 或 + 位于人类 染色体区 其蛋白相对分子质量为 " 近年研究报道 在结肠癌 肺癌 直肠癌 胃癌及头颈部鳞癌高表达 其在恶性肿 瘤中的作用正日益受到广泛关注 在卵巢癌基因表达分析的研究中 国外基因筛查发现 呈现高表达 本研究前期实验发现 在卵巢癌组织中表达明显上调 提示 表达增强可能是卵 巢癌的一个初始事件 为了进一步探讨 基因蛋白表达和功能调控的机制 我们通过脂质体转染技术沉默 观察人卵巢癌细胞增殖和侵袭能力的变化 为阐明卵巢癌发生发展的机制及预防治疗提供理论依据 材料与方法 细胞株及试剂 人卵巢癌顺铂耐药细胞株 () 由西京医院妇产科实验室提供 + %&' 片段 阴性对照 阳性对照及荧光标记阴性对照由上海吉玛制药技术有限公司设计合成 %&' 序列 %&'+((+ ('((((( %&'+((((( '(%&'+ ((((((('+ ((#1&:# /!-/. (((((('77+ (((( 兔抗人 单克隆抗体 货号 1 及兔抗人 +1&! 单克隆抗体购自美国 10 公司 &/8#10&!# 购自!:&-/#! 公司 )(' 引物由上海生工生物有限公司合成 -1!%#. 小室购自北京康宁公司 0 方法 0 细胞瞬时转染 转染前 取一 孔板 将对数生长期的卵巢癌 () 细胞制成细胞悬液接种其中 用无双抗的 75 培养基培养 实验分为 组 转染组 %&' 阴性对照组!#1&:# /!-/. 转染试剂对照组 0/-1!%8#&/! 无血清无抗生素的 75 与 %&' 轻柔混匀 将 &/8#10&!# 加入无血清无抗生素的 75 培养液中稀释 轻柔混匀 室温静置 0&! 将上述稀释好的 %&' 和 &/8#10&+!# 柔和混匀 室温静置 0&! 取 复合物加入 孔板 轻轻摇晃 常规培养 后更 换新鲜的 75 培养基 培养 $ 00*'+)(' 检测筛选 %&' 最优片段 收集 组卵巢癌 () 细胞 加入 -&/.'#1#! 试剂提取细胞总 ' 紫外分光光度计测量 ' 纯度 反转录成 7 上游引物 <+(+ (+< 下游引物 <+(+ ((((((+< 扩增片段长度 退火温度 $= +1&! 上游引物 <+(+ ((((((+< 下游引物 <+(+ (((((((+< 扩增片段长度 退火温度 $= 实验重复 次 )(' 扩增产物应用 ( 法进行数据分析 筛选出干扰效率最高的 %&' 最优片段进行后续实验 01,#%#-!./ 检测 %&' 转染后细胞中 的表达 细胞转染 $ 后 加入细胞裂解液冰上裂解 0&! 并离心 提取所需蛋白样品 配胶上样进行 979+)5 电泳 将电泳后的凝胶转至 ( 膜 用 69 配制一抗封闭缓冲液 抗体 > +1&! 抗体 > 和上述膜一起装入干净的塑料袋中 旋转过夜 将洗过的膜加入辣根过氧化酶标记的二抗封闭缓冲液 羊抗兔 > 摇床封闭 在避光下配制发光工作液进行显影定影和发光检测 0 平板克隆形成实验 0/. 顺铂作用 $ 后常规消化离心收集细胞沉淀 重悬细胞沉淀 调整细胞密度为? 个 0 倍比稀释至? 个 0 取 细胞悬液接红纸平皿 每个平皿 个细胞 十字形上下左右晃动至细胞均匀分散 孵箱常规培养 周 当出现肉眼可见克隆时停止培养 甲醇 0 固定 0&! 加入姬姆萨染液染色 0&! 自来水冲洗 空气干燥 用带网格的透明胶片计数肉眼可见的克隆数 计算克隆形成率 拍照 0-1!%#. 小室 提前将 1-&#. 放入 = 保存 用 1-&#. 包被底部膜的上室面 风干 水化基底膜 每孔加入 无血清培养液 含 69 撤血清饥饿 )69 洗涤细胞沉淀 遍 无血清培养液 含 69 重悬细胞 调整细胞密度至? 个 0 取 细胞悬液加入 -1!%#. 小室 加入全培养基 孵箱培养 取出 -1!%#. 小室 )69 洗涤 0 乙醇固定 0&! 将小室适当风干 结晶紫溶液染色 显微镜下随机取 个视野计数 取平均值 0 统计学方法 应用 9)99 统计分析软件对数据进行分析 标准差表示 等级资料比较用秩和检验 计数资料采用 检验 各组均数!"#"!

3 期 杨 蓉 高婷婷 姚念玲 等 沉默 基因对卵巢癌 () 细胞增殖和侵袭能力的影响 间采用 检验 为差异有统计学意义 0 结 果 0,#, 检测筛选,) 最优片段 采用 *'+)(' 检测转染 %&'$ 后 个片段对靶基因的干扰效果 结果显示 小干扰片段 + %&'+ 抑制效率最高 以下实验直接选取干扰效率最高的片段 %&'+ 进行实验 图 %&' 转染组的克隆形成能力明显小于其他两组 说明 %&' 转染增强了 () 对顺铂的敏感性 图 图 1 平板克隆实验检测 细胞增殖的变化 &##8#/8-1!%8##%&'/!#-/.&8#-1&/! /8() #.%#%#.1#./!#1%%1 图,#, 筛选最优,) 小干扰片段 & 0' #-#%%&/! ### -#1.+&0# *'+)(' 与阴性对照组 ( 比较 00,) 转染 细胞后 的表达变化,#%#-!./ 结果显示 转染组较转染试剂对照组 阴性对照组中 蛋白表达水平明显降低 图 0,) 对 细胞侵袭能力的影响 -1!%#. 小室结果显示 转染试剂组和阴性对照组中细胞穿膜数量无明显差异 %&' 转染组穿膜数量明显少于其他两组 差异具有统计学意义 结果表明一直 表达 () 细胞的侵袭能力显著降低 图 1 讨 论 通过调控转录水平的众多因子 在不同 肿瘤中通过不同的作用机制介导多种生物学功能 刘灏等 以结肠癌患者的癌组织提取总 ' 通过 '+)(' 扩增 酶切 克隆后免疫小鼠 制备了单克隆抗体并用 59,#%#-!./ 检测结肠癌组织中 浓度及含量 提示其远远高于正常的结肠组织 且可能用于结肠癌的早期诊断 另有研究报道 上调结肠癌 9,$ 细胞株的 表达 其侵袭能力明显增强 推测 可能促进大肠癌的侵袭 和转移 在胃癌组织及细胞中 的特异性 过表达受启动子甲基化作用的影响 通过 )$' 通路发挥其生物学作用 4''9 等采用人类基因表达数组研究炎症性肠病的相关基因表达变化 发现 与结肠黏膜免疫和防御反应有关 并强调了表观遗传变化之间的关系以及在小儿溃疡性结肠炎的潜在病原学诊断和治疗的标志物 实验表明 图 0/$"2' 检测转染后 的表达变化 &-/#&!#-#%%&/!###,#%#-!./,#%#-!./ 结果 6 蛋白相对表达量 与阴性对照组和转染试剂对照组相比 01,) 对 细胞增殖能力的影响 平板克隆形成实验显示 初始接种细胞 个 转染试剂对照组中形成克隆数为 $ 其克隆形成率 $ 阴性对照组中形成克隆数为 $ 其克隆形成率 转染组中形成克隆数为 $ 其克隆形成率 在肝脏细胞接受干扰素治疗的早期 就被诱导表达 并且在干扰素治疗的 4(A 感染的人类肝脏 $ 中呈现升高 在制定对抗人畜共患埃博拉病毒 562A 的策略中 与其他效应分子组成的 系统可以构成强有力的抑制 562A 传播的屏 障 等应用 7 基因芯片发现 在咽部肿瘤标记物中 是代表性的差异表达基因 与肿瘤的发生及紫杉醇耐药相关 在人卵巢癌中的作用报道较少 本研究前期实验显示 阳性!"#"!

4 西安交通大学学报 医学版 第 卷 图 $"!' 小室检测 基因沉默对 细胞侵袭能力的影响 & ##8#/8-1!%8##%&' /!# 0&+ -1&/!/8() #.%#%#-1!%#. 10#- -1!%#. 实验结果?6 组穿膜数量统计 与阴性对照组和转染试剂对照组相比 表达定位于细胞膜上 顺铂耐药株 () 的 染色强度及蛋白表达水平较顺铂敏感株 $ 增强 使用相同浓度梯度的顺铂诱导卵巢癌敏感株 $ 和耐药株 () 后 蛋白的表达水平都呈现增强趋势 并且随顺铂剂量的增加和作用时间的延长而逐渐增强 呈现出剂量及时间的同步依赖 性 '& 是一种能够高效抑制靶基因表达的方 法 %&' 可对特定基因产生专一性的沉默现象 利用 %&' 的互补性标记已知序列的基因 这种功能使 %&' 成为基因功能分析 信号传导通路研究 新药物研究及肿瘤基因治疗等领域的重要手 段 等研究发现 %&' 沉默 基因能显著抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭 可能归因于基质金属蛋白酶 的表达和酶活性下降 降低脑胶质瘤细胞株 的表达可能抑制脑胶质瘤细胞的增殖 迁移和侵袭 本实验以卵巢癌顺铂耐药细胞株 () 为研究对象 利用 %&' 沉默 的表达 发现敲除 后 () 细胞中 在 0' 和蛋白水平表达明显下调 顺铂作用 %&' 转染组后细胞增殖数量减少 提示通过沉默 可能抑制 () 的增殖 表明 与卵巢癌细胞的增殖和耐药可能密切相关 确切的分子作用机制将在后续的实验中探究 迁移能力是肿瘤细胞离开原发灶进行播散的先决条件 有研究表明 )% 与 在肿瘤的迁移过程中相互作用 大多数卵巢癌患者发生顺铂耐药后 出 现临床复发转移 直接影响患者的预后 我们通过 -1!%#. 显示 %&' 转染组中卵巢癌 耐药细胞株 () 的细胞穿膜数量显著下降 提示下调 表达后 卵巢癌细胞侵袭能力明显减弱 综上所述 可能参与了卵巢癌的增殖和迁移 并可能与卵巢癌耐药具有相关性 本发现有助于进一步探讨 基因在卵巢癌侵袭进展和铂类耐药中的作用机制 为寻找治疗卵巢癌的基因靶点提供新的分子思路 参考文献 +*('2'30*/0($2+&!#"# #"1""# ##1#4&5 -# & 6+**($ *+'+37$8++/ 2!(* $+&2'+ #"###"" "###&0 #$& 杨蓉 孙萍 王建 & 卵巢上皮性癌中干扰素介导的跨膜蛋白 的表达意义 & 现代生物医学进展 $$& +*('2'30*/0($2+&!#"# #"1""# ##1#4&5 -# & 刘灏 林智琪 付方勇 等 & 抗 ()(! 单克隆抗体的制备及检测 & 现代生物医学进展 & 骆红蕾 喻晓娟 何敬东 等 & 干扰素诱导跨膜蛋白 对结肠癌 $$ 细胞株侵袭和转移能力的影响 & 临床肿瘤学杂志 & /0036$6$'3 '&1()(! #######"" ##&+-$ & 下转第 页!"#"!

5 期 张 宏 王 文 田 甜 等 5-&! 在三阴性乳腺癌中的表达及意义 等发现使用 ' 干扰技术使 5-&! 基因表达沉默后可有效降低乳腺癌细胞的侵袭转移能力 证实 5-&! 参与了乳腺癌的侵袭和转移过程 本研究结果显示 5-&! 在三阴性乳腺癌组织与非三阴性乳腺癌组织中的表达差异具有统计学意义 5-&! 在三阴性乳腺癌组织中高表达提示 5-&! 可作为三阴性乳腺癌预后不良的指标之一 5-&! 在三阴性乳腺癌中的表达与组织学分级以及临床 分期 有关 马力的研究表明 在乳腺浸润性导管癌中 5-&! 的表达水平随着组织学分级 临床 分期的增加而逐渐升高 其表达与组织学分级和临床 分期呈正相关 但是本研究中 5-&! 的表达与腋窝淋巴结转移状况无关 可能是由于样本量较少的缘故 5-&! 在三阴性乳腺癌 非三阴性乳腺癌中的表达均显著高于乳腺良性疾病 这与 9(4,5'++ (4 等的研究结果一致 5-&! 在三阴性乳腺癌中高表达可能是三阴性乳腺癌侵袭性强 早期容易出现复发及转移的原因之一 但是其在三阴性乳腺癌侵袭 转移过程中的具体作用及详细机制尚不清楚 其表达上调的机制也有待进一步研究 检测 5-&! 在三阴性乳腺癌患者中的表达情况可能有助于判断其预后 并为其早期诊断及靶向治疗提供一定的依据 相信随着大量相关实验的开展与研究 5-&! 有望为三阴性乳腺癌的诊治提供新的靶点 参考文献 6*%(8$!0+2!&##"# ##4"#&, 3 #$& 7+2+% 5$,6+'+'+ -6+!5$&5 ##+.& ", # & /(/+' $&04#". ###"&-#* & /( &014#.##" # ".4# ###&5&,/,+$%+/20**+!+ )&0*!## &,$#-& 李琼 吴明富 宋安萍 等 & 浸润性乳腺导管癌组织中 04 和钙粘素 0 的表达与淋巴结转移的关系 & 癌症 & '+%*+(/ )+5(+'--+/+,%+!& ##&$& $ 陈竟男 王杨 金东辉 等 &*$ 增强乳腺癌!2+!5 细胞对顺铂化疗敏感性的作用及其机制 & 吉林大学学报 医学版 & 方军 &04 蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的相关性研究 & 检验医学与临床 $$& 王明喜 郑荣生 承泽农 等 & 埃兹蛋白在乳腺癌中的表达及意义 & 蚌埠医学院学报 $$$&!+ 6'+5+ +%+*!+ $&04 " ###&5!,,#$& 0//(50!00'$+$0'3-+$& ##04" ###&5,#*& /(9!+'3 6&04# *'+### #&,#/$& 马力 张祥宏 邢凌霄 等 &04 与乳腺浸润性导管癌发生发展及预后的关系 & 中华肿瘤杂志 $$& 3$,6+'/0*+/(,6 2'+0*,$0*0*$ &(#41 &,#2"$& 编辑 国 荣 上接第 页 ## &- *$$& $(/('$,*2+*2/+ 2&()(! 706,6'3!!&! #*'+&( :#, & /$& 6 & 7 )'3$$,6 5&#". 6/+-6/!+''$&6.0# "#"()(! &8-#6& "#&'#,8$6(*,60' 2&- $& #1 1###&(, 6++' (&()'"#" 01& " 杨蓉 孙萍 宋芳霞 王建 & 干扰素介导的跨膜蛋白 与卵巢上皮 "###&,,# *$ 性癌耐药相关性研究 & 现代肿瘤医学 $ & & 编辑 卓选鹏 +'38*+22$0'80*'&*'+#"!"#"!

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