2 标样的纯度都在 % 瓜萎镰菌醇脱氧瓜萎镰菌醇镰刀菌烯酮 -X 新茄病镰刀菌烯醇 3- 乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇 T-2 毒素疣孢菌醇类玉米赤霉烯酮 α- 玉米赤霉烯酮 β- 玉米赤霉烯酮柄曲霉素赭曲霉毒素 A 交链孢霉烯交链孢霉酚和交链孢霉酚 - 甲基醚的固体标样都溶解在

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苗向秋
5 years ago
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采用 UHPLC 筛选和定量多种真菌毒素, 高分辨和准确质量数 Milena Zachariášová, Jana Hajšlová, Institute of Chemical Technology, Prague, Czech Republic Michal Godula, Thermo Fisher Scientific, Prague, Czech Republic

1 采用 UHPLC 筛选和定量多种真菌毒素, 高分辨和准确质量数 Milena Zachariášová, Jana Hajšlová, Institute of Chemical Technology, Prague, Czech Republic Michal Godula, Thermo Fisher Scientific, Prague, Czech Republic Application Notes 关键词 Exactive LC-MS, Beer, Cereals,Mycotoxins 引言真菌毒素是发生在谷物场, 包括大麦, 由各种类型的微观丝状真菌产生的毒性次生代谢物影响啤酒大麦的含量最高的真菌属有链格孢属黑曲霉青霉菌和镰刀菌, 同时也显示了生成大量真菌毒素的可能性 1 除了上述相对常见的微观霉菌, 导致麦角症的麦角菌属于大麦病原体尽管文献中记录过麦芽谷物啤酒中黄曲霉毒素赭曲霉毒素 A 玉米赤霉烯酮伏马毒素和麦角生物碱的残留, 这个领域的主要研究集中在脱氧瓜萎镰菌醇, 最常见的镰刀菌毒素 2,3 近年来, 已经有报告指出, 在谷物和啤酒中存在相对高浓度水平的脱氧瓜萎镰菌醇的主要代谢物, 脱氧瓜萎镰菌醇 -3- 糖苷后续研究进一步证实了这一点, 在欧洲市场上零售的啤酒中, 主要污染物即为脱氧瓜萎镰菌醇及其糖苷 4 由于啤酒广受欢迎, 因此对其中真菌毒素的控制特别重要所以在啤酒生产环节中需要一种快速有效监测真菌毒素的可靠的分析方法分析方法的发展趋势是尽可能简化样品制备程序全谱数据采集技术也可以优先考虑, 因为这些技术使用简便, 而且可以追溯存档数据如今最常见的全谱方法是时间飞行技术 (TOF-MS), 其典型的分辨率约为 12,500 FWHM( 半宽度 ) 但是, 其复杂的食品基质, 例如啤酒, 由于不能解析的背景基质干扰导致的不准确质量测量, 一定程度上限制了质量分辨率 5,6 基于 Thermo Scientific Orbitrap 技术的质谱系统通常获得高达 100,000 FWHM 的质量分辨率, 无需使用内标质量校正即可保持出色的质量精度 <5 ppm 7 这篇研究的目的就是基于非常简单的样品制备和超高性能的液相色谱 - 全谱 Orbitrap MS 检测技术, 介绍一种分析啤酒中 32 种真菌毒素的方法真菌毒素标样 (i) 镰刀菌毒素,( 瓜萎镰菌醇脱氧瓜萎镰菌醇脱氧瓜萎镰菌醇 -3- 糖苷 deepoxydeoxynivalenol- 瓜萎镰菌醇镰刀菌烯酮 -X 新茄病镰刀菌烯醇 3- 乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇蛇形菌素 HT-2 毒素 T-2 毒素疣孢菌醇类玉米赤霉烯酮 α- 玉米赤霉烯酮 β- 玉米赤霉烯酮 );(ii) 黄曲霉毒素 ( 黄曲霉毒素 G1, 黄曲霉毒素 G2, 黄曲霉毒素 B1, 黄曲霉毒素 B2);(iii) 柄曲霉素 ; 和 (iv) 赭曲霉素 ( 赭曲霉素 A 赭曲霉素 α); 均购自 Biopure (Tulln, Austria), 标样 (v) 黑斑毒素 ( 交链孢霉烯交链孢霉酚和交链孢霉酚 - 甲基醚 ) 购自 Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany); 标样 (vi) 麦角生物碱 ( 麦角辛麦角考宁麦角隐亭麦角克碱 ) 由 Czech Agricultural and Food Inspection Authority 提供

2 2 标样的纯度都在 % 瓜萎镰菌醇脱氧瓜萎镰菌醇镰刀菌烯酮 -X 新茄病镰刀菌烯醇 3- 乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇 T-2 毒素疣孢菌醇类玉米赤霉烯酮 α- 玉米赤霉烯酮 β- 玉米赤霉烯酮柄曲霉素赭曲霉毒素 A 交链孢霉烯交链孢霉酚和交链孢霉酚 - 甲基醚的固体标样都溶解在乙腈内液体标样,deepoxydeoxynivalenol- 瓜萎镰菌醇蛇形菌素 HT-2 毒素 α- 玉米赤霉烯酮 β- 玉米赤霉烯酮赭曲霉素 α 麦角生物碱均溶解在乙腈内, 而且脱氧瓜萎镰菌醇 -3- 糖苷在乙腈 : 水溶液 (1:1, v/v) 中所有标样都在 -20 C 保存为了进行加标实验和校正, 制备了溶解在乙腈 (1000 μg L -1 ) 中的复合工作标准溶液在使用之前使所有标样达到室温有机溶剂乙腈和甲醇 (HPLC 级 ) 购自 Sigma-Aldrich (Taufkirchen,Germany) 超纯水来自 Milli-Q 系统 (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) 样品制备装在 PTFE 试管中的 4 ml 啤酒液体样品在超声浴中脱气处理, 然后加入 16 ml 乙腈, 将溶液剧烈振荡大约 1 min 深色基质沉淀, 然后离心分离 (10 min, 11,000 rpm) 下一步将 5 ml 上清液蒸干, 然后将其重新溶解在 1 ml 甲醇 : 水 (50:50, v/v) 溶液中为了避免 UHPLC 系统的阻塞, 在进样之前进行微孔过滤 ( 通过 0.2 μm 的微孔过滤器离心,( PVDF Zentrifugenfilter, Alltech, USA)) 为了控制由于沉淀和水相分离带来的潜在损失, 在处理之前加入等分量的 13c 标记呕吐毒素和 13c 标记的玉米赤霉烯酮标准溶液作为替代物 (13c 标记呕吐毒素和 13c 标记玉米赤霉烯酮用于分别校正更多和更少极性待测物 ) 仪器设置和条件 Thermo Scientific Accela UHPLC 系统用于分离目标待测物利用具有 Orbitrap 技术的 Thermo Scientific Exactive 台式单四极质谱仪进行检测, 在不同分辨率设置下进行全扫描不需要使用内部质量轴校正 ( 锁定质量 ) 表 1 总结了所用条件毛细管和 tube lens 分别设置在 ±45 V 和 ±115 V 对于质量精度评估, 使用提取离子色谱图的色谱峰顶点处的质量定量离子的计算 ( 提取 ) 质量总结在表 2 中结果和讨论考虑到分析多种食品污染物的当前趋势, 同时还要保持高通量和简化的样品制备, 某个液体样品的直接分析似乎成为优先的选择但是, 在这个情况下, 色谱柱上直接注入基质并不可行, 因为基质过于复杂过高的基质干扰导致直接进样时很难检测出目标物除了这个限制, 直接进样还降低了分析柱的寿命并快速污染了离子源由于 32 种真菌毒素及其代谢物, 吸收或者免疫亲和性色谱都无法代表可行的样品制备策略唯一的简单方法就是去除至少部分的基质组分, 同时保留溶液中的目标分析物这个方法就是通过加入可混合水的溶剂乙腈, 减少啤酒样品的极性需要注意的是, 到目前为止, 大部分有关在单次分析中测定多种真菌毒素的出版研究文章, 均采用电喷雾离子源 (ESI) 但是,ESI 对于某些镰刀菌毒素, 尤其是 DON 及其结合物, 只能得到不太好的的检测限由于可靠分析这些极其常见的天然啤酒污染物的重要性, 大气压化学电离 (APCI) 的能力得以评估流动相的优化流速是 5 ml/min, 气化室温度是 250 C 在 APCI 条件下, 相比 ESI 而言, 镰刀菌毒素的可检测性增强了 1200% UHPLC 条件质谱条件 (APCI) 色谱柱 : Hypersil GOLD aq, 100 mm 2.1 mm i.d., 1.9 μm 鞘气 35 Units 流动相 A 5 mm NH4COOH 的水溶液辅助气 10 Units 流动相 B 甲醇毛细管温度 250 流速 500 µl/min 气化室温度 250 色谱柱温度 40 毛细管电压 +60/-50 V 进样体积 5 µl 放电电流 5 μa 梯度洗脱程序扫描范围 m/z 0.0 min 6.0 min 10.0 min 15.0 min 15.1 min 18.0 min 5% B 50% B 95% B 95% B 5% B 5% B 分辨率设置 (FWHM) 10,000 25,000 50, ,000 表 1:Accela UHPLC/Exactive MS 设置推荐的 Thermo Fisher Scientific 供应商品 Hypersil GOLD aq, p/n , Thermo Scientific 水, p/n W6-212, Fisher Scientific 甲醇 Optima LC/MS 级, p/n A , Fisher Scientific 甲酸铵, p/n A , Fisher Scientific 乙腈 Optima LC/MS 级, p/n A , Fisher Scientific Fisherbrand 高速 Easy Reader 塑料离心管, p/n ,Fisher Scientific

3 3 分析物保留时间 ( 分钟 ) 分子式分子量 (Da) 精确质量数 [M+H] + (m/z) 精确质量数 [M+NH 4 ] + (m/z) 精确质量数 [M-H] - (m/z) 精确质量数 [M+HCOO] - (m/z) 表 2: 利用 Exactive 进行定量分析所用的最强离子概述唯一例外是赭曲霉毒素 A, 它在电喷雾条件下显示了更好的电离效率,APCI 被选用, 是因为它为大多数待测物提供了更好的检测限图 1 中, 单个真菌毒素的提取离子色谱图表示 Accela UHPLC 系统上获得快速而出色的分离效果

4 4 图 1: 待测真菌毒素的提取离子色谱图

5 图 1: 待测真菌毒素的提取离子色谱图 5

6 6 图 2: 当执行四种不同分辨率 (10000;25000;50000 和 FWHM) 设置时, 啤酒中脱氧瓜萎镰菌醇 -3- 糖苷的提取离子色谱图, 质量提取窗口 ±3 ppm 加标水平为 5 μg L -1 (A) 和 50 μg L -1 (B) 图 3: 当执行两种不同分辨率 (10000 和 FWHM) 设置时, 啤酒中脱氧瓜萎镰菌醇 (10 μg L -1 ) 的提取离子色谱图和质谱图

7 方法验证优化的检测多种真菌毒素的 UHPLC-MS 方法得到全面的验证在分析加标样品之前, 对基质效应的程度进行了调查, 以确定定量策略出于这个目的, 制备了两组校正品 :(i) 标样净溶剂 ;(ii) 基质匹配的标样在两种情况下, 目标真菌毒素的浓度范围是 μg L-1 尽管信号抑制 / 增强 (SSE) 范围不是太宽 (63-112%), 基质匹配的校正标样得以使用另一个重要点是计算等效的定量限 (LOQ) 串联质谱仪的 LOQ 的经典定义是基于信噪比 ( 一般 S/N > 6), 但是这个在高分辨质谱下并不总是可行, 因为实际上色谱图中没有化学噪声, 因此测定最低校正水平 (LCL) 成为最合适的选项研究中待测物的 LCL 通过实验建立为基质匹配标样的最低浓度从 11-28%( 参阅表 3) 的 9 次重复进样计算了测量的相对标准偏差同时 91% 的待测物的最低校正水平在 1-10 μg L-1, 对于赭曲霉毒素 A 找到了一个相对高的 LCL 水平, 这表示它在电喷雾条件下得到了更好的电离 ( 小于 5 μg L-1) 7 真菌毒素 LCL 纯标样 (pg/l) LCL 基质匹配标样 (pg/l) 加标 10 μg L -1 回收率 % 加标 30μg L -1 加标 50μg L -1 加标水平 10 μg L -1 下的 RSD(%) LCL 水平下的 RSD(%) SSE(%) 表 3: 开发的 UHPLC-Orbitrap-MS 方法的验证数据 1. 计算 6 个加标水平为 10 μg L -1 的样品的 RSD 2. 计算某个特殊基质匹配标样在 LCL 水平下,11 次重复进样的 RSD 3. SSE (%) = 基质匹配的校正斜率 / 溶剂校正斜率 * 100;SSE 值 100% 表示对于离子信号没有基质效应影响 4. 赭曲霉毒素 A 的加标水平为和 120 μg L 赭曲霉毒素 A 的 RSD 测定在加标水平 100 μg L -1 下进行

8 通过 LCL 到 250 μg L -1 范围内构造的溶剂以及基质匹配校正曲线测试了新方法的线性大多数待测物显示了 (R 2 ) 范围内的线性在和 60μg L -1 水平下测试的待测物回收率范围是 %, 在样品制备过程中没有发生待测物损失 ( 表 3) 结论 UHPLC-MS 技术代表了最有潜力媲美串联质谱仪的方法在 APCI 模式下运行的 UHPLC-MS 能够快速测定复杂啤酒样品中的多种痕量水平的真菌毒素在最高分辨率 100,000 设置下,5ppm 的质量数误差 ( 不使用内部质量校正 ) 允许日常工作使用很窄的质量数提取窗口 ±5 ppm, 由此显著提高检测选择性 Application Notes 成都成都市武侯区临江西路 1 号锦江国际大厦 1406 邮编 : 电话 : 传真 : 沈阳沈阳市沈河区惠工街 10 号卓越大厦 3109 室邮编 : 电话 : 传真 : 免费服务热线

实验使用 QuEChERS 盐包提取,Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱通过式净化, 开发了检测谷物样品中 15 种真菌毒素的方法采用 UPLC 快速分离,Xevo TQ-S 串联四极杆质谱检测, 外标法定量, 测试加标样品各化合物回收率重现性均满足定量测试要求该方法简单快速准

实验使用 QuEChERS 盐包提取,Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱通过式净化, 开发了检测谷物样品中 15 种真菌毒素的方法采用 UPLC 快速分离,Xevo TQ-S 串联四极杆质谱检测, 外标法定量, 测试加标样品各化合物回收率重现性均满足定量测试要求该方法简单快速准 [ 应用纪要 ] 谷物中多种霉菌毒素残留 UPLC-MSMS 测定方法黄德凤高丹怡和王欣玲沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司应用优势样品处理使用 Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱, 成本远低于目前普遍采用的免疫亲和柱快速, 高灵敏的 UPLC /MSMS 分析方法, 同时测定 15 种真菌毒素, 极大的提高试验室的通量简介应用背景霉菌毒素是由霉菌或真菌产生的存在于动物食品或其他人类消费的食品上的有毒化合物,