智云达简介 北京智云达科技股份有限公司成立于 2005 年, 是专业从事食品安全快检产品开发与应用的国家高新技术企业,2016 年 3 月 9 日, 在 新三板 挂牌上市 ( 股票名称 : 智云达 ; 股票代码 :835950) 公司在食品安全检测领域实现了从硬件 软件到技术服务的垂直发展 公司拥有

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1 免疫技术在真菌毒素污染检测中的应用 北京智云达科技股份有限公司 王文珺博士 / 副研究员 北京

2 智云达简介 北京智云达科技股份有限公司成立于 2005 年, 是专业从事食品安全快检产品开发与应用的国家高新技术企业,2016 年 3 月 9 日, 在 新三板 挂牌上市 ( 股票名称 : 智云达 ; 股票代码 :835950) 公司在食品安全检测领域实现了从硬件 软件到技术服务的垂直发展 公司拥有 20 余项国家发明专利, 教育部科技成果 2 项, 多项计算机软件著作权登记证书, 申报国家及省部级项目多项 公司通过了 ISO9001:2008 质量管理体系认证 ISO 环境管理体系 GB/T 职业健康安全管理体系的认证 经过十余年的稳健发展, 公司目前已拥有六大系列食品安全快速检测产品和全资子公司 - 北京众检四方检验检测 ( 第三方检测机构 ), 并在全国二十余个省市建立了 CEC 消费者体验中心, 为政府 企业和消费者提供全方位食品安全整体解决方案

3 内容提纲 一 真菌毒素的危害及监管 二 真菌毒素主要的免疫检测技术及发展趋势 三 真菌毒素检测的相关标准 四 真菌毒素检测技术的应用

4 一 真菌毒素的危害及监管 1 何为真菌毒素? u 真菌毒素是真菌生长繁殖过程中产生的次级代谢产物 u 现已分离鉴定了 400 余种, 主要包括黄曲霉毒素 脱氧雪腐镰刀菌烯酮 ( 呕吐毒素 ) 玉米赤霉烯酮/ 醇 赭曲霉毒素 A T-2 毒素 伏马毒素等毒素 u 同一农作物可能被多种真菌毒素污染 u 如果以被真菌毒素污染的农作物为原料, 或在饲料生产 存储 运输 销售过程中被真菌毒素污染, 则会引起饲料的污染

5 一 真菌毒素的危害及监管 2 真菌毒素的生长条件 : 粮食 饲料在收获时未被充分干燥或贮运过程中温度或湿度过高, 就会使带染在粮食 饲料上的真菌迅速生长 而且几乎所有在粮仓中生长的真菌都会侵染种胚造成谷物萌发率下降, 同时产生毒素 环境湿度和作物含水量 : 谷物的含水量是真菌生长和产毒的重要因素 粮食贮存在相对湿度低于 70% 的条件下, 谷物的含水量在 15% 以下就可控制真菌的生长 环境温度 : 大部分真菌在 都能生长, 一般控制温度可以减少真菌毒素的产生 但黄曲霉最低生长温度为 6-8, 最高生长温度达 44-46, 在 32 时黄曲霉毒素 B1 的产量最高

6 一 真菌毒素的危害及监管 3 真菌毒素的社会危害 u 有数据显示 : 每年全世界 25% 以上农产品遭到真菌毒素污染,5% 失去商品价值, 造成的损失达上千亿美元 美国每年要花费几十亿美元用于真菌毒素的检测 u 真菌毒素是危害发展中国家少年儿童身体健康的主要原因 u 真菌毒素引起饲料霉变, 产生异味, 降低其饲用价值, 甚至完全失去商品价值 被真菌毒素污染的饲料可导致畜禽的急 慢性中毒, 免疫机能和生产性能下降, 造成养殖业效益的下降 ; u 残留于畜禽组织 蛋 奶等动物源性食品的真菌毒素会通过食物链传递给消费者, 损害消费者的身体健康

7 一 真菌毒素的危害及监管 4 真菌毒素的致癌性 黄曲霉毒素 : 肝癌 肺癌 结肠癌 ( 毒性比砒霜还毒 ) 伏马毒素 : 肝癌 肾癌 食道癌 赭曲霉毒素 : 肾癌 玉米赤霉烯酮 : 食道癌 乳腺癌 杂色曲霉毒素 : 肝癌

8 一 真菌毒素的危害及监管 5 国内现状 1 农产品生产 : 规模小 分散, 晾晒方法不科学, 容易造成真菌毒 素的污染 ; 2 真菌毒素检测的需求 : 操作简单 检测结果的定量化 ( 粮油 ), 仪器便携式, 成本低 快速 ; 3 真菌毒素快检产品 : 良莠不齐, 影响食品生产企业的自检和监 管机构的监测效果 真菌毒素快检产品没有完全实现本土化, 国外 产品的垄断地位虽然已被打破, 但依然占据很大的市场 ; 4 真菌毒素是 十三五 监控的重点

9 真菌毒素 适用范围 允许范围 (µg/kg) 黄曲霉毒素粮食中真菌毒素检测的相关标准 B1 大米及植物油 10 小麦 豆类 坚果 5 玉米 花生及其油 20 特殊膳食用品 0.5 黄曲霉毒素 M1 各种乳及乳制品 0.5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 ( 呕吐毒素 ) 真菌毒素的限量要求 玉米 小麦 1000 展青霉素水果 饮料 酒 50 赭曲霉毒素 A 谷物 豆类 饮料 5 葡萄酒 2 咖啡 10 玉米赤霉烯酮小米 玉米 60 依据 :GB 食品安全国家标准食品中真菌毒素限量

10 国家食品安全风险评估中心监测计划 2015 年 : 黄曲霉毒素 (B1 M1) 玉米赤霉烯酮 呕吐毒素及其衍生物 赭曲霉素 A 伏马毒素 2016 年 : 交链孢酚类三种毒素 ( 细交链格孢酮酸 TeA 交链孢酚 AOH 交链孢酚单甲醚 AME)

11 食药监系统的抽检 : 国抽 省抽 地抽 ---- 抽检比例增加 [ 十三五 期间要达到 4 人 ( 次 )/ 千人 ] 样品种类增加 : 粮食及其制品 植物油及其制品 牛奶及其制品 酒 咖啡 保健食品 中药 食用油中黄曲霉毒素 B1 的快速检测胶体金免疫层析法 (KJ201708) 液体乳中黄曲霉毒素 M1 的快速检测胶体金免疫层析法 (KJ201709)

12 真菌毒素 适用范围 允许量 (µg/kg) 赭曲霉毒素 A 配合饲料 玉米 100 玉米赤霉烯酮 配合饲料 玉米 500 黄曲霉毒素 B1 饲料及其原料 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 饲料 T2- 毒素 猪配合饲料 禽配合饲料 1000 伏马毒素 (B1+B2) 玉米 饲料 3-60 依据 :GB 饲料中赭曲霉毒素 A 和玉米赤霉烯酮的允许量 ; GB 饲料卫生标准 ; GB 配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的允许量 ; GB 配合饲料中 T2 毒素的允许量 ; 即将颁布的 GB 饲料卫生标准

13 二 真菌毒素的主要免疫检测方法及趋势 1 主要检测方法 : 酶联免疫吸附分析技术 胶体金免疫层析技术 时间分辨荧光免疫层析定量检测技术 上转换荧光免疫检测技术 免疫亲和柱 --- 仪器分析 (LC LC-MS)

14 二 真菌毒素的主要免疫检测技术及趋势 2 真菌毒素的主要检测方法比较 检测限 耗时 ( 不包括前处理 ) 数据上传检测性质检测用途 酶联免疫低 >30min 定量初筛 胶体金免疫层析较高 10min 定性初筛 时间分辨荧光免疫层析 低 10min 定量初筛 色谱 / 质谱低 >2h 定量确证 一般认为 : 快检方法一般不允许出现假阴性, 允许出现不超过 5% 的假阳性 ; 食药局 : 公布的 9 种快检方法, 每种允许的假阴性率和假阳性率不同 ; 阳性样本要通过仪器分析方法确证

15 二 真菌毒素的主要免疫检测技术及趋势 3 检测技术的发展趋势 : 小型化 模块化 ( 便携 车载 手持 ) 信息化 ( 检测结果数据化 数据上传 ) 增敏化 ( 高灵敏的标记材料, 提高灵敏度, 降低介质干扰 ) 自动化 ( 实现高通量自动化操作, 加快检测速度, 减少人为误差 ) 5-S 化 (Speed Sensitivity Specificity Simultaneous Small-reader) 随着新的标记材料的应用, 不断涌现出的免疫检测新方法是真菌毒素免疫分析的发展方向

16 二 真菌毒素的主要检测技术和趋势 4 主要产品 ( 一 ) 酶联免疫 (ELISA) 试剂盒 黄曲霉毒素 B1(AFB1); 黄曲霉毒素 M1(AFM1); 玉米赤霉烯酮 (ZEN); 呕吐毒素 ( 脱氧腐镰刀菌烯醇,DON); T-2 毒素 (T-2); 赭曲霉毒素 A(OTA); 伏马毒素 (FB)

17 竞争性酶联免疫 (ELISA) TMB+H2O2 终止 包被抗原 标准品或待测物 酶标二抗 一抗 竞争性 ELISA 反应流程 将 0 ng/ml 标准品孔的 OD 值定为 B 0, 其他孔 OD 值定为 B, 以 B/B 0 值为纵坐标, 相应的标准品浓 度的 log 值为横坐标, 绘制 B/B 0 -log 标准曲线

18 二 真菌毒素的主要检测技术和趋势 ( 二 ) 胶体金免疫层析 比色法 消线法

19 二 真菌毒素的主要免疫检测技术和趋势 ( 二 ) 胶体金免疫层析 阴性 检测信号质控带检测带 阳性 测C 值 T 值检信号质控带检测带 T/C 值检测结果 胶体金读卡仪 胶体金读卡仪通过获取检测卡 T 线和 C 线上吸收峰信号, 据此计算出 T 和 C 的峰面积之比 (T/C), 然后根据标准浓度和 T/C 值制作标准曲线 在实际的测试过程中, 直接可根据内置的标准曲线求得待检项目的定量结果 通过读卡仪, 实现检测数据上传 ( 检测结果信息化 )

20 二 真菌毒素的主要免疫检测技术和趋势 ( 三 ) 时间分辨荧光定量免疫层析技术 ü 用三价镧系元素铕 (Eu3+) 作为荧光标记物 固相微球被 Eu 螯合物包裹, 大小均一, 避免泄露和基质干扰 ü 荧光不易淬灭, 稳定性好 Stroke 位移大, 待背景荧光淬灭后再检测, 可消除背景荧光干扰

21 二 真菌毒素的主要检测方法和趋势 时间分辨荧光定量检测仪 兼容性好, 试剂卡开放 内置标准曲线, 准确定量 ; 可配便携式电源, 也可车载供电 ; 数据上传, 实现联机数据管理

22 二 真菌毒素的主要免疫检测技术和趋势 免疫产品的特异性 : 真菌毒素 交叉反应率 检测限 (ng/g) 荧光检测卡 AFB1 AFB1 100%; AFG1 107%; AFG2 1.7%; AFM1 8.1%; AFB2 5% ZEN DON ZEN 100%; 玉米赤霉酮 107%; α- 玉米赤霉烯醇 87%; α- 玉米赤霉醇 126%; β- 玉米赤霉烯醇 40%; β- 玉米赤霉醇 70%. DON 100%; 15-AC-DON 175%; 3-AC- DON <0.1%; NIV <0.1% OTA OTA 100%; OTB 106%; OTC 36%

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24 二 真菌毒素的主要免疫检测技术和趋势 时间分辨荧光免疫层析检测卡与胶体金检测卡的比较 品牌原理目标毒素基质 评价浓 度 /ppb 准确度 RSD 阴性 限值 阳性 限值 评价日期 智云达 时间分辨 荧光 AFB1 玉米 % 9.0% 国产品牌 1 胶体金 AFB1 玉米 % 13.0% 国产品牌 2 胶体金 AFB1 玉米 20 94% 13.3% 国产品牌 3 胶体金 AFB1 玉米 20 97% 7.2% 国外品牌 1 胶体金 AFB1 玉米 % 15.4% 国外品牌 2 胶体金 AFB1 玉米 % 14.2% 数据来源 : 国粮局

25 二 真菌毒素的主要免疫检测技术和趋势 ( 四 ) 免疫亲和柱 免疫亲和柱 作为一种净化手段, 与 HPLC(LC/MS/MS) 联用 ( 各类标准 )

26 免疫亲和柱主要产品 黄曲霉毒素 B1(AFB1) 黄曲霉毒素 M1 (AFM1) 呕吐毒素 (DON) AFB1-ZEN-DON 三合一赭曲霉毒素 (OA) T-2 毒素玉米赤霉烯酮 (ZEN) 黄曲霉毒素总量黄曲霉毒素 M 族 (M1+M2) 伏马 (B1+B2+B3) 毒素黄曲霉毒素 B&G

27 二 真菌毒素的主要免疫检测技术和趋势 ( 五 ) 检测车 --- 检测设备的集成 以食品安全快速检测车为载体, 搭载快速检测设备, 基于快速检测技术以及数据处理技术的综合运用, 为用户提供从样本收集到检测分析 执法监督于一体的综合性服务方案

28 三 粮食饲料中真菌毒素检测的相关标准 黄曲霉毒素 B1 GB/T 饲料中黄曲霉 B1 B2 G1 G2 的测定免疫亲和柱净化 - 高效液相色谱法 ; GB/T 饲料中黄曲霉毒素 B1 的测定酶联免疫吸附法 ; GB/T 饲料中黄曲霉毒素 B1 的测定半定量薄层色谱法 ; NY/T 饲料中黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮和 T-2 毒素的测定液相色谱 - 串联质谱法 ; NY/T 饲料中黄曲霉毒素 B1 的测定胶体金法 ; NY/T 饲料中黄曲霉毒素 B1 的测定时间分辨荧光免疫层析法 ; DB37/T 饲料中黄曲霉毒素 B1 的测定高效液相色谱法 ; DB15/T 饲料中黄曲霉 B1 B2 G1 G2 的测定免疫亲和柱净化 - 高效液相色谱法 ; NY/T 饲料中黄曲霉毒素 B1 的测定免疫亲和荧光光度法 ; LS/T 粮油检验粮食中黄曲霉毒素 B1 测定胶体金快速定量法 ; LS/T 粮油检验谷物中黄曲霉毒素 B1 的快速测定免疫层析法 ; GB 食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素 B 族和 G 族的测定 ;

29 三 粮食饲料中真菌毒素检测的相关标准 玉米赤霉烯酮 GB/T 饲料中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱净化 - 高效液相色谱法 ; GB/T 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 ( 薄层色谱法 / 酶联免疫法 ); DB51/T 饲料中玉米赤霉烯酮高效液相色谱法 ; DB22/T 饲料中玉米赤霉烯酮的测定液相色谱 - 质谱 / 质谱法 ; DB51/T 饲料中黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 赭曲霉毒素 A 和 T-2 毒素的测定 ; LS/T 粮食检验粮食中玉米赤霉烯酮测定胶体金快速定量法 ; LS/T 粮油检验谷物中玉米赤霉烯酮测定胶体金快速测试卡法 ; NY/T 饲料中黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮和 T-2 毒素的测定液相色谱 - 串联质谱法 ; GB 饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素 A 和玉米赤霉烯酮的允许量 ; GB/T 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 ;

30 三 粮食饲料中真菌毒素检测的相关标准 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 ( 呕吐毒素 ) GB/T 饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化 - 高效液相色谱法 ; GB/T 配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法 DB51/T 饲料中呕吐毒素的测定高效液相色谱法 WS/T 霉变谷物中呕吐毒素食物中毒诊断标准及处理原则薄层色谱测定法及免疫测定法 (ELISA ) ; 赭曲霉毒素 A GB/T 饲料中赭曲霉毒素 A 的测定免疫亲和柱净化 - 高效液相色谱法 ; GB/T 饲料中赭曲霉毒素 A 的测定 ( 薄层色谱法 / 酶联免疫吸附分析测定 ); DB51/T 饲料中赭曲霉毒素 A 的测定高效液相色谱法 DB51/T 饲料中黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 赭曲霉毒素 A 和 T-2 毒素的测定 ; LS/T 粮油检测粮食中赭曲霉毒素 A 测定胶体金快速定量法 ; GB 饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素 A 和玉米赤霉烯酮的允许量薄层色谱法 / 酶联免疫法 ;

31 三 粮食饲料中真菌毒素检测的相关标准 T-2 毒素 GB/T 饲料中 T-2 毒素的测定免疫亲和柱净化 - 高效液相色谱法 ; GB/T 配合饲料中 T-2 毒素的测定薄层色谱法 ; DB51/T 饲料中 T-2 毒素的测定高效液相色谱法 ; DB51/T 饲料中黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 赭曲霉毒素 A 和 T-2 毒素的测定 ; GB 配合饲料中 T-2 毒素的允许量薄层色谱法 ; SN/T 出口花生 谷类及其制品中黄曲霉毒素 赭曲霉毒素 伏马毒素 B1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 T-2 毒素 HT-2 毒素的测定液相色谱 - 质谱 / 质谱法 ; NY/T 饲料中黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮和 T-2 毒素的测定液相色谱 - 串联质谱法 ; 伏马毒素 NY/T 饲料中伏马毒素的测定液相色谱串联质谱法 / 高效液相色谱法 ; DB51/T 饲料中伏马毒素 B1 的测定高效液相色谱法 ; DB22/T 玉米及其制品中伏马毒素的测定液相色谱 - 质谱 / 质谱法 ; SN/T 出口花生 谷类及其制品中黄曲霉毒素 赭曲霉毒素 伏马毒素 B1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 T-2 毒素 HT-2 毒素的测定液相色谱 - 质谱 / 质谱法 ; NY/T 饲料中伏马毒素的测定液相色谱串联质谱法 / 高效液相色谱法 ;

32 饲料中真菌毒素检测的相关标准

33 饲料中真菌毒素检测的相关标准 标准来源 : 食品伙伴网 ( 食安通

34 真菌毒素快速检测产品的应用 需要的仪器设备 小型粉碎机天平 (0.01~200g) 分样筛 移液器 振荡器 酶标仪胶体金读卡仪涡旋仪

35 真菌毒素检测实验室建设方案 需要的仪器设备 时间分辨荧光检测仪恒温培养箱冰箱 离心机 液质联用 (LC-MS) 纯水仪通风橱

36 真菌毒素检测实验室建设方案 1) 取样 : 粮食 饲料 真菌毒素在粮食和饲料中分布严重不均一的, 被污染的颗粒只占很小的比率, 但往往含量极高 ; 蛋白质在样品中的均匀分布 真菌毒素在样品中的不均一分布

37 加大采样量 如何降低样本误差 代表性样本 制样 误差就在这里, 不增也减少?!

38 2) 试样制备 粉碎 研磨 均质 混合参考 :GB/T /ISO 6498:1998 动物饲料试样的制备及 产品说明书 颗粒的大小直接决定了检测结果的准确性和稳定性, 有数据表明, 过 20 目筛即可 过细可能会带来更多的干扰 目 : 指每英寸筛网上的孔眼数目, 目数越大, 孔眼越多

39 邮箱 电话 : 微信 :wwj107

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