Oasis PRiME HLB-UPLC-MS-MS测定猪肉中78种兽药残留

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黄德凤, Kim Van Tran, Michael S. Young, Jeremy C.

快速该方法能清除掉样品中 99% 的磷脂类基质干扰物, 使得质谱分析的基质效应降到最低, 从而得到更稳定的数据结果更长的色谱柱生命周期更少的仪器维护和宕机时间摘要本实验使用一种新型固相萃取小柱 (Oasis

喹诺酮类 β- 受体激动剂类大环内脂类糖皮质激素类氯霉素类头孢类青霉素类性激素类等常见的 9 大类, 共 78 种兽药回收率在 50~130%, 精密度 RSD<20%(n=3) 该方法简单快速准确,

1 黄德凤, Kim Van Tran, Michael S. Young, Jeremy C. Shia 沃特世公司应用优势通过使用 Oasis PRiME HLB 这种独特填料的 SPE 技术, 第一次实现了猪肉组织中多种兽药同时分析的样品处理方法采用通过式的 SPE 净化策略, 使得样品处理过程简单方便快速该方法能清除掉样品中 99% 的磷脂类基质干扰物, 使得质谱分析的基质效应降到最低, 从而得到更稳定的数据结果更长的色谱柱生命周期更少的仪器维护和宕机时间摘要本实验使用一种新型固相萃取小柱 (Oasis PRiME HLB) 处理猪肉样品, 建立猪肉中多兽药残留同时检测的分析方法猪肉样品经 80% 乙腈水溶液提取,Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱通过式净化,UPLC -MSMS 检测结果表明, 磺胺类喹诺酮类 β- 受体激动剂类大环内脂类糖皮质激素类氯霉素类头孢类青霉素类性激素类等常见的 9 大类, 共 78 种兽药回收率在 50~130%, 精密度 RSD<20%(n=3) 该方法简单快速准确, 适合猪肉中多兽药残留的筛查分析沃特世解决方案 Oasis PRiME HLB SPE ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-S 系统 QUANPEDIA TM 数据库 AQUITY UPLC BEH C m 色谱柱关键词 Oasis PRiME HLB, 猪肉, 多兽药残留 ACQUTIY UPLC Xevo TQ-S 1

2 实验 UPLC 条件系统 : Waters ACQUITY UPLC I-Class FTN 色谱柱 : Waters BEH C 18 色谱柱 (2.1 x 100mm, 1.7 m) 流动相 : 母液,1 mol/l 乙酸铵溶液, ph=5; A: 母液稀释 100 倍的水溶液 ; B: 母液稀释 100 倍的甲醇溶液梯度 : 0 到 0.25 min,2% B; 0.25 到 min, 2% B 升至 99% B; min 到 min, 99% B;13.00 到 min, 99% B 到 2% B; 到 17 min,2% B 流速 : 0.45 ml/min 柱温 : 45 样品温度 : 10 C 进样量 : 5 L 质谱条件系统 : Waters Xevo TQ-S 离子源 : ESI+ 采集方式 : MRM 毛细管电压 : 3.5 kv 离子源温度 : 150 C 脱溶剂气温度 : 600 C 脱溶剂气流速 :1000L/h 锥孔气 : 150L/h 碰撞气流速 : 0.15mL/min 介绍兽药残留 (Veterinary drug residue), 是指动物在使用了兽药后, 蓄积或储存在动物细胞组织或器官内的药物原型有毒性的代谢物或杂质我国在畜牧养殖方面使用较多的兽药主要有磺胺类喹诺酮类 β- 受体激动剂类大环内脂类糖皮质激素类氯霉素类头孢类青霉素类, 性激素类等化合物滥用这些药物易造成畜牧产品的严重污染, 并通过代谢途径进入肌肉等动物源性食品中, 最终通过食物链在人体内蓄积, 并且这些药物具有导致过敏反应和使人体产生抗药性等副作用因此, 监测多种兽药在猪肉为代表的肉制品中的残留对保证食品安全具有积极意义目前, 相关标准和文献报道的多兽药残留的同时检测方法大多按照兽药种类分成若干种检测方法, 多种类的兽药同时检测分析受制于缺乏统一的前处理方法而不能实现同时, 开发多兽药残留同时检测的 LC/MSMS 仪器方法也具有相当的挑战性本方法中样品处理采用了沃特世最新的 Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱, 该产品创新的填料技术, 无需活化和平衡步骤, 能够去除蛋白盐磷脂等 95% 以上的基质干扰物, 即使是跟 HLB 相比, 它能够去除比 HLB 多 90% 的磷脂, 能够有效去除猪肉样品中的大部分基质干扰, 获得准确分析结果采用沃特世 UPLC/Xevo TQ-S 系统, 结合 QUANPEDIA 兽药筛查数据库, 建立稳定高效的多兽药残留 UPLC/MSMS 分析方法 MRM 条件见表 1 2

3 表 1. 各化合物 MRM 方法中文名英文名离子化方式离子对 (m/z) 锥孔电压碰撞能量磺胺苯吡唑 Sulfaphenazole ESI > ESI > 磺胺苯酰 Sulfabenzamide ESI > ESI > 磺胺醋酰 Sulfanilacetamide ESI > ESI > 磺胺恶唑 Sulfamoxol ESI > ESI > 磺胺二甲基嘧啶 Sulfamethazine ESI > ESI > 磺胺甲恶唑 Sulfamethoxazole ESI > ESI > 磺胺甲二唑 Sulfamethizole ESI > ESI > 磺胺甲氧哒嗪 Sulfamethoxypyridazine ESI > ESI > 磺胺甲氧嘧啶 Sulfameter ESI > ESI > 磺胺甲嘧啶 Sulfamerazine ESI > ESI > 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine ESI > ESI > 磺胺氯吡嗪 Sulfaclozine ESI > ESI > 磺胺氯哒嗪 Sulfochlorpyridazine ESI > ESI > 磺胺索嘧啶 Sulfisomidine ESI > ESI > 磺胺异恶唑 Sulfisoxazole ESI > ESI > 磺胺吡啶 Sulfapyridine ESI > ESI > 磺胺喹啉 Sulfaquinoxaline ESI > ESI > 磺胺嘧啶 Sulfadiazine ESI > ESI > 磺胺噻唑 Sulfathiazole ESI > ESI > 磺胺脒 Sulfaguanidine ESI > ESI > 甲氧苄啶 Trimethoprim ESI > ESI > 氨苯砜 Sulfadione ESI > ESI > 喹酸 Oxolinic acid ESI > ESI > 达氟沙星 Danofloxacin ESI > ESI > 恩诺沙星 Enrofloxacin ESI > ESI >

4 表 1. 各化合物 MRM 方法 ( 续 ) 中文名英文名离子化方式离子对 (m/z) 锥孔电压碰撞能量双氟沙星 Difloxacin ESI > ESI > 氟甲喹 Flumequine ESI > ESI > 环丙沙星 Ciprofloxacin ESI > ESI > 洛美沙星 Lomefloxacin ESI > ESI > 麻保沙星 Marbofloxacin ESI > ESI > 诺氟沙星 Norfloxacin ESI > ESI > 培氟沙星 Pefloxacin ESI > ESI > 沙拉沙星 Sarafloxacin ESI > ESI > 西诺沙星 Cinoxacin ESI > ESI > 氧氟沙星 Ofloxacin ESI > ESI > 伊诺沙星 Enoxacin ESI > ESI > 萘啶酸 Nalidixic acid ESI > ESI > 奥比沙星 Orbifloxacin ESI > 克伦特罗 Clenbuterol ESI > ESI > 莱克多巴胺 Ractopamine ESI > ESI > 沙丁胺醇 Salbutamol ESI > ESI > 特布他林 Terbutaline ESI > ESI > 西马特罗 Cimaterol ESI > ESI > 妥布特罗 Tulobuterol ESI > ESI > 氯丙那林 Clorprenaline ESI > ESI > 红霉素 Erythromycin ESI > ESI > 吉他霉素 kitasamycin ESI > ESI > 克林霉素 Clindamycin ESI > ESI > 林可霉素 Lincomycine ESI > ESI > 螺旋霉素 Spiramycin ESI > ESI >

5 表 1. 各化合物 MRM 方法 ( 续 ) 中文名英文名离子化方式离子对 (m/z) 锥孔电压碰撞能量泰乐菌素 Tylosin ESI > ESI > 替米考星 Tilmicosin ESI > ESI > 倍他米松 Betamethasone ESI > ESI > 倍氯米松 Beclomethasone ESI > ESI > 地塞米松 Dexamethasone ESI > ESI > 甲基泼尼松龙 Methylprednisolone ESI > 可的松 Cortisone ESI > ESI > 泼尼松 Meprednisone ESI > ESI > 氢化可的松 Hydrocortisone ESI > ESI > 泼尼松龙 Prednisolone ESI > ESI > 曲安奈德 Triamcinolone acetonide ESI > ESI > 氯霉素 Chloramphenicol ESI > ESI > 甲砜霉素 Thiamphenicol ESI > ESI > 氟苯尼考 Florfenicol ESI > ESI > 头孢噻肟 Cefotaxime ESI > ESI > 头孢噻呋 Ceftiofur ESI > 头孢匹林 Cephapirin ESI > ESI > 青霉素 V Penicillin V ESI > ESI > 氨苄青霉素 Ampicillin ESI > ESI > 邻氯青霉素 Cloxacillin ESI > ESI > 双氯青霉素 Dicloxacillin ESI > ESI > 左炔诺孕酮 Norgestrel ESI > ESI > (alpha-) 羟孕酮 17-hydroxyprogesterone ESI > ESI > 勃地龙 Boldenone ESI > ESI > 群勃龙 Trenbolone ESI > ESI >

6 表 1. 各化合物 MRM 方法 ( 续 ) 中文名英文名离子化方式离子对 (m/z) 锥孔电压碰撞能量睾酮 Testosterone ESI > ESI > 甲基睾酮 Methyl testosterone ESI > ESI > 诺龙 Nandrolone ESI > ESI > 样品处理取生鲜猪肉 2.50 g, 加入 80% 乙腈水溶液 10 ml, 旋涡震荡萃取 1 min, 超声波萃取 3 min,10000 r/min 高速离心 5 min, 取 5 ml 上清液直接加载到 6 cc 规格 PRiME HLB 固相萃取柱, 无需活化和平衡, 保持一秒一滴的流速, 收集全部流出液取 4.00 ml 流出液在 40 C 下氮气吹至小于 0.5 ml, 残留液体用 10% 甲醇水溶液定容至 1.00 ml, 过 0.2 m 微孔滤膜, 上 LCMSMS 测试结果与讨论净化效果猪肉中大量磷脂的存在, 极大地干扰目标化合物的分析, 同时降低色谱柱寿命, 增大仪器系统的维护成本和难度试验采用 Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱净化样品, 能有效去除磷脂等非极性干扰物同时, 采用通过式净化策略也极大地提高了样品分析通量通过扫描 m/z184 的母离子, 能近似得到磷脂类化合物的含量信息, 图 1 比较了经 PRiME HLB 净化前后的空白猪肉样品的磷脂监测信息图 1. 经 PRiME HLB 净化前后的空白猪肉样品的磷脂净化效果比较注 : 上图可以看出, 经过 SPE 净化以后的猪肉样品, 磷脂类化合物减少 99% 以上 6

7 仪器方法开发多残留分析的仪器方法开发费时耗力, 且常常带来实验室间方法开发的差异, 导致实验室间检测结果的差异本实验 UPLC/MSMS 方法的建立使用的 QUANPEDIA 数据库库中包含了 1000 多种化合物的 LC-MS/MS 方法, 这些化合物包含了几乎所有的食品检测所要求的农兽药种类 QUANPEDIA 数据库能够提供现成的仪器方法数据, 包括各化合物的从液相条件采集方法到定量处理方法的完整的方法包供实验人员调用, 免去用户的方法开发流程, 最大程度的减少了方法开发的难度和误差, 减少实验室的工作量和时间金钱成本方法回收率, 精密度和保留时间在空白猪肉中进行添加回收率测定添加 1.0 g/kg, 5.0 g/kg 和 10.0 g/kg 3 个浓度水平, 每个浓度水平添加 3 个平行样品, 按所建立的方法进行测定定量方法采用空白基质标准曲线, 外标法定量平均加标回收率, 精密度和保留时间见表 2 表 2. 各化合物的加标回收率 RSD(n=3) 及保留时间 1 µg/kg 5 µg/kg 10 µg/kg 中文名英文名回收率 RSD(%) 回收率 RSD(%) 回收率 RSD(%) 保留时间 (%) n=3 (%) n=3 (%) n=3 (min) 磺胺苯吡唑 Sulfaphenazole 磺胺苯酰 Sulfabenzamide 磺胺醋酰 Sulfanilacetamide 磺胺恶唑 Sulfamoxol 磺胺二甲基嘧啶 Sulfamethazine 磺胺甲恶唑 Sulfamethoxazole 磺胺甲二唑 Sulfamethizole 磺胺甲氧哒嗪 Sulfamethoxypyridazine 磺胺甲氧嘧啶 Sulfameter 磺胺甲嘧啶 Sulfamerazine 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine 磺胺氯吡嗪 Sulfaclozine 磺胺氯哒嗪 Sulfochlorpyridazine 磺胺索嘧啶 Sulfisomidine 磺胺异恶唑 Sulfisoxazole 磺胺吡啶 Sulfapyridine 磺胺喹啉 Sulfaquinoxaline 磺胺嘧啶 Sulfadiazine 磺胺噻唑 Sulfathiazole 磺胺脒 Sulfaguanidine 甲氧苄啶 Trimethoprim 氨苯砜 Sulfadione 喹酸 Oxolinic acid 达氟沙星 Danofloxacin 恩诺沙星 Enrofloxacin 双氟沙星 Difloxacin 氟甲喹 Flumequine 环丙沙星 Ciprofloxacin

8 表 2. 各化合物的加标回收率 RSD(n=3) 及保留时间 ( 续 ) 1 µg/kg 5 µg/kg 10 µg/kg 中文名英文名回收率 RSD(%) 回收率 RSD(%) 回收率 RSD(%) 保留时间 (%) n=3 (%) n=3 (%) n=3 (min) 洛美沙星 Lomefloxacin 麻保沙星 Marbofloxacin 诺氟沙星 Norfloxacin 培氟沙星 Pefloxacin 沙拉沙星 Sarafloxacin 西诺沙星 Cinoxacin 氧氟沙星 Ofloxacin 伊诺沙星 Enoxacin 萘啶酸 Nalidixic acid 奥比沙星 Orbifloxacin 克伦特罗 Clenbuterol 莱克多巴胺 Ractopamine 沙丁胺醇 Salbutamol 特布他林 Terbutaline 西马特罗 Cimaterol 妥布特罗 Tulobuterol 氯丙那林 Clorprenaline 红霉素 Erythromycin 吉他霉素 kitasamycin 克林霉素 Clindamycin 林可霉素 Lincomycine 螺旋霉素 Spiramycin 泰乐菌素 Tylosin 替米考星 Tilmicosin 倍他米松 Betamethasone 倍氯米松 Beclomethasone 地塞米松 Dexamethasone 甲基泼尼松龙 Methylprednisolone 可的松 Cortisone 泼尼松 Meprednisone 氢化可的松 Hydrocortisone 泼尼松龙 Prednisolone 曲安奈德 Triamcinolone acetonide 氯霉素 Chloramphenicol 甲砜霉素 Thiamphenicol 氟苯尼考 Florfenicol 头孢噻肟 Cefotaxime 头孢噻呋 Ceftiofur 头孢匹林 Cephapirin 青霉素 V Penicillin V 氨苄青霉素 Ampicillin 邻氯青霉素 Cloxacillin 双氯青霉素 Dicloxacillin

表 2. 各化合物的加标回收率 RSD(n=3) 及保留时间 ( 续 ) 1 µg/kg 5 µg/kg 10 µg/kg 中文名英文名回收率 RSD(%) 回收率 RSD(%) 回收率 RSD(%) 保留时间 (%) n=3 (%) n=3 (%) n=3 (min) 左炔诺孕酮 Norgestrel 43.4 5.0 47.8 4.1 40.9 7.2 8.

9 表 2. 各化合物的加标回收率 RSD(n=3) 及保留时间 ( 续 ) 1 µg/kg 5 µg/kg 10 µg/kg 中文名英文名回收率 RSD(%) 回收率 RSD(%) 回收率 RSD(%) 保留时间 (%) n=3 (%) n=3 (%) n=3 (min) 左炔诺孕酮 Norgestrel (alpha-) 羟孕酮 17-hydroxyprogesterone 勃地龙 Boldenone 群勃龙 Trenbolone 睾酮 Testosterone 甲基睾酮 Methyl testosterone 诺龙 Nandrolone 实验结论实验建立了同时测定 78 种兽药残留的分析方法分析结果满足猪肉中兽药残留相关法规的限量要求和回收率, 精密度要求 Oasis PRiME HLB 是一种新型的反相 SPE 吸附剂, 它能够去除样品中几乎所有的磷脂类非极性干扰物, 而且这种柱子使用起来无需活化和平衡, 整个实验流程更简单更快速更有效, 适合大批量日常分析检测 QUANPEDIA 数据库平台包含多兽药残留分析所需要的 LC-MSMS 方法, 为试验室仪器方法开发带来极大的便利扫一扫, 关注沃特世微信沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters, The Science of What s Possible, Oasis, ACQUITY UPLC, UPLC 和 Xevo 是沃特世公司的注册商标 QUANPEDIA 是沃特世公司的商标其它所有商标均归各自的拥有者所有 2015 年沃特世公司中国印刷 2015 年 7 月北京 : 上海广州成都香港免费售后服务热线 800 (400)

试验部分 1.1 仪器, 试剂与材料 Waters ACQUITY UPLC I-Class FTN Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱纯水机,Milli-Q 台式高速离心机漩涡震荡仪移液枪乙腈,HPLC 级 Oasis PRiME HLB 固相萃取柱,60 mg,3 ml 1.2 样

试验部分 1.1 仪器, 试剂与材料 Waters ACQUITY UPLC I-Class FTN Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱纯水机,Milli-Q 台式高速离心机漩涡震荡仪移液枪乙腈,HPLC 级 Oasis PRiME HLB 固相萃取柱,60 mg,3 ml 1.2 样 [ 应用纪要 ] 黄德凤,Kim Van Tran.,Michael S. Young,Jeremy C. Shia 沃特世公司应用优势样品处理方法可以同时净化不同种类的兽药残留 Quanpedia 数据库方便 LCMSMS 方法开发符合法规要求的方法灵敏度稳定的和精密度摘要本实验使用一种新型固相萃取小柱 (Oasis PRiME HLB) 处理牛奶样品, 建立牛奶中多兽药残留同时检测的检测方法