Simultaneous determination of 11 mycotoxins in malt by isotope internal standard-uhplc-ms/ms WANG Sha, KONG Wei-jun, YANG Mei-hua* (Institute of Medic

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篱秋
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1 同位素内标 - 超高效液相色谱串联质谱法检测麦芽中 11 种真菌毒素 * 王莎, 孔维军, 杨美华 ( 中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所, 北京 ) 摘要 : 采用同位素内标法定量, 建立了同时测定麦芽药材中 11 种真菌毒素污染水平的超高效液相色谱串联质谱法 (UPLC-MS/MS) 采用乙腈- 水 - 乙酸 (80:19:1, 体积比 ) 溶剂系统超声提取药材中真菌毒素, 离心过滤后, 加入 [ 13 C 17 ]-AFB 1 及 [ 13 C 18 ]-ZEN 标记的真菌毒素混合同位素标准溶液, 以含 0.1% 甲酸的甲醇溶液 -2 mmol L 1 乙酸铵水溶液为流动相于 Phenomenex Kinetex C18 色谱柱 (100 mm 2.1 mm,2.6 μm) 上梯度洗脱分离, 以电喷雾离子源正负离子切换模式多反应监测方式检测 (MRM) 结果表明,11 种真菌毒素在采用基质添加内标稳定同位素法定量时于各自的浓度范围内线性关系良好,r>0.9991, 加标回收率为 75.0%~ 117.0%,RSDs<5.1%, 检测限 (LODs) 和定量限 (LOQs) 分别为 0.05~30 mg kg 1 和 0.15~87.5 mg kg 1, 远低于欧盟规定的真菌毒素最大允许残留量 (MRLs) 所测的 20 批麦芽样品中,8 批检测到真菌毒素残留, 通过相同保留时间处的特征离子二级碎片排除了假阳性结果该方法的样品前处理过程简便快捷检测方法重现性好灵敏度高, 适用于复杂麦芽基质中多种真菌毒素的同时定性定量测定关键词 : 麦芽 ; 真菌毒素 ; 同位素内标 ; 超高效液相色谱串联质谱 ; 多反应监测中图分类号 :R917 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金面上项目 ( , ); 协和新星人才支持计划 * 通讯作者 Tel: , yangmeihua15@hotmail.com 1

2 Simultaneous determination of 11 mycotoxins in malt by isotope internal standard-uhplc-ms/ms WANG Sha, KONG Wei-jun, YANG Mei-hua* (Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing , China) Abstract: A suitable ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the determination of 11 mycotoxins with isotope internal standard in malt. The mycotoxins in malt were extracted and purified by one-step ultrasonic extraction procedure using acetonitrile/water/acetic acid (80:19:1, v/v/v), and then detected and confirmed by UHPLC-MS/MS, and quantified by isotope labeled AFB 1 ([ 13 C 17 ]-AFB 1 ) and ZEN ([ 13 C 18 ]-ZEN) internal standards. Rapid separation of the 11 mycotoxins was successfully achieved on a Phenomenex Kinetex C18 column (100 mm 2.1 mm,2.6 μm) with gradient elution using the mobile phase of methanol containing 0.1% formic acid and 2 mmol L 1 ammonium acetate in water. Simultaneous acquisition was performed in multiple reaction monitoring (MRM) mode with electrospray ionization (ESI) source operated in both positive and negative ionization modes. The established method expressed good linearity for the 11 mycotoxins within their respective linear ranges with correlation coefficients all higher than The average recoveries ranged from 75.0% to 117.0% with relative standard deviations (RSDs) below 5.1%. The limits of detection (LODs) and quantitation (LOQs) ranged from 0.05 to 30 mg kg 1 and 0.15 to 87.5 mg kg 1, respectively, which were below the maximum residue levels (MRLs) set by the European Union. Twenty malt samples were analyzed and eight samples were detected with mycotoxins, which were confirmed according to the same fragment ions found in positive samples and the standards at the same retention time. This study has demonstrated that the one-step extraction procedure of mycotoxins from complex matrices coupled to UHPLC-MS/MS method is simple, quick, accurate and sensitive for quantitative and qualitative analysis of multiple mycotoxins in malt. Key words: malt; mycotoxins; isotope internal standard; UHPLC-MS/MS; MRM 麦芽, 系禾本科植物大麦 Hordeum vulgare L. 的成熟果实经发芽干燥而成, 广泛分布于我国各地, 为营养价值较高的中药材其味甘, 性平, 归脾, 胃经, [1] 具有行气消食健脾开胃退乳消肿等功效最新药理研究表明, 麦芽除有抗结肠炎 [2] [3] 助消化回乳与催乳等作用外, 还能降血脂护肝脏抗真菌, 在临床研究与应用中发挥着极其重要的作用麦芽的生成是取净大麦先经清水浸泡 2

3 后, 每日淋水保持湿润, 待胚芽长至 2~3 mm 时, 取出晒干或低温烘干麦芽一般选择在低温且相对干燥的条件下进行贮存, 但贮存时间相对较长易导致麦芽吸收空气中的水分而变质从其生长及贮存环境来看, 麦芽极易污染真菌诱发霉变 [4], 进而产生黄曲霉毒素赭曲霉毒素伏马毒素等真菌毒素 [5] 这些真菌毒素具有严重的致畸致癌致突变等毒副作用和较强的体内蓄积性 [6, 7], 不仅会影响麦芽的质量和安全性, 也会严重危害人类健康为此, 中国药典 (2010 版 ) 规定麦芽等中药材中黄曲霉毒素总量不得过 10 mg kg 1, 黄曲霉毒素 B 1 (AFB 1 ) 的含量不得过 5 mg kg 1, 但是, 尚缺乏其他有害真菌毒素如赭曲霉毒素伏马菌素等的含量限度标准鉴于麦芽的良好药用和食用价值及其真菌毒素高频发强毒性强致癌性的现状, 建立准确可靠的分析方法同时测定麦芽中多种真菌毒素的污染水平已经迫在眉睫目前关于麦芽中真菌毒素的相关检测报道极少, 为此, 本研究采用同位素内标法定量, 结合简单快速的超声提取的样品前处理方法, 建立了基于正负切换的超高效液相色谱串联质谱法 (UHPLC-MS/MS) 同时测定麦芽药材中 11 种真菌毒素的污染水平, 为准确灵敏快速监测麦芽中真菌毒素污染状况, 保证药材质量和安全性有效性, 提供了可靠的方法参考和数据支持材料与方法仪器 ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪 ( 美国 Waters 公司 ),6500 QTRAP 型串联四级杆 - 线性离子阱复合质谱仪 ( 美国 AB SCIEX 公司 ), 配有电喷雾离子源 (ESI);5415 R 型冷冻高速离心机 ( 德国 Eppendorf 公司 );MS105DU 型半微量分析天平 ( 瑞士 Mettler 公司 );MS3 型涡旋混匀器 ( 德国 IKA 公司 );MX-RL-Pro 型旋转摇床混匀仪 ( 美国赛洛捷克公司 );WH-100 超声波清洗机 ( 济宁万和超声电子设备有限公司 ) 药品与试剂甲醇乙腈为色谱纯 ( 德国默克公司 ); 乙酸铵甲酸乙酸为色谱纯 ( 纯度 99.0%, 美国 Sigma 公司 ); 实验室用水为超纯水 ( 德国默克密理博公司 ); 黄曲霉毒素 B 1 (AFB 1, 以甲醇为溶剂, 5 μg ml -1 ) 黄曲霉毒素 B 2 (AFB 2, 以甲醇为溶剂,4 μg ml -1 ) 黄曲霉毒素 G 1 (AFG 1, 以甲醇为溶剂,4 μg ml -1 ) 黄曲霉毒素 G 2 (AFG 2, 以甲醇为溶剂,4 μg ml -1 ) HT-2 毒素 ( HT-2, 以乙腈为溶剂,40 μg ml -1 ) T-2 毒素 ( T-2, 以乙腈为溶剂,10 μg ml -1 ) 3

4 伏马毒素 B 1 (FB 1, 以乙腈 / 水 50/50 为溶剂,40 μg ml -1 ) 伏马毒素 B 2 (FB 2, 以乙腈 / 水 50/50 为溶剂,40 μg ml -1 ) 赭曲霉毒素 A(OTA, 以乙腈为溶剂,2 μg ml -1 ) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON, 以乙腈为溶剂,100 μg ml -1 ) 玉米赤霉烯酮 (ZEN, 以乙腈为溶剂,40 μg ml -1 ), 以上 11 种毒素的对照品原溶液购自新加坡 Pribolab 公司 ; 真菌毒素稳定同位素内标溶液 [ 13 C 17 ]-AFB 1 ( 以乙腈为溶剂,0.05 μg ml -1, 为全 13 C 标记 ) 和 [ 13 C 18 ]-ZEN( 以乙腈为溶剂,2.5 μg ml -1, 为全 13 C 标记 ) 购自 Sigma-Aldrich 公司 ; 购买的麦芽药材分别产于河北安徽河南黑龙江广东等地对照品溶液的制备真菌毒素混合对照品溶液 : 分别移取适量的 11 种真菌毒素标准对照品原液于 5 ml 容量瓶中, 用乙腈定容至刻度, 配制成含黄曲霉毒素 B 1 G 1 为 0.5 μg ml -1, 黄曲霉毒素 B 2 G 2 T-2 毒素赭曲霉毒素 A 为 0.2 μg ml -1, 脱氧雪腐镰刀菌烯醇为 10 μg ml -1, 玉米赤霉烯酮伏马毒素 B 1 为 2 μg ml -1,HT-2 毒素伏马毒素 B 2 为 1 μg ml -1 的混合储备液, 避光保存于 -20 用麦芽空白基质溶液逐级稀释配制成不同浓度系列的基质添加混合对照品溶液真菌毒素同位素混合对照品溶液 : 分别移取适量种真菌毒素稳定同位素溶液于 4mL 储液瓶中, 用水稀释至 2mL 配制成含 [ 13 C 17 ]-AFB 1 为 0.001μg ml -1, [ 13 C 18 ]-ZEN 为 0.01 μg ml -1 的稳定同位素混合标准溶液, 充分混匀后于 -20 避光保存 ( 使用前恢复至室温并用涡旋混匀器充分混匀 ) 样品制备取麦芽药材 5.0 g( 过 2 号筛 ), 精密称定 ( 精确到 g), 置于 50 ml 离心管中, 加入乙腈 - 水 - 乙酸 (80: 19: 1) 溶液 25 ml, 于旋转摇床混匀仪振荡提取 1.5 h 后, 超声波提取 30 min, 提取后以 r min 1 的转速高速离心 10min, 准确转移上清液 1.0 ml 于 1.5 ml 离心管中, 旋涡混匀后, 离心 ( 4,12000 r min 1 )10 min, 吸取上清液过 0.2 μm 的聚四氟乙烯滤膜吸取稳定同位素混合溶液 5 ml 于 250 ml 内插管中, 再加 100 ml 滤液 ( 吸取前要涡旋混匀 ), 涡旋混匀后供测定时使用色谱及质谱条件色谱条件 Phenomenex Kinetex C18 色谱柱 (100 mm 2.1 mm,2.6 μm ); 流动相为 2 mmol L -1 乙酸铵水溶液 (A 相 )- 甲醇 ( 含 0.1 % 甲酸,B 相 ), 梯度 4

5 洗脱,0~2 min,25 %~45 % B;2~10 min,45 %~90 % B;10~12 min,90 % B;12~12.1 min,90 %~25 % B;12.1~15 min,25 % B; 流速 0.3 ml.min 1 ; 柱温 35 ; 进样量 2 ml 质谱条件离子源为电喷雾离子源 (ESI), 扫描模式为多反应离子监测 (scheduled MRM) 正负切换同时扫描 ; 检测窗口时间范围为 1 min; 碰撞气 (CAD) 为 9 psi(1psi 6.9kPa); 雾化气 (Gas 1) 为 60 Psi; 辅助加热气 (Gas 2) 为 55 psi; 气帘气 (CUR) 为 35 psi; 离子源温度 (TEM) 为 550 ; 喷雾电压 (IS) 为 +5.5kV(positive) kv(negative) 保留时间监测离子对 (m/z) 及相关参数见表 1 使用 Analyst 软件进行数据采集及处理 Table 1 MRM transitions for 11 mycotoxins and 2 isotope internal standards. a Retention time; b Precursor ion; c Ion pair transition used for quantification, d Ion pair transition used for identification Analyte t R a Q 1 b Molecular Q3-1 c CE 1 Q3-2 d CE 2 DP EP CXP /min (m/z) ion (m/z) / V (m/z) / V / V /V /V AFB [M+H] AFB [M+H] AFG [M+H] AFG [M+H] HT [M+NH 4 ] T [M+NH 4 ] FB [M+H] FB [M+H] OTA [M+H] DON [M-H] ZEN [M-H] [ 13 C 17 ]-AFB 1 (IS) [M+H] [ 13 C 18 ]-ZEN (IS) [M-H] 结果 1 方法学验证 1.1 方法专属性分别取麦芽的阴性样品溶液和空白基质加标样品溶液在上述色谱 - 质谱条件下进行检测,11 种真菌毒素及 2 种同位素的 MRM 定量离子图, 如图 1 所示由分析结果可知,11 种真菌毒素峰型较好且得到良好分离, 阴性样品中未见被测峰所在保留时间的干扰峰, 且空白基质加标样品的结果表明基质成分不干扰被测真菌毒素的检测 5

6 Figure 1 MRM chromatograms of (A) blank malt samples, (B) fortified malt samples with the 11 mycotoxins scanned by positive MRM, and (C) fortified malt samples with the 11 mycotoxins scanned by negative MRM. 6

7 1.2 线性方程检出限和定量限基质添加 - 稳定同位素标准校正曲线是选取不含真菌毒素的空白样品, 按照样品制备中的预处理方法 ( 同样品制备方法 ) 准备空白基质溶液, 随后添加不同浓度的混合对照品溶液及相同浓度的同位素混合溶液标准校正曲线以对照品溶液的峰面积与同位素内标的峰面积之比 (Area Ratio) 为纵坐标, 进样浓度 (ng.ml 1 ) 为横坐标进行线性回归, 线性方程相关系数及线性范围见表 2 在最低添加浓度下, 以大于 3 倍信噪比 (S/N) 得出 11 种真菌毒素的检出限以大于 10 倍信噪比 (S/N) 得出 11 种真菌毒素的定量限, 见表 2 Table 2 Analytical parameters of the proposed UPLC-MS/MS method for 11 mycotoxins. Analyte Linear equation Linear range LOD LOQ r (ng ml 1 ) (ng ml 1 ) (ng ml 1 ) AFB 1 y = x AFB 2 y = x AFG 1 y = x AFG 2 y = x HT-2 y = x T-2 y = x FB 1 y = x FB 2 y = x OTA y = x DON y = x ZEN y = x 精密度配制一定质量浓度的基质添加混合对照品溶液 (0.5 ng ml -1 AFB 1, 0.2 ng ml -1 AFB 2,0.5 ng ml -1 AFG 1,0.2 ng ml -1 AFG 2,1.0 ng ml -1 HT-2,0.2 ng ml -1 T-2,2.0 ng ml -1 FB 1,1.0 ng ml -1 FB 2,0.2 ng ml -1 OTA,10.0 ng ml -1 DON,2.0 ng ml -1 ZEN), 同一天连续进样 6 次, 记录峰面积, 计算日内精密度相同对照品溶液连续 5 天进样, 记录峰面积, 计算日间精密度结果显示, 日内精密度和日间精密度的 RSD 值都分别低于 3.2% 1.4 加样回收率在麦芽阴性样品中, 分别添加低中高三个水平的 11 种真菌毒素的混合标准溶液, 每个水平重复 6 次, 按上述方法进行样品溶液的制备并测定, 计算各真菌毒素的回收率及相对标准偏差, 结果表明, 回收率为 75%~ 117%, 相对标准偏差为 0.1%~8.0%, 如表 3 所示 7

8 Table 3 Recoveries of 11 mycotoxins from fortified malt samples. Low Medium High Analyte Spiked /mg kg -1 Recovery RSD Spiked /mg kg -1 Recovery RSD Spiked /mg kg -1 Recovery RSD AFB AFB AFG AFG HT T FB FB OTA DON ZEN 实际样品检测运用上述前处理和分析方法对市售的 20 批麦芽样品进行检测, 结果显示有 8 批药材呈阳性, 检出的真菌毒素有 5 种,2 份样品检出黄曲霉毒素 AFB 1, 含量分别为在 0.47 mg.kg mg.kg -1 ;2 份样品检出 T-2 毒素, 其中 1 份含量为 1.76 mg.kg -1, 另外 1 份含量低于 LOQs;4 份样品均检出伏马霉素 FB 2,2 份样品含量分别为 0.89 mg.kg mg.kg -1, 另外 2 份含量均低于 LOQs;2 份样品检出赭曲霉毒素 A, 含量分别为 1.14 mg.kg -1 和 1.42 mg.kg -1 ;1 份样品中检出脱氧雪腐镰刀菌烯醇, 含量低于 LOQs 讨论为了提高 11 种真菌毒素在正负离子多反应监测下的分离度及离子化效率, 本研究分别比较了纯水醋酸铵水溶液作为弱洗脱溶剂 A 相, 纯甲醇纯乙腈含 0.1% 甲酸甲醇及含 0.1% 甲酸乙腈作为强洗脱溶剂 B 相结果表明, 纯水作为流动相 A 时离子化效率并不高, 加入不同浓度的醋酸铵溶液对离子化效率及分离度有明显影响, 但盐浓度太高会抑制离子化效率, 因此选择 2 mmol L -1 的醋酸铵水溶液作为流动相 A 与乙腈相比, 甲醇不仅大大改善了 AFB 2 与 AFG 1 AFB 1 与 FB 1 的分离度, 同时真菌毒素的离子化效率也较高由于伏马毒素含有羧基的特 8

9 殊性, 在酸性条件下才能将其从色谱柱上洗脱下来 [8, 9], 因此选择含 0.1% 甲酸的甲醇溶液作为流动相 B 真菌毒素的极性范围较广, 从极性最强的 DON 到疏水性较强的 FB 2, 因此需采用梯度洗脱在选择梯度条件时要考虑保留时间分离度及基质干扰等综合因素当初始有机溶剂含量较高时, 各毒素的灵敏度增高, 但极性化合物的保留时间过短, 整体分离度也同时降低, 当有机溶剂含量较低时, 会出现弱极性化合物峰形展宽等现象, 无法实现 LC-MS/MS 快速有效分离的目的尝试不同梯度洗脱条件, 最终选择 25% 甲醇作为初始浓度,90% 甲醇为最高洗脱浓度,12 min 完成 11 种真菌毒素的分离分析真菌毒素的理化性质麦芽药材的复杂成分等是决定提取溶剂的主要因素, 通常采用有机溶剂与水的混合液提取复杂基质中的真菌毒素麦芽药材中含有大量的酶类及生物碱类 [10], 对所检测的真菌毒素有一定的干扰作用将 20 ml 混标溶液添加到 5 g 样品中, 分别考察 80% 甲醇 80% 甲醇 ( 含 1% 乙酸 ) 80% 乙腈 80% 乙腈 ( 含 1% 乙酸 ) 的提取效率结果表明,80% 乙腈 ( 含 1% 乙酸 ) 作为提取溶剂时提取效率最高且受麦芽基质的干扰较小, 同时能满足真菌毒素的回收率目前对真菌毒素的净化方法中多采用固相萃取法免疫亲和净化法凝胶渗透净化法等由于真菌毒素种类较多, 采用上述几种方法不可避免会影响某些毒素提取效率本方法采用对麦芽样品振荡提取后经两次离心过滤, 直接对粗提取液进行进样分析, 保证了真菌毒素不会因为前处理方法而受损失, 保全了样品的真实性通过同位素内标校正, 所有真菌毒素的回收率都在 75% 以上, 消除了基质效应, 保证了分析方法的可靠性和耐用性为了校正样品前处理和离子化过程中的损失, 在内标化合物的选择上要考虑同目标分析物的结构理化性质尽可能相似, [11] 文献中报道有使用结构类似物如盐酸丁螺环酮及 2,4- 二羟基 -6(10- 羟基 -6-oxoundecyl) 苯甲酸 u- 内酯 (zearalanone) [12] 作为真菌毒素定量分析时的内标物, 但结构类似物的缺陷主要在于保留时间和离子化程度与待测分析物不同, 从而限制了结构类似物对待测分析物因基质效应而产生的信号增强或抑制的校正能力 [13] 本研究中使用 AFB 1 的同位素 [ 13 C 17 ]-AFB 1 作为正离子检测内标物,ZEN 的同位素 [ 13 C 18 ]-ZEN 作为负离子检测内标物, 同位素内标在其物理和化学性质与 9

10 待测分析物基本一致, 保证样品在制备提取进样以及质谱分析过程中产生的误差降到最低, 分析方法更加可靠本方法的检测限 (LODs) 为 0.05~30 mg.kg -1, 远低于欧盟所规定的真菌毒素的最大允许残留量 (MRLs), 为真菌毒素的测定提供高灵敏的分析方法, 保证了麦芽用药的安全性而实际麦芽所检出的真菌毒素种类除了药典规定的 AF 以外, 还包括另外四种真菌毒素是没有在药典中做出相关规定的同时, 除脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测含量低于 LOQ 以外, 其他 4 种毒素都出现含量高于欧盟所规定的真菌毒素的最大允许残留量 (MRLs), 这些真菌毒素的高毒性和高致癌性, 对于麦芽的安全使用存在巨大的潜在危险在对实际样品的检测结果发现在所测的 20 批药材中接近 40% 的麦芽受到了真菌毒素的不同程度的污染, 因此, 迫切需要建立和规范麦芽及其它中药材中多种真菌毒素的检测方法及限量标准, 改善我国中药材受真菌毒素的污染程度, 提高中药材整体的质量, 保证中药的用药安全 References [1] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People s Republic of China ( 中华人民共和国药典 ) [S] ed. Part I. Beijing: China Medical Science Press, 2010: 11. [2] Hanai H, Kanauchi O, Mitsuyama K, et al. Germinated barley food stuff prolongs remission in patients with ulcerative colitis [J]. Int J Mol Med, 2004, 13: [3] Wang CF, Zhang SJ, Liu YZ. 213 cases of modified biochemical decoction for delectation [J]. J Sichuan Trad Chin Med ( 四川中医 ), 2002, 20: 52. [4] Pitt JI, Marta H. Mycotoxin production in major crops as influenced by growing, harvesting, storage and processing, with emphasis on the achievement of food safety objectives [J]. Food Control, 2013, 32: [5] Zhu QY, Suo LL, Hu MH. Simultaneous determination of 7 mycotoxins in wheat flour by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry using isotope internal standard [J]. Mod Prev Med ( 现代预防医学 ), 2014, 41: , [6] Feng X, Kong WJ, Yang MH, Ouyang Z. Latest advancement for detection methods of mycotoxins in traditional Chinese medicine [J]. World Sci Technol-Modern Tradit Chin Med Mater Med( 世界科学技术 ), 2012, 14:

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DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI