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行奚
5 years ago
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1 中国生物工程杂志!" 过表达热休克蛋白提高细胞表达抗体的能力黄芬安小平李存何彰华张宝中米志强王娟童贻刚军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京 % 陕西师范大学生命科学学院西安 %& 摘要通过在中国仓鼠卵巢细胞 *+ 中过表达热休克蛋白 % 以提高其表达抗体的能力首先从中国仓鼠基因组,-' 中扩取 * % 基因构建真核表达质粒.,-' /#* % 再将重组质粒稳定转染到 *+0# 细胞中筛选获得稳定的细胞系运用 1 # 1 检测和分析 * % 基因的过表达在过表达 * % 的 *+ 细胞组和对照细胞组转染空载体.,-' / 的 *+ 细胞组中分别转染表达抗 #* 的质粒应用 234 ' 检测两组细胞表达抗 #* 的能力 1 # 1 结果显示实验组 *+ 细胞中 * % 基因的表达量明显高于对照组细胞 234 ' 检测结果表明过表达 * % 的 *+ 细胞组抗 #* 表达量高于对照组细胞 5/$ 研究揭示 * % 能有效促进细胞内分泌性蛋白的表达关键词 *+ 细胞 * % 抗体中图分类号 6%" 一切生物细胞包括原核细胞和真核细胞在受到高温缺血微生物感染组织创伤等应激时都会发生热休克反应可诱导产生一系列蛋白这类蛋白被称为热休克蛋白 7. * 因与热应激有关也被称为热应激蛋白 * 是一类高度保守的蛋白普遍存在于各类生物细胞中在细胞内的含量相当高约占细胞总蛋白的 $8 其功能是协助蛋白质的正确折叠与转运维持更新修复细胞结构参与细胞免疫等对细胞内环境的稳定有着重要的意义 * 被认为是生物在漫长的进化过程中保留下来对抗损害并进行自我保护的重要机制之一 * 按分子量大小可分为以下几个家族 * *!* %* & 及小分子 * 每个家族又有多个成员 * % 是 * 家族中最保守研究最为广泛收稿日期 #$# 修回日期 #%# 国家自然科学基金 "% 国家 "& 计划!'' 病原微生物生物安全国家重点实验室开放课题!' 资助项目共同第一作者通讯作者电子信箱 ( ) ( 的一种其功能主要是参与蛋白质的折叠亚基的组成蛋白质的降解等还可以调节靶细胞的活性和功能但 * % 不参与靶蛋白的组成所以也被称为分子伴侣随着研究的深入 * % 更多的生物学功能被逐渐揭示能够稳定细胞的结构 #$ 能够对抗细 &#" 胞的凋亡以及促进细胞增殖 % 在 * % 的生物学功能不断被发现完善的同时其应用前景也变的越来越广泛在医学领域如,-' 疫苗! 肿瘤免疫 # 炎症抑制遗传病治疗等方面均取得了较好的应用在环境监测等领域也有了初步的进展 * % 的生物学功能极为广泛可能存在着许多潜在的价值研究试探性的选取 *+ 细胞系为实验模型通过在 *+ 细胞中过表达 * % 探索其与细胞表达抗体能力的相关性实验先从中国仓鼠基因组,-' 中扩取 * % 基因构建真核表达质粒.,-' /# * % 再将真核表达质粒稳定转染到 *+0# 细胞中同时转染空载体.,-' / 做对照获得稳定细胞系后运用 1 # 1 检测 * % 基因的过表达情况然后在过表达 * % 的 *+ 细胞组和对照细胞组中分

2 ! 黄芬等过表达热休克蛋白 % 提高 *+ 细胞表达抗体的能力! 别转染表达抗 #* 的质粒最后应用 234 ' 检测两组细胞表达抗 #* 的能力结果显示实验组细胞 * % 基因的表达量明显高于对照组细胞过表达 * % 的 *+ 细胞组抗 #* 的表达量高于对照组细胞 5/$ 研究首次揭示了 * % 能有效促进细胞分泌性蛋白的表达同时建立了稳定的可提高抗体表达量的 *+0# 细胞系为有效提高目标抗体的产量奠定了新的平台材料与方法材料 *+0# 细胞真核表达载体.,-' / 表达抗 # * 的质粒由本室构建并保存大肠杆菌,*$ 质粒小量抽提试剂盒多功能,-' 纯化回收试剂盒购自北京博迈德生物技术有限公司限制性内切酶,-' 连接酶,-' 聚合酶,-' 标准品真核细胞总 1-' 提取试剂盒高糖,929 液体培养基 3.: '94-2 ; " 试剂盒均购自 1 公司检测乙肝表面抗体的 234 ' 试剂盒购自莱贝斯生物技术有限公司 * % 抗体购自碧云天生物技术研究所 23 发光试剂盒及, 膜购自 9. 公司其它试剂均为国产分析纯产品目的基因的扩取将贴壁生长的 *+0# 细胞用清洗两次然后用胰酶消化收集细胞按真核基因组提取试剂盒的步骤提取基因组,-' 参照 -4 数据库提供的基因序列设计引物同时引入合适的酶切位点上下游引物序列见表中的和 1 以提取的基因组,-' 为模板用引物 01 1 扩取 * % 基因 1 反应条件为!$ (!$ $ %! 循环 % $ ( 表研究中所用引物及其序列! "#! $% "& %! #"'!'%# ( ( < $= = ''; ' ;;'';''';;;' 1 '';' ' '' ' ;' ;; ; ' ;''' '' ';' 1 ' ;'';' ;; ; '''; ;';''; ;' 1 ; '' ;;' ';' 表达质粒的构建取纯化的 * % 1 产物和质粒载体.,-' / 分别用 1 > 双酶切处理回收两酶切产物并建立连接体系 & 连接过夜然后将连接产物转化大肠杆菌,*$ 用氨苄青霉素筛选阳性克隆转接阳性克隆过夜培养后提取质粒将质粒进行酶切鉴定获得构建成功的真核表达质粒.,-' /#* % 细胞培养与质粒转染 *+0# 细胞培养采用含 8 8 * 的,929 高糖培养液质粒的转染采用脂质体介导法设置组转染实验实验组转染重组质粒.,-' /# * % 对照组转染空载体.,-' / 阴性对照组不含质粒,-' 转染操作步骤如下取生长状态良好的 *+0# 细胞 "8 贴壁用无血清培养基清洗两遍将 " 质粒,-' 和 " 脂质体分别与无血清培养基混合 $ ( 之内充分混匀室温静置 ( 将混合液均匀的滴入相应的细胞培养皿中轻轻摇匀 % 培养 & 小时后更换为含有 ; " 终浓度为 $ 0( 的选择性完全培养基继续培养每? > 换液次稳定转染细胞克隆的筛选用含 ; " 的选择性完全培养基加压筛选阳性克隆当细胞开始大量死亡时更换含 ; " 终浓度为 0( 的培养基直至阴性对照组中的细胞全部死亡然后将实验组和对照组的贴壁细胞用胰酶消化转入!& 孔板中继续加压培养筛选出转染成功的单克隆细胞质粒转染结果的鉴定分别取实验组和对照组中用 ; " 筛选到的单克隆细胞扩大培养收集 $ & 个细胞提取细胞基因组,-' 设计一对鉴定引物上游引物设计在载体.,-' / 上下游引物 1 设计在 * % 基因内其详细序列见表以提取的基因组,-' 为模板用设计的引物 01 1 鉴定目的基因的稳定转染结果 1 反应条件为!$ (!$ $ % $ 循环 % $ ( ( 过表达的鉴定取已鉴定的稳定转染 * % 的细胞扩大培养收集 $ & 个细胞用试剂盒提取总 1-' 取总 1-' 以 + > " 为引物进行反转录再以,-' 为模板进行 1 反应引物用和 1 序列信息见表 1 反应条件为预变性!$ 1 反应!$ $ & 融解曲线分析从!$ 开始以 / 0

中国生物工程杂志 / -/! 的速度下降至 % )( 蛋白的 *!' " +' 分析取稳定转染 * % 的细胞系和未转染的 *+ 细胞收集约 $ & 个细胞用 14 ' 裂解液裂解细胞收集裂解液进行, # ';2 然后转, 膜进行分析, 抗 -.

之内当细胞长至 "8 时转染表达抗 #* 的质粒 & 后换液 " 后收集细胞上清用检测抗 #* 的酶联反应试剂盒检测各组细胞抗 #* 的表达量统计学分析采用 ($/ 软件对实验数据进行方差分析和多重比较图目的基因的 3 扩增 4 3 & '+"+ ' ' "' 9,-'9 7 * % 1.

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3 中国生物工程杂志 / -/! 的速度下降至 % )( 蛋白的 *!' " +' 分析取稳定转染 * % 的细胞系和未转染的 *+ 细胞收集约 $ & 个细胞用 14 ' 裂解液裂解细胞收集裂解液进行, # ';2 然后转, 膜进行分析, 抗 -.! 表达质粒的转染及 /01( 检测抗 #* 表达质粒为人源抗 * ' 抗体轻重链全长基因的双表达质粒质粒表达图谱见图转染 *+ 细胞可以获得抗 #* 全抗体将已鉴定的过表达 * % 的 *+0# 细胞单克隆和转染空载体的 *+0# 细胞单克隆通过细胞计数分别以 $ & 个细胞铺于孔板中每个克隆设置个重复孔之内当细胞长至 "8 时转染表达抗 #* 的质粒 & 后换液 " 后收集细胞上清用检测抗 #* 的酶联反应试剂盒检测各组细胞抗 #* 的表达量统计学分析采用 ($/ 软件对实验数据进行方差分析和多重比较图目的基因的 3 扩增 4 3 & '+"+ ' ' "' 9,-'9 7 * % 1. >< 表达质粒的构建与鉴定将目的基因克隆至真核表达载体.,-'/ 中构建表达质粒.,-'/#* % 用 1 和 > 双酶切鉴定电泳结果见图切下条带大小正确将酶切正确的质粒进一步测序鉴定序列比对结果与预期一致图 &56 -( 的酶切鉴定 4 3!'&'+"#!'+" "!!+ &56 -! 9,-'9 7.,-'/#* % 01 A > > 图轻重链双表达质粒示意图 #+%!+"! ## + ' "# 2 & " 9 9 ( 2 2 # ( * : 3 3..> 3#3 > - ( >:, > : ><.'. ' 4 ' : 检测转染细胞中的 ( 基因分别以转染.,-' /#* % 的 *+0# 细胞和转染空载体.,-' / 的 *+0# 细胞的基因组,-' 为模板用设计的鉴定引物 1 检测 * % 基因的转染结果引物间长度约 %$. 图中仅第三道成功扩增出目的条带电泳结果与预期一致结果目的基因的扩取以 *+0# 细胞基因组,-' 为模板应用设计的引物 1 成功扩取目的基因 * % 图条带单一特异性较好图 3 检测 ( 基因 4 3 & '+"+ ' ' "' 9,-' 9 7 * + :.,-' / 1. >< :.,-'/ * % 1. ><

4 ! 黄芬等过表达热休克蛋白 % 提高 *+ 细胞表达抗体的能力 3 -$ 3 检测转染细胞中 ( 的过表达分别提取两组细胞的 1-' 反转录成,-' 为模板再进行 1 检测结果如图 $ 所示成功转染.,-' /#* % 的 *+0# 细胞号线产生的 * % (1-' 明显多于转染空载体.,-' / 的 *+0# 细胞号线图目的片段的过表达 "'!+ +2 7!+" : > B.,-'/ * % :*+0.,-'/ : > *+0 *!' " +' 分析将细胞裂解样品进行还原, # ' ;2 电泳后转移到, 膜上做分析一抗采用的是 * % 单抗二抗是羊抗鼠的 4 ; 然后采用 23 方法曝光显色结果显示过表达 * % 的细胞系样品能有效检测到 * % 的表达图 & 图 ( 的 *!' " + '" 鉴定 *!' " + '" "!!+ ( 3 :* % 3 :*+ ) /01( 检测抗 -.! 的表达量抗 #* 酶联反应试剂盒运用 234 ' 方法检测抗 # * 采用纯化 * ' 包被反应板辣根过氧化酶 *1 标记的 * ' 为示踪物 9 显色系统双抗原夹心法检测上清中的抗 #* +, 值检测结果经 ( $/ 软件分析结果如图 % 所示过表达 * % 的 *+ 细胞组抗 #* 表达量明显高于对照组细胞 5/$ 讨论研究成功实现 * % 基因在 *+ 细胞中的过表达通过设置相应的对照试验应用 234 ' 检测细胞表达抗 #* 的能力探索了过表达 * % 对 *+ 细胞表图抗 -.! 的表达量 "'-.!!+" +@ # C. :*+0#* % ( *+0# <. 5/$ 达抗体能力的影响实验结果显示过表达 * % 的 *+ 细胞组抗 #* 的表达量高于对照组细胞 5 /$ 研究首次揭示了 * % 能有效促进细胞分泌性蛋白的表达一些研究提示 * % 可能有增强细胞内细胞器相关功能的作用使细胞能及时产生自身所需要的物质通过肾脏缺血预处理后产生的 * % 能有效减轻肾脏缺血再灌损伤 $ 在大鼠实验中用 * % 基因转染的供鼠心脏移植给受鼠后心脏功能明显改善并能对抗心脏缺血再灌损伤 & 短时间的缺血和热休克预处理肝脏可诱导 * % 的产生从而使肝脏缺血再灌注损伤减

5 中国生物工程杂志 / -/! 轻 % 因此有人推测 * % 调节 (1-' 转录的产物在核糖体的翻译能够促进蛋白质在高尔基体和内质网中的加工增强细胞分泌蛋白质的能力这可能是 * % 过表达促进细胞内抗体产生的主要作用机制 * % 作为分子伴侣能够维持和稳定蛋白前体的基本构象可以使蛋白保持一种松弛的伸展开来的结构以便进行蛋白的跨膜转运在协助蛋白进行跨膜转运等方面发挥着重要作用因此 * % 很可能在抗体的转运与分泌等过程中起到相应的促进作用 * % 可以与多种凋亡诱导因子结合阻断各种凋亡复合体的形成有效抑制细胞的凋亡 &#" 抗体的表达过程对于细胞本身来说通常是一种负荷这种负荷很可能会成为细胞凋亡的诱导源而 * % 的过表达能有效的抑制细胞的凋亡有利于延长单个细胞表达抗体的时间此外 * % 能够调节细胞分裂周期促进细胞的增值 % 相应的提高了单位时间内细胞的密度从 * % 已报道过的相应的生物学功能得出过表达 * % 后细胞表达抗体能力的提高可能是多层面共同促进的结果研究构建了稳定的过表达 * % 细胞系 1 的鉴定结果显示转染 * % 基因的 *+ 细胞组 * % (1-' 含量明显高于对照组细胞对照组 *+ 细胞中 * % (1-' 的含量极低这可能是由于细胞处于理想的培养状态没有发生相应的应激反应所以基因表达水平很低稳定的过表达 * % 细胞系的建立为有效提高目标抗体的产量奠定了新的平台研究首次证明 * % 能有效促进细胞分泌性蛋白的表达这将为 * % 的功能与应用研究开创新的思路参考文献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童贻刚 ) 以为靶标的抗肿瘤血管生成的研究 ) 北京中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 ) D ;) <> '# > ) ' > ( :9 9 > 4 < : 9 > 2.> ( ) $ 3.,' *< E B ';) : ( #. :< > 7 (< ) 9< " %#"$$) & ' 7( E 9) < < ( :(> < ( (. )E+ 9C : < &! $) % E 1 9< E )4>< : 7. >< ( > >(. #>< > < < < (> ) 9 >!! &! #! )

6 ! 黄芬等过表达热休克蛋白 % 提高 *+ 细胞表达抗体的能力 2!+"+ '( +&8 +' "% /" "&! +#%&'+"+ "' +# " "!!' 2! * '-; '- #. 34< *2 #< *'-;# 94 # '-;E< +-;D# 4 < :9 > 2.> ( ' > ( :9 9 > % :3: C- %&!' &'. >< : ( > B : > ( > C. :* 7 % *( +@ *+ ) * % B > : (*+0# * % C.. (>.,-' /#* % B < > > : > *+0# C. * % B > > C. :* % B > < 1 # 1)'#* ( > C.. (> B : > * % 234 'B. : ( >. >< :#* > )4> ( C. : * %. >< : ( > *+0# 5/$) 9 :+#! * 7 %; C. ' > 广告索引中原公司封面宝生物工程大连有限公司封二爱普拜斯应用生物系统贸易上海有限公司彩上海日泰医药设备工程有限公司彩广州市艾贝泰制药设备科技有限公司彩上海森松制药设备工程有限公司彩梅特勒托利多仪器上海有限公司彩 $ 9 中国有限公司彩 & 上海开放生物科技有限公司彩 % 镇江东方生物工程设备公司彩 "! 上海伯豪生物技术有限公司彩伯乐生命医学产品上海有限公司彩全球抗体聚焦峰会彩 9 1-' 技术及应用培训班彩安倍医疗器械上海有限公司第 % 期胶片彩中彩上海国强生化装备工程有限公司中彩慕尼黑上海分析生化展彩 ;2( B 7 封三纽英伦生物技术北京有限公司封底

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽