中 国 畜 牧 兽 医 卷 交叉保护力弱 疫苗免疫常常失去预期的效果 D 是冠状病毒科 冠状病毒属的成员 为单股正链 病毒 该病毒基因组的高突变率导致了 新基因型和变异株不断出现 D 是冠状病毒科的代表株 外被囊膜 其基因组为不分节段的正链单股 全长约 主要编码 种结构蛋白 纤突蛋白 小囊膜蛋白 /

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1 中国畜牧兽医! " 鸡传染性支气管炎病毒广西株 基因的克隆与序列分析 屈素洁 施开创 邹联斌 胡 杰 莫胜兰 尹彦文 张步娴 李 军 梁 媛 广西区动物疫病预防控制中心 南宁 摘 要 参照 <( 中鸡传染性支气管炎病毒 D 的核苷酸序列设计 对引物 利用!" 扩增 D 广西株的 " 基因片段 将其克隆到 ; 载体中 序列分析结果表明 " 基因全长为 编码 个氨基酸 近 端含有 个潜在的 糖基化位点 个跨膜区位于 % 肽段区 亲水区较疏水区更易变异 D 广西株与国内外 D 参考毒株相比 核苷酸序列同源性为 % 氨基酸序列同源性为 % 系统进化分析结果显示 D 广西株与 和 ' 两参考株位于同一个分支上 它们的亲缘关系较近 而与其他参考株属于不同的分支 亲缘关系较远 结果表明 D 广西株是 株新的 D 变异株 关键词 鸡传染性支气管炎病毒 " 基因 基因克隆 序列分析中图分类号 - 文献标识码 文章编号 )! 4 " %!'!'" '! ;! * ( &. ' (; &( * 8(. < 9 ' ' < -! * ) *! *!* - " ) 44&(" ( ( *(4( ( ( ( ( 4 ) &4 ) D * &( <( ( ) )() 8()(( (4&(" ( ()( 4 D *4( ) < 9 ) (8()( *(7!"&( 4&( *()( 4 8()( * ( 4 ;( 4) 4&( 4()( 4 * 8()( ( ( (&()( *4 &8(4&4 " ( ()*4&( D *4( 4( ) 8*7 7 *4( 4( 8()(* 4( ()74&(4() *4&)((4) () ( 8()(* 4( 4&( 4% ( 4()( D)4 84& 4&(&7) &* 47)( 8()(( ()4& 4&4 4&( &7) & 47)( " )(84&4&44&() * &( D 4) 4&(&*( *(4( ( ( ( 4&( *4( 8()( 4% 4% )( ( 4(*7&( &7*( (4 4)(( *7 &8(4&448 * (*7)(*4(4 ' * 4()( 4 () 44(* (4()( 4) &( 84&4&())(()( ( 4) & 4 4)(*4 & &( ()( *4 ( 4(4&44&( *4(8 (8) 4 D %-! ( 4 ) &4 ) " ( (( ( * ( ( ( ( *7 鸡传染性支气管炎 ( 4 ) &4 是由鸡传染性支气管炎病毒 ( 4 ) &4 ) D 引起的一种急性 高度接触性传染病 该病毒主要侵害鸡的呼吸系统 消化系统和泌尿生 殖系统 可以引起雏鸡死亡 蛋鸡产蛋量及蛋品质下 降 给养禽业造成巨大的经济损失 D 抗原性异常复杂 临床毒株较多 不同毒株在毒力 致病性和组织嗜性上存在着很大差异 不同血清型毒株间 收稿日期 基金项目 广西区水产畜牧兽医局科技项目 桂渔牧科 % 作者简介 屈素洁 % 女 广西南宁人 高级兽医师 研究方向 畜禽传染病学及分子病毒学 /* ( 通信作者 梁 媛 % 女 广西南宁人 高级兽医师 研究方向 畜禽传染病学及分子病毒学 /*%%%

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷 交叉保护力弱 疫苗免疫常常失去预期的效果 D 是冠状病毒科 冠状病毒属的成员 为单股正链 病毒 该病毒基因组的高突变率导致了 新基因型和变异株不断出现 D 是冠状病毒科的代表株 外被囊膜 其基因组为不分节段的正链单股 全长约 主要编码 种结构蛋白 纤突蛋白 小囊膜蛋白 / 膜蛋白 ; 和核衣壳蛋白 其中 ; 蛋白是含量最丰富的结构蛋白 占病毒蛋白总量的 左右 由 个氨基酸组成 横跨囊膜 大部分位于囊膜内侧 约 的 端暴露于囊膜外并被糖基化形成 连接的寡聚糖 对病毒的传染性具有决定性的作用 并可 形成抗原决定簇 研究结果表明 ; 蛋白的功能还与病毒的复制有关 在病毒装配期间 将核衣壳连接到囊膜上 在病毒的出芽中也发挥重要的作用 % 并可诱导补体依赖性免疫中和反应 本研究对广西分离的 株 D 分离株进行 " 基因全序列的测定和分析 以期为中国 D 的分子流行病学研究奠定基础 材料与方法. 材料 病毒株和鸡胚 D 广西株 < 9 为广西动物疫病预防控制中心 年从广西某地采集的大量可疑组织病料中分离出来的 株具有一定地方代表性的毒株 由广西动物疫病预防控制中心保存! 鸡胚由广东华农动物保健品股份有限公司提供 试剂 提取试剂盒!" 4 ;DD() 胶回收试剂盒 /9' 酶 ; 载体均购自 公司 质粒提取试剂盒 大肠杆菌 感受态细胞均购自 ( 公司 其他试剂均为国产分析纯. 引物设计与合成参照 <( 中 D 的 " 基因序列 登录号 % 设计 对引物 ;; 用于扩增 " 基因全长 序列为 ;"< <""" < ""< ; """ " " " " " 预期扩增目的片段大小约为 引物由 公司合成. ;7 的增殖及其 /" 的提取将 < 9 株接种 日龄! 鸡胚 > 培养 & 后 弃 & 内死胚 无菌收集尿囊液 > ) 离心 取上清液 ) 离心 & 弃去大部分上清液 管底留约 ' 吹打混匀 即得病毒液 取 ' 病毒 按说明书用 提取试剂盒提取病毒总. 病毒 基因的 )/ 扩增按!" 4 ;DD() 使用说明书进行反转录 合成的 于 > 保存备用!" 反应体系 '!" ()' /9' 酶 ' 上 下游引物 *' 各 ' 模板 ' 加 至 '!" 反应条件 % > 预变性 % > 变性 > 退火 > 延伸 共 个循环 > 延伸 反应结束后取 '!" 产物用 琼脂糖凝胶进行电泳 观察扩增结果. 基因克隆 鉴定和测序产物纯化连接 ; 载体后 转化大肠杆菌 感受态细胞 进行阳性克隆的筛选与鉴定 以重组质粒为模板 ;; 为引物 对所提取的质粒进行!" 鉴定 将阳性重组质粒送至 公司进行测序. 基因序列同源性比对与系统进化树分析运用 4) 和 ' 软件对测得的 " 基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与 <( 中收录的 % ; ((4( ) %% <)7" ' < % D - <( 登录号分别为 % % % % % % -% 个 D 毒株 " 基因核苷酸及其编码的氨基酸序列进行同源性比对分析及构建核苷酸序列的系统进化树 运用!)4( 模块中的 <) () 方法预测 ; 蛋白的二级结构 运用!)4( 模块中的!*4/ 方法预测 ; 蛋白的抗原指数 运用!)4( 模块中的 74(*4*( 方法预测 ; 蛋白的亲水性 应用在线软件 ; ;; ()() 对 ; 蛋白跨膜区进行预测 应用在线软件 (4 <*7 对 ; 蛋白的糖基化位点进行预测 结果与分析. 基因的 )/ 扩增经琼脂糖凝胶电泳 " 基因的!" 产物大小约 图 与预期扩增片段大小相符

3 ! 期 屈素洁等鸡传染性支气管炎病毒广西株 4 基因的克隆与序列分析 */7 Y! 9&&&D YH. & %! %( 株&!阴性对照! &! Y 9&&&D YH. % %(K H -&! DXH S 图! 基因的 JG 扩增结果!I JG < 9!! 基因克隆与鉴定 将重组质粒进行 4 鉴定!电泳结果显示扩出 株推导 的 Y 蛋 白 氨 基 酸 序 列 含 有 7 个 高 度 保 守 的 半胱氨酸' %( 株 与 国 内 外?h 参 考 株 进 一条约 /&Q< 的 片 段!与 预 期 片 段 大 小 一 致!表 明 行同源性 比 对 分 析!结 果 显 示! %( 株 与 国 目的基因已克隆到质粒载体上' 内外?h 参 考 株 的 核 苷 酸 序 列 同 源 性 为 *' (_ &! 基因的克隆测序及同源性比对分析 将 %( 株 4 基因的阳性重组质粒进行 7' _!其 中 与 ;?& 株 的 同 源 性 最 高!为 7 ^_ &与 疫 苗 株 %&( 的 同 源 性 较 低!同 源 测序得到 4 基因的 [> 全核苷酸序列'将获 得的 %( 株的 4 基 因 序 列 提 交 `-?H-.!序 列 性在 7' %_ 7' _ 之 间 "图 ' %( 株 登录号为 ]P&&%/' 序 列 分 析 结 果 表 明!4 基 因 [> 全长 (/Q<!编码 个氨基酸' %( ^/_7' %_ "图 *' 与国内 外?h 参 考 毒 株 氨 基 酸 序 列 的 同 源 性 为 图!!?YU 广西株与参考株 基因核苷酸序列同源性比对!!Q / 9 < > K< 9?YU*<. E 9?YU 7

4 *& 中!国!畜!牧!兽!医 )* 卷! 图 &!?YU 广西株与参考株 基因氨基酸序列同源性比对 > >< > > K< 9?YU*<. E 9?YU &!Q / 9 7 %! 基因的系统进化分析 根据?h 4 基 因 的 核 苷 酸 序 列 差 异 性!将 为美国 变 异 株 4L!P!它 与 其 他 分 离 株 同 源 系 较 远!形成一个相对独立 的进 化群' %( 株 与 %( 株与国内外已发表的 %( 株 毒株 建 立 系 统进化树'结果显示 4 基因可分为 ) 个 基因 群!其 ;?& 和 9O) 两 个 参 考 株 位 于 同 一 个 分 支 上!它 们的亲缘关系较近&而 与 其 他 参 考 株 属 于 不 同 的 分 中第 % 群为 ` HU(] 等 基 因 型 为 ` HU 的 标 准 毒 株&第 群 为 中 国?h 分 离 株&第 * 群 包 括 %&( 支!亲 缘 关 系 较 远 "图 )' 提 示 %( 株 与 ;?& 和 9O) 离 株 可 能 来 源 于 同 一 毒 株!其 在 遗 Y)%( 等基因型为 YH K K 型 的 标 准 毒 株&第 ) 群 传演变过程中发生了变异' 图 %!?YU 基因的系统进化树 %!J7 9?YUC > (!; 蛋白二级结构和跨膜区预测分析 运用 H- 模块中的 `H!QK- 方法预 区域由 %* 个氨基酸组成!无规则卷曲区的最大区 测 Y 蛋白的二 级 结 构! %( 株 Y 蛋 白 的 无 规则卷曲和 %!转角区 分 布 特 点 为 呈 零 星 分 布!多 数 氨基酸&!转 角 区 的 最 大 区 域 为 7/%&( 位 氨 基 酸 % 肽段区!它包含 7 个氨基酸'?h 的 Y 蛋白 为跨 膜 域为 D 端 %&(/%% 位 氨 基 酸 肽 段 区!它 包 含 / 个

5 ! 期 屈素洁等鸡传染性支气管炎病毒广西株 4 基因的克隆与序列分析 *% 蛋白! %( 株 Y 蛋 白 有 * 个 跨 膜 区! *个跨 膜区位于 */7 肽段区' ]U! 方法预测 Y 蛋 白 的 亲 水 性!Y 蛋 白 前 & 个左 右 氨 基 酸 为 亲 水 性 的!具 有 较 强 的 抗 原!; 蛋白抗原性与糖基化位点预测分析 运用 H- 模块中的!GC 方法预测 Y 性!第 &%&& 个 基 本 上 为 疏 水 性 氨 基 酸!在 4 端 蛋白的 抗 原 指 数!抗 原 指 数 较 高 区 域 主 要 分 布 于 %/%*( *7/)( ///(( %&/%%&( %%*/%&( %// %*&( %)/%%( %/( %(%/%/%( %/)/%&( %//%7/( &(/%( 肽 段 区 "图 ' 运 用 H- 模 块 中 的 的%/(&% 位有一 段 很 强 的 亲 水 性 氨 基 酸 "图 (' 由于亲 水 区 与 蛋 白 抗 原 位 点 的 形 成 有 密 切 关 系! %( 株 Y 蛋 白 可 能 具 有 较 好 的 抗 原 性' %( 株 Y 蛋 白 D 端 含 有 个 潜 在 的 D!糖 基化位点!分别为 D]P 和 D4P' 图 (!; 蛋白的抗原指数分析 (!4 >. 9; / 图!; 蛋白的亲水性分析!Q7> / 9; / 7 7 的缺失或替代引起!可能会对 Y 蛋白的 抗原 性产 生 影响' &! 讨! 论 近年来!中国? 的 流 行 呈 上 升 趋 势!尤 其 是 肾 型(腺胃型? 已 蔓 延 到 许 多 地 区!造 成 了 严 重 的 经 济损失'目前!一般都是采用弱毒疫苗对? 进行 免 疫预防!而自然条件 下 疫 苗 毒 株 与 野 生 毒 株 之 间 可 发生重组'因此? 已 成 为 养 禽 业 最 难 控 制 的 疫 病 之 一'本试验对?h %( 株的 4 基因进行 了克隆和序列测定!并将序列与 `-?H-. 中公 布的 同源性 比 对 分 析 结 果 表 明! %( 株 与 %( 株国内 外 参 考 毒 株 的 4 基 因 核 苷 酸 同 源 性 为 *' (_7' _!其中与 ;?& 株 的 同 源 性 最 高! 与疫 苗 株 %&( 的 同 源 性 较 低' %( 株 与 国 内 外?h 参 考 毒 株 氨 基 酸 的 同 源 性 在 ^/_ 7' %_ 之 间' 在 系 统 进 化 树 中!`IH! 株与 株( 株位于同一个 分支 上! %( ;?& 9O) XW %( 株?h 序列的 4 基 因 进 行 了 同 源 性 比 对 分 析! 结果表明 %( 株 的 4 基 因 长 为 (/Q<!编 它们的亲缘关系较 近!但 与 其 他 参 考 毒 株 的 亲 缘 关 码 个氨基酸!含有 7 个高度保守的半胱氨酸!在 重组现象'由此推测! %( 株 可能 是 % 株 新 的变异株'这一现象表明!在免疫压力下!常能在免 疏水区形成了 * 个跨膜区域!对维持 Y 蛋白 的结 构 和 功 能 可 能 具 有 重 要 作 用!这 与 文 献 报 道 的 一 致 %&!%%' Y 蛋 白 是 一 种 糖 基 化 蛋 白!在 Y 蛋 白 的 D 端有 % 个 糖 基 化 位 点' 糖 基 化 位 点 的 增 加 或 %! %* 减少对 Y 蛋白的 抗 原 性 产 生 很 大 影 响 'Y 蛋 白糖基化位 点 处 的 氨 基 酸 序 列 "D4P是 高 度 保 守 的' %( 株的 Y 蛋 白 在 D 端 形 成 个 D! 糖基 化 位 点!氨 基 酸 序 列 不 仅 有 D4P!还 存 在 有 D]P'这 个 D!糖基化 位 点 的 改 变 可 能 是 由 碱 基 系均较远'这 提 示?h 国 内 分 离 株 间 存 在 着 同 源 疫鸡群中分离到新毒株!这些毒株通过基因点突变( 基因重组(基因缺失和基因插入等方式发生变异后! 一旦在环境中适应!则很可 能 成 为 决 定?h 新 的 变 异 株 流 行 趋 势 的 重 要 因 素 %)' 本 试 验 对?h %( 株 4 基 因 进 行 克 隆 和 序 列 测 定!为?h 广西分离株遗传变异分析和分子流行病学调查 提供了重要材料!也为制订?h 的 综 合 防 制 措 施 提 供了依据'

6 中 国 畜 牧 兽 医 卷 参考文献 殷 震 刘景华 动物病毒学 ; 第 版 北京 科学技术出版社 %% ' * ) ) ( &4 4&(74( & 44&( (()( 4()( )4)7 7 )( % '* 余 娟 刘兴友 王玲丽 鸡传染性支气管炎病毒致病机理的研究进展 中国畜牧兽医 4 &4 (( ((4*!4&( 47 4)* 4) ( 4 ) &4 ) *!* )!)) &"(4* (*) 4 ( 4 ) &4 ) )( *4 ))( 4 4&)((()( 4 4) * %%% 卡尔尼卡 禽病学 ; 第 % 版 北京 北京农业大学出版社 %% " &") ) D*7 *7 ( 4( ( 4&() *7 ( 4((4( 4)(4&()* &)( *% % '!' &( * ) ) (*7(4( 4&( ) ) ( 4 ) &4 ) ( (* ( )4( 4&( )(<* )4( 4 &7 * 4() 4 (48(( 4&( ( (* () ( )4( * % <( ; '' '' (4* (*7 ( 47 ) ) * ( )4 *( ))7 ( 4 ) &4 ) ; )4( 刘胜旺 贺秀瑗 孔宪刚 等 鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株 " 基因的分子特征 中国预防兽医学报 贺秀媛 张淑霞 张君涛 等 鸡传染性支气管炎病毒 株膜蛋白基因的分子特征 西北农林科技大学学报 自然科学版 % % ; ; ) (*; /*(7 ;(4* *( 4( ( ( (( 4&(() ( )4( 4&( D 4) % % 4() (4 ") ) )4( 4) 4)( 4 4&(* &)( 4&( ( 4 ) &4 ) *7 )4( *%. "& '(4* 7() *7 *( *)( (*7 ( 4 ) & 4 ) ) "&.!! * % 责任编辑 吴 艳

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