2011,31(1) 刘晓志等 : 利用 FRET 技术研究 Hepcidin 和 Fpn 相互作用 57 Taq 酶,T 4 DNA 连接酶, 限制性内切核酸酶为 TaKaRa 公司产品 ; 核酸分子质量 Marker 等为华美公司产品 ; 质粒小量提取试剂盒胶回收试剂盒为上海华舜公司产品 ;

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筐韦
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2011,31(1):56?60 利用 FRET 技术研究 Hepcidin 和 Fpn 相互作用 1,2 刘晓志 3 赵会景 1,2 陈伟斌 1 常彦忠 1 段相林 (1 河北师范大学分子神经生物学及神经药理学研究所石家庄 ) (2 华北制药集团新药研究开发中心石家庄石家庄市第四十一中学石家庄 ) 摘要铁是生命必需的微量元素,feroportin(Fpn) 是小肠吸收细胞铁释放的重要蛋白新近发现肝脏分泌的抗菌多肽 hepcidin 具有调节肠铁吸收的重要作用, 但目前尚缺少 Fpn 和 hepcidin 发生作用的实验依据应用荧光共振能量转移技术 (fluorescenceresonanceenergytransfer,fret) 对 hepcidin 和 Fpn 之间的作用关系进行了深入研究首先进行了 hepcidin CFP 融合蛋白表达载体的构建及表达鉴定 ; 然后对含 YFP,Fpn YFP 基因动物细胞表达载体的构建表达和 FRET 检测实验结果证实 hepcidin 和 Fpn 之间存在直接的相互作用, 并发现两种蛋白发生相互作用后 hepcidin 也在细胞质中有分布为临床治疗铁代谢紊乱性疾病提供了新的治疗策略和重要理论依据关键词荧光共振能量转移 (FRET) 铁调素 (hepcidin) Fpn(feroportin) 中图分类号 Q78 铁是生命必需的微量元素, 它在能量代谢 DNA 合成和氧的运输等生命过程中发挥着重要作用缺铁可引起贫血等严重的临床疾病, 但是铁在细胞内过量聚积又会产生活性氧自由基, 进而损伤细胞和组织, 因此机体维持铁离子水平的稳态, 保持生命活动的正常运转显得尤为重要 [1] 机体铁稳态的维持依赖于机体对铁吸收转运储存和细胞内铁流通的协同调节然而由于机体不存在有效的铁排泄机制, 肠铁吸收调节成为维持机体铁稳态的主要的环节分布在十二指肠上皮吸收细胞 ( 以下简称, 吸收细胞 ) 内的 feroportin(fpn) 是铁从吸收细胞内释放入血的重要蛋白 [2 3] 最近发现, 肝脏分泌的抗菌多肽 hepcidin 具有调节肠铁吸收的重要生理功能有研究认为 hepcidin 可能是通过作用于 Fpn, 进而调节了小肠对铁的铁吸收功能 [4], 但至今仍缺少可靠的实验佐证, 确证 hepcidin 和 Fpn 之间的作用关系, 将为揭示小肠铁吸收调节机制及临床治疗铁代谢紊乱疾病提供理论和实验依据, 具有重要的理论意义和现实意义收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 河北省自然科学基金 (C ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :xlduan0311@163.com FRET(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET) 是用于研究生物大分子空间相互作用的重要技术之一, 可用以测量 1.0~6.0nm 的距离, 而蛋白质分子之间如果有相互作用, 其分子间的距离通常都小于 6.0nm, 大于 6.0nm 则被认为两者之间没有相互作用, 因此 FRET 又被称为光学分子尺由于 FRET 技术具有可靠性强, 重复性好等诸多优势, 现已成为研究活细胞大分子之间相互作用的重要技术手段之一 [5] 为了确证 hepcidin 和 Fpn 之间有没有相互作用, 我们分别构建了 hepcidin CFP 和 Fpn YFP 两种表达质粒, 并在大肠杆菌和动物细胞中表达了 hepcidin CFP 和 Fpn YFP 两种融合蛋白, 然后再将纯化的 hepcidin CFP 加入转染表达 Fpn YFP 的动物细胞中, 利用激光共聚焦显微镜观察记录, 经过数据计算和分析确认两种蛋白之间能够发生 FRET 相互作用 1 材料与试剂 hepcidin 和 FpncDNA 为本室保存 ;YFP 和 CF PcDNA 由河北师范大学化学学院刘德龙教授惠赠 ; 大肠杆菌 DH5α BL21 菌株为本室保存 ;CaCo 2 和 SH SY5Y 细胞均购自中国科学院上海细胞生物学研究所

2011,31(1) 刘晓志等 : 利用 FRET 技术研究 Hepcidin 和 Fpn 相互作用 57 Taq 酶,T 4 DNA 连接酶, 限制性内切核酸酶为 TaKaRa 公司产品 ; 核酸分子质量 Marker 等为华美公司产品 ; 质粒小量提取试剂盒胶回收试剂盒为上海华舜公司产品 ; 无内毒素质粒大量提取试剂盒为 TIANGEN 公司产品 ;Ni NTA 亲和层析柱为

2 2011,31(1) 刘晓志等 : 利用 FRET 技术研究 Hepcidin 和 Fpn 相互作用 57 Taq 酶,T 4 DNA 连接酶, 限制性内切核酸酶为 TaKaRa 公司产品 ; 核酸分子质量 Marker 等为华美公司产品 ; 质粒小量提取试剂盒胶回收试剂盒为上海华舜公司产品 ; 无内毒素质粒大量提取试剂盒为 TIANGEN 公司产品 ;Ni NTA 亲和层析柱为 Novagen 公司产品 ; 其他试剂为进口分装或国产分析纯引物合成由上海生物工程公司完成, 本实验所用引物如下 (5 3 ): P1:CGGGATCCCGACACCAACTTCCCCA P2:CATGCCATCGGTGTTTTGCAACAGATACCAC P3:CCGCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCG P4:GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG P5:CGGGATCCATGACCAAGTCAAGAGATCAGAC P6:CCGCTCGAGCACAACAGATGTATTAGGCTGAC TTTCAT 2 方法与结果 2.1 hepcidin CFP 融合蛋白表达载体的构建及表达鉴定以 hepcidincdna 为模板,P1/P2 为引物, 进行 PCR 扩增, 在 5 和 3 端分别引入 BamHⅠ 和 NcoⅠ 酶切位点扩增条带为 96bp( 没有电泳图谱 ), 将其回收, 连于 pucm T 载体上, 测序结果 PCR 产物中 hepcidin 序列与 GeneBank 公布的序列一致用 BamHⅠ 和 NcoⅠ 酶切 PCR 产物, 将目的序列插入 prsetb CFP 质粒载体, 构建 hepciding CFP 质粒 ( 添加质粒构建成功电泳图谱 ), 将 hepciding CFP 质粒转化大肠杆菌 DH5α, 在含有氨苄青霉素的 LB 培养基上 37 培养过夜挑取转化子, 提质粒 DNA( 添加质粒构建成功电泳图谱 )BamHⅠ 和 NcoⅠ 双酶切鉴定阳性克隆将鉴定的阳性克隆质粒转化大肠杆菌 BL21 菌株, 进行表达将构建好的重组质粒 prsetb hepcidin CFP, prsetb CFP 在大肠杆菌中诱导表达通过测定诱导不同时间菌液荧光强度的变化情况, 确定当诱导 3h 后荧光趋于稳定, 所以选择 3h 为诱导的最佳时间将全细胞破碎液过 Ni NTA agrose 层析柱, 纯化目的蛋白 2.2 含 YFP,Fpn YFP 基因动物细胞表达载体的构建和表达以含有 YFP 质粒的 cdna 为模板,P3/P4 为引物, 进行 PCR 扩增, 在 5 和 3 端分别引入 XhoⅠ 和 KpnⅠ 酶图 1 SDS PAGE 电泳检测 Fig.1 SDS PAGEelectrophoresis 1,marker;2.8,BL21 colibacteriaproteins;3.6,purifiedprotein hepcidin CFP; 4,pRSETB hepcidin CFP induced protein; 5, purifiedproteincfp( purifiedprotein);a.purificationhepcidin CFPprotein;B.purificationCFPprotein 切位点扩增条带为 720bp 左右 ( 添加质粒成功电泳图谱 ), 将其回收, 连于 pucm T 载体上, 测序结果表明, 扩增产物序列与 GeneBank 公布的序列一致以含有 Fpn 质粒的 cdna 为模板,P5/P6 为引物, 在 5 和 3 端分别引入 BamHⅠ 和 XhoⅠ 酶切位点, 进行 PCR 扩增扩增条带为 1700bp 左右 ( 添加质粒成功电泳图谱 ), 将其回收, 连于 pucm T 载体上测序结果表明,PCR 产物中 Fpn 序列与 GeneBank 公布的序列完全一致用 BamHⅠ 和 XhoⅠ 酶切 PCR 产物和 ptarget YFP 质粒, 分别回收外源片段和载体 (1700bp 6350bp),T 4 DNA 连接酶 4 连接过夜 ( 外源片段 : 载体 =3:1), 连接产物转化大肠杆菌 DH5α, 在含有氨苄青霉素的 LB 培养基上 37 培养过夜挑取转化子, 提质粒 DNA,BamHⅠ 和 XhoⅠ 酶切鉴定阳性克隆将 ptarget YFP 和 ptarget Fpn YFP 重组质粒分别转染 CaCo 2 细胞和 SH SY5Y 细胞,36h 后荧光显微镜下观察 CFP 表达情况 2.3 FRET 检测将成功转 Fpn YFP 基因的 CaCo 2 或 SH SY5Y 细胞培养液中加入 CFP 或 hepcidin CFP 蛋白, 终浓度为 0.5μmol/L 正常培养 4.5h 后进行 Confocal 测量利用双通道比值法测定 hepcidin CFP 以及 Fpn YFP 两种蛋白之间的相互作用, 即分别计算加 hepcidin CFP 与单独加 CFP 的比值 Ratio=Acceptor Em/Donor Em, 在 CFP/YFP 这个供体受体对中,CFP 为供体 (donor),yfp 为受体 (acceptor) 本文构建了 hepcidin CFP 和 Fpn YFP 质粒, 酶切结果及序列测定结果都表明, 构建的两种融合表达质粒是成功的, 将两种成功构建好的质粒转化大肠杆菌

58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No.12011 图 2 激光共聚焦显微镜观察 (100X) Fig.2 Laserscanningconfocalmicroscope(100X) CaCo 2orSH SY5Y celstransfected with ptarget YFP or ptarget Fpn YFPplasmid.A.

01)( 比值法 ) Fig.4 FRETmeasurementofhepcidin CFPand Fpn YFP(CaCo 2)( p<0.

hepcidin CFP 和 Fpn YFP 融合蛋白为 FRET 检测 hepcidin 和 Fpn 的相互作用提供了良好的基础图 5 Hepcidin CFP 与 Fpn YFP(SH SY5Y 细胞 ) FRET 测量 ( 比值法 ) Fig.

3 58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No 图 2 激光共聚焦显微镜观察 (100X) Fig.2 Laserscanningconfocalmicroscope(100X) CaCo 2orSH SY5Y celstransfected with ptarget YFP or ptarget Fpn YFPplasmid.A.B,CaCo 2celstransfectedwith ptarget YFP;C.D,CaCo 2celstransfectedpTARGET Fpn YFP;E.F,SH SY5YcelstransfectedwithpTARGET YFP;G.H, SH SY5YcelstransfectedwithpTARGET Fpn YFP;A.C.E.G, corespondingtransmisionpictures 图 4 Hepcidin CFP 与 Fpn YFPFRET 测量 ( p<0.01)( 比值法 ) Fig.4 FRETmeasurementofhepcidin CFPand Fpn YFP(CaCo 2)( p<0.01)(donor Em/Acceptor Em) 后, 表达目的蛋白, 对目的蛋白纯化后, 洗脱液收集于 2mlEP 管中, 因为目的蛋白在可见光下即被激发而发射荧光, 所以肉眼即可监测洗脱峰的出现, 表现为十分醒目的浅绿色 ( 图 1) 用 SDS PAGE 对洗脱液进行检测, 发现存在一条明显的诱导条带, 分子质量与预计的一致, 纯度大于 95%, 表明构建的质粒能成功的表达 hepcidin CFP 和 Fpn YFP 融合蛋白为 FRET 检测 hepcidin 和 Fpn 的相互作用提供了良好的基础图 5 Hepcidin CFP 与 Fpn YFP(SH SY5Y 细胞 ) FRET 测量 ( 比值法 ) Fig.5 FRETmeasurementofhepcidin CFPand Fpn YFP(SH SY5Y)(Donor Em/Acceptor Em) B.F,Donor Em;C.G,Acceptor Em;D.H,FRET; A.E,Corespondingtransmisionpictures 图 3 hepcidin CFP 与 Fpn YFP (CaCo 2 细胞 )FRET 测量 ( 比值法 ) Fig.3 FRETmeasurementofhepcidin CFPand Fpn YFP(CaCo 2)(Donor Em/Acceptor Em) B.F,Donor Em;C.G,Acceptor Em;D.H,FRET; A.E,Corespondingtransmisionpictures 细胞转染后发现, 约 10% 的转染细胞表达 CFP, 表现为细胞发出黄绿色荧光用激光共聚焦显微镜观察, 转染 ptarget YFP 的细胞发出黄绿色荧光, 荧光均匀分布在整个细胞中 ( 图 2B.F) 而转染 ptarget 图 6 Hepcidin CFP 与 Fpn YFP(SH SY5Y 细胞 ) FRET 测量 ( p<0.01)( 比值法 ) Fig.6 FRETmeasurementofhepcidin CFPandFpn YFP (SH SY5Y)( p<0.01)(donor Em/Acceptor Em) Fpn YFP 的细胞发出的黄绿色荧光较弱, 荧光主要聚集在细胞膜周围分布 ( 图 2D.H) FRET 检测结果表明, 在转 Fpn YFP 基因的 CaCo 2

4 2011,31(1) 刘晓志等 : 利用 FRET 技术研究 Hepcidin 和 Fpn 相互作用 59 细胞培养液中加入 CFP 蛋白和加入 hepcidin CFP 相比, 受体与供体荧光强度比值从上升到 0.987( 图 3 图 4) 在转 Fpn YFP 基因的 SH SY5Y 细胞培养液中加入 CFP 蛋白和加入 hepcidin CFP 相比, 受体与供体荧光强度比值从上升到 0.893( 图 5 图 6) 对转 Fpn YFP 基因的 CaCo 2 细胞和 SH SY5Y 细胞的实验中, 在 FRET 通道中, 如图 3 和图 5 所示,B.F 为供体通道 ;C.G 为受体通道 ;D.H 为 FRET 通道 ;A.E 为相应的透射图片记录图像, 加入 CFP 的实验对照组 FRET 通道的图像中, 荧光在细胞质中的分布较多 ( 图 3 和图 4 中的 D); 加入 hepcidin CFP 实验组的 FRET 通道的图像中, 荧光在细胞质和细胞膜中都有分布 ( 图 3 和图 4 中的 H) 对 FRET 通道进行对比和计算, 在细胞膜上的比值变化比较大对 FRET 通道图像进行修正发现, 在 CaCo 2 细胞和 SH SY5Y 细胞实验中, 加入 CFP 的实验对照组 FRET 通道图像的信号较弱, 在加入 hepcidin CFP 的实验组 FRET 通道的图像中信号较强, 主要集中在细胞膜上 3 结论利用大肠杆菌表达纯化后的融合蛋白 hepcidin CFP, 具有和 CFP 一致的荧光性质转染 YFP 或 Fpn YFP 基因的 CaCo 2 或 SH SY5Y 细胞可以表达荧光蛋白, 性质稳定经过鉴定, 两种融合蛋白荧光性质稳定, 可进行 FRET 的研究在转染表达 Fpn YFP 的动物细胞培养液中, 加入纯化的 hepcidin CFP, 利用激光共聚焦显微镜观察记录结果经分析计算 hepcidin 和 Fpn 之间存在着直接的相互作用初步的分析显示, 两者发生相互作用的位置在细胞膜上本实验首次利用 FRET 技术证实了 hepcidin 和 Fpn 之间存在直接的相互作用,hepcidin 和 Fpn 形成复合物后一起内化到细胞质中在细胞质中,hepcidin 和 Fpn 的结合力下降, hepcidin 脱离 Fpn 的束缚, 分布在细胞质中 4 讨论 hepcidin 是一种广泛存在于真核生物体内的调节激素, 在调节体内帖代谢方面具有重要的作用, 人们推测 hepcidin 是通过与下游 Fpn 蛋白的相互作用维持机体的铁平衡, 越来越多的实验结果也证明了这一点, 所以研究 hepcidin Fpn 蛋白的相互作用对我们在分子水平上认识铁代谢的机理具有重要意义荧光共振能量转移 (FRET) 是在 F rster 能量转移理论基础上发展起来的生物学技术, 它可以在生物体内进行实时及定量研究, 因而被广泛应用于蛋白质结构和功能分析核酸检测等方面虽然目前研究蛋白蛋白相互作用的方法很多, 如亲和层析免疫共沉淀凝胶阻滞法荧光光谱法酵母双杂交等, 但由于 FRET 法可以在多种细胞类型中定量研究蛋白蛋白相互作用, 具有前面几种方法不可比拟的优点 [6 7], 所以近年来广受推崇另外 FRET 可以在基因水平上构建一些荧光探针, 并与成熟的转基因技术相结合将荧光探针导入生物体内, 从而大大提高了荧光探针导入的成功率, 避免了如显微注射等导入方法对细胞造成的伤害目前在细胞中用 FRET 已经检测了多种蛋白的相互作用, 成为一种研究蛋白相互作用的有利工具 [8 10] 本文选用双通道比值法的测量方法该计算方法简单易行, 只要测量供体受体两个通道的比值即可, 能够直接反映蛋白之间的距离变化 Fpn 蛋白广泛分布于机体多种组织中, 其主要功能可能与机体的铁代谢有关此外,Fpn 也可能参与转运锌铜等金属离子铁转运紊乱导致的疾病如斑马鱼的低血色素贫血, 人的遗传性血色素沉着症等均与 Fpn 异常有关现有研究显示,Fpn 在十二指肠绒毛细胞的基底膜, 特别是肠绒毛顶端吸收细胞的基底膜有表达, 在空肠回肠不表达最近研究显示,hepcidin 就是通过使 Fpn 从细胞膜内化到细胞质中控制铁的输出但 hepcidin 发挥作用后的去向如何? 尚未见报道, 本研究设计了上述实验, 观察了 hepcidin 迁移的情况研究结果显示, 标记 hepcidin 的 CFP 在细胞的细胞质中出现, 标记 Fpn 蛋白的 FITC 的荧光也有在细胞膜集中分布, 转而在细胞质中散在分布因此, 我们认为,hepcidin 发挥作用后, 同 Fpn 一起内化到细胞的细胞质中我们认为,hepcidin 和 Fpn 发生相互作用, 并致使 Fpn 内化到细胞质中的过程为 : 当 hepcidin 在血液中达到一定浓度后,hepcidin 和 Fpn 在细胞膜靠近, 发生直接的接触,hepcidin 和 Fpn 形成复合物后一起内化到细胞质中在细胞质中,hepcidin 和 Fpn 的结合力下降, hepcidin 脱离 Fpn 的束缚, 分布在细胞质中细胞实验结果显示 :hepcidin 和表达在 CaCo 2 和 SH SY5Y 细胞中的 Fpn 之间发生了 FRET, 两个蛋白发生了直接的相互作用通过分析 FRET 通道, 进行修正后发现, 两者之间在细胞膜发生直接的相互作用但是两者在分子结构上的作用位点还需要进一步的

5 60 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No 研究以 SH SY5Y 和 CaCo 2 两种不同类型的细胞作为实验材料, 两者得到相同的结果说明 hepcidin 和 Fpn 蛋白在肠道和脑中的生理功能具有较高的一致性,Fpn 很可能就是 hepcidin 的受体参考文献 [1]DurandPY.Irontherapy:isitdiferentwithperitonealdialysis comparedtohaemodialysis?.nephrolther,2006,2suppl5: [2]WalaceDF,DixonJL,RammGA,etal.Anovelmutationin feroportinimplicatedinironoverload.journalofhepatology, 2007,46(5): [3]AtanasiuV,ManolescuB,StoianI.Hepcidin centralregulator ofironmetabolism.eurjhaematol,2007,78(1):1 10. [4] ChaudhuriS, Banerjee A, Basu K, etal. Interaction of flavonoidswithredbloodcelmembranelipidsand proteins: Antioxidantand antihemolyticefects. InternationalJournalof BiologicalMacromolecules,2007,41(1): [5]JiD,LvW,HuangZ,etal.Fluorescenceresonanceenergy transferimagingofcfp/yfp labeledndh incyanobacterium cel.journalofluminescence,2007, (2007): [6] Chirio lebrunm C,PratsM.Fluorescenceresonanceenergy transfer (FRET): theory and experiments. Biochemical Education,1998,26(4): [7]SlimaneTA,FontangesP,TrugnanG.GFP,FRAP,FLIP, FRET,PRIM,FLASH ect.new microscopictechniquesusing newfluorescentprobes.anoverview.biologyofthecel,1999, 91(3): [8]MunishkinaLA,FinkAL.Fluorescenceasamethodtoreveal structuresandmembrane interactionsofamyloidogenicproteins. BiochimicaBiophysActa,2007,1768(8): [9]TheodorsonE.Haemochromatosis,hepcidinanddisordersofiron metabolism:fieldsofsubstantialclinicalrelevanceandcurent advances..scandjclinlabinvest,2006,66(2): [10]ChenY,O DonoghueMB,HuangYF,etal.Asurfaceenergy transfernanorulerformeasuringbindingsitedistancesonlivecel surfaces.journalofamericanchemicalsociety,2010,132(46): TheStudyoftheInteractionBetweenHepcidinandFpnbyFRET LIUXiao zhi 1.2 ZHAOHui jing 3 CHENWei bin 1,2 CHANGYan zhong 1 DUANXiang lin 1 (1TheInstituteofMolecularNeurobiologyandNeurpharmacology,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang ,China) (2NorthChinaPharmaceuticalGroup,NewDrugResearchandDevelopmentCenter,Shijazhuang ,China) (3TheNO.41MiddleSchoolofShijiazhuangCity,Shijazhuang ,China) Abstract Ironisanesentialtraceelementoflife,feroportin(Fpn)istheintestinalabsorptionofiron releaseofimportantcelproteins.newlydiscoveredantimicrobialpeptidehepcidinsecretedbythelivercan regulatetheimportantroleofintestinalironabsorption,butstilplayaroleinthelackoffpnandexperimental basisforhepcidin.sofluorescenceresonanceenergytransfertechnology(fluorescenceresonanceenergytransfer, FRET)ontheroleofhepcidinandFpnrelationshipbetweenthedepthstudy.Firstofal,werehepcidin CFP fusionproteinexpresionvectorandidentification;thenwithyfp,fpn YFPgeneinanimalcelexpresion vector,expresion,andfretdetection.theresultsconfirmedthathepcidinandfpndirectinteractionbetween, andfoundthattwoproteinsinteractinthecytoplasm afterthedistributionofhepcidinalso.theresultsforthe treatmentofdisordersofironmetabolism toprovideanew and importanttheoreticalbasisfortherapeutic strategies. Keywords Fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET) Hepcidin Feroportin(Fpn)

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

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2011,31(1) 刘晓志等 : 利用 FRET 技术研究 Hepcidin 和 Fpn 相互作用 57 Taq 酶,T 4 DNA 连接酶, 限制性内切核酸酶为 TaKaRa 公司产品 ; 核酸分子质量 Marker 等为华美公司产品 ; 质粒小量提取试剂盒胶回收试剂盒为上海华舜公司产品 ;