中国生物工程杂志!" 新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证杜寿文李昌王宇航任大勇刘存霞孙丹丹朱娜李沂秦艳青金宁一吉林大学畜牧兽医学院长春 ' 军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春摘要目的构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体 )*+,

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贻章
5 years ago
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1 中国生物工程杂志!" 新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证杜寿文李昌王宇航任大勇刘存霞孙丹丹朱娜李沂秦艳青金宁一吉林大学畜牧兽医学院长春 ' 军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春摘要目的构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体 )*+, 并对其功能进行验证方法设计一个包含人巨细胞病毒启动子 -*).(. % 启动子信号肽基因血凝素 + 表位基因 /+ 多克隆位点区域 -0 #( 抗原表位血小板来源的生长因子受体跨膜区域 1 - 及牛生长激素多腺苷酸化信号 /) + 等八种元素的表达盒 ). 在其上下游添加酶切位点后进行人工化学合成连接到克隆载体 ) / 中得 ) /# 用酶切 ) /# 回收 2) 左右的片段去磷后插入到 )*+, 的相应位点及 3 酶切鉴定获得新型基因疫苗真核表达载体 )*+, 然后以增强型绿色荧光蛋白 1 为报告基因将其分别构建至两个不同的表达盒内脂质体转染 / # 细胞利用 #1 及荧光显微镜技术进行该载体的功能验证结果两个表达盒内的 1 基因在 / # 细胞均能高效表达相互间不受影响且新构建的表达盒具有蛋白展示功能结论成功构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体 )*+, 为多价 4+ 疫苗的研究奠定了坚实基础关键词 )*+, 1 双基因表达盒功能验证中图分类号 5%&' 4+ 疫苗是继灭活疫苗弱毒疫苗和亚单位疫苗之后产生的一种新型疫苗由于 4+ 疫苗不仅能够激活机体产生全面免疫应答包括特异性的细胞免疫和体液免疫应答而且具有较高的安全性加之其制备生产工艺简单且易于储存是当前疫苗研究的一个热点和重点领域目前已有针对 /* /6* 等病原体引起的疾病及肿瘤的基因疫苗的研究有的已经进入临床因为基因疫苗均是通过不同的载体运送至机体内从而载体是基因疫苗研究的关键目前常用的真核表达载体有 ) 4+ 系列载体 ) ) )6 0 等但上述载体或插入外源基因比较单一不能实现多基因表达或含有 0*" 启动子由于 0*" 收稿日期 #$#$ 修回日期 #%#& 国家自然科学基金 & " 军内十一五科技攻关项目 ' % 吉林省高新技术产业发展项目长春市科技特派员行动计划! " 资助项目通讯作者电子信箱 ' ( %& ' ( 启动子的引入使载体可作为附加体在表达 0*" 大抗原的细胞内复制安全性降低 " 为避免上述不足发展了基于 ) 4+ 7 的新型载体 )*+, 去除了对于外源基因在大肠杆菌中复制和在动物细胞内表达无关的序列最大限度的减小了载体上与人类基因组同源及整合到染色体的可能性该载体是经 + 批准的可用于人体的安全性真核载体但该载体依然存在外源基因插入的有限性这一不足因此对 )*+, 进行改造即在其基础上再添加一个具有外源基因展示功能的表达盒构建含有双基因表达盒的真核表达载体 )*+, 不仅可达到构建多价疫苗的需要而且可以使表达的外源基因展示到细胞表面更有利于刺激机体产生免疫应答新添加的表达盒包含八种元素即来源于人巨细胞病毒 -* 增强型启动子 % 启动子分泌信号肽血凝素 + 表位 /+ #( 抗原表位血小板来源的生长因子受体跨膜区域 1 - 牛生长激素多腺苷酸化信号

2 ! 杜寿文等新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证 $ /) + 多克隆位点区域 -0 位于 /+ 与 # ( 之间该表达盒具有将表达蛋白分泌并锚定在细胞膜表面的能力将新设计的表达盒连到 )*+, 上然后以增强型绿色荧光蛋白 1 为报告蛋白验证新构建的载体的表达功能为多价 4+ 疫苗的研究奠定基础材料与方法菌种质粒和细胞大肠杆菌菌株 /$ 质粒 )*+,)*+,# 1 )- & # 1 及 / # 细胞由本研究室保存试剂与仪器限制性核酸内切酶!" 等 " 4+ 连接酶 8 酶等均为公司产品碱性磷酸酶为 2 公司 4+ 凝胶回收试剂盒为 +,9 4 公司产品 - - 为 / 公司产品胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限公司质粒小量制备试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司 :); ( - 脂质体为 6. 产品反转录酶 - -:* 购自 1.( 公司总 4+ 提取试剂盒为上海生工生物工程有限公司产品荧光显微镜为 () 公司产品核酸浓度测定仪购自.( 公司表达盒的设计与合成基于所设计表达盒的特性选用了八种不同的结构组分序列如图所示其中 % ' 2) 为人巨细胞病毒启动子 -* ).(. '"" '' 2) 为 % ).(.3).( %" &$2) 为信号肽区域可引导外源蛋白分泌至细胞膜 &' & 2) 为血凝素 + 表位 / ( + )) & &! 2) 为多克隆位点区域 -0 在对 )*+, 载体序列进行分析的基础上设计依次为 #$% $ &!! 2) 为 #( 抗原表位! ' %$2) 为血小板来源的生长因子受体跨膜区域 1 - && %2) 为牛生长激素多腺苷酸化信号 /) + 基因并在上述基因序列两端添加酶切位点 &%'%'! 基因全长 2) 送上海捷瑞生物工程有限公司合成命名为 ) /# 的构建与鉴定小量提取 ) /# 质粒并用 # 进行鉴定而后用酶切 ) /# 回收 2) 大小的片段去磷后将其连接至用相同酶切的 )*+, 载体上转化 /$ 挑单克隆菌落小量提取质粒用酶切鉴定正确后再用 3 双酶切鉴定插入序列的正反向将新构建的载体命名为 )*+, 并对新添加的酶切位点进行分析含有报告基因的质粒构建与制备用!" 3 双酶切 )*+,# 1 用 3 双酶切 )- & # 1 分别回收约 %$2) 左右的片段并将其分别克隆入 )*+, 载体对应的酶切位点之间即将 1 分别连入 )*+, 原表达盒和新构建的表达盒中命名为 )*+, # 1 和 )*+, # 1 转化 /$ 挑单克隆菌落小量提取质粒分别用!" 3 3 对重组质粒进行鉴定常规方法大量制备 )*+, # 1 和 )*+, # 1 质粒并用 "<1 &#- 进行纯化分光光度计法检测重组质粒的浓度及 ' 3 & 值 ' 3 & 值介于 7& 7 时质粒可用于细胞转染体外表达检测用 $< 胎牛血清的 - - 培养 / # 细胞转染前于 ' 孔细胞培养板中加入 / # 细胞 = $ 个 3 孔待细胞生长至 &<!< 融合时取 " 重组质粒 )*+, # 1 )*+, # 1 利用 :); ( - 脂质体转染 / # 细胞同时设质粒载体 )*+, 对照 %> $< 环境下培养 "& 荧光显微镜下观察是否有绿色荧光!" # 鉴定重组质粒转染 / # 细胞方法同 7'"& 后应用总 4+ 提取试剂盒提取细胞总 4+ 在反转录酶的作用下反转录成 4+ 以此为模板扩增 1 基因上游引物下游引物在转录水平鉴定 1 在 / # 细胞中的表达结果构建与鉴定将合成的表达盒插入到 )*+, 载体上的酶切位点处图构建含两个基因表达盒的真核表达载体 )*+, 3 鉴定结果显示图新添加的表达盒与 )*+, 上原表达盒的方向一致并用 #$% $ 对新添加的酶切位点

3 ' 中国生物工程杂志 * 7 47! 图新设计表达盒结构模式及序列图 $%&' () *+,)-., (/ 0, 1 -$(, + - ) -$%, ) 0.. ( ; ) ; ).

! 杜寿文等新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证 % 进行分析图 " 结果显示以上限制性内切酶中除外均可把 )*+, 线性化且为单一条带表明所设计酶切位点有效且可用 "

" 和和位点处并用相应的限制性内切酶进行鉴定图 $ 图 ' 条带大小均与理论值相符表明构建成功图质粒的构建图 $%&#(,- $(,(/*+- $) 图 " 酶切鉴定

. )*+, # 1 图酶切鉴定 $%& ), $/$ + $(,(/ - $ $(,, )$% - $(, - : 4+-.

. )*+, 2 #$ % $ )*+, ) ( 图 " 酶切鉴定 $%& ), $/$ + $(,(/ " - $ $(,, )$% - $(, - : 4+-.

4 ! 杜寿文等新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证 % 进行分析图 " 结果显示以上限制性内切酶中除外均可把 )*+, 线性化且为单一条带表明所设计酶切位点有效且可用 " " 的构建与鉴定将 1 分别克隆到 )*+, 的!" 和和位点处并用相应的限制性内切酶进行鉴定图 $ 图 ' 条带大小均与理论值相符表明构建成功图质粒的构建图 $%&#(,- $(,(/*+- $) 图 " 酶切鉴定 $%& ), $/$ + $(,(/ " - $ $(,, )$% - $(, )*+, # 1 2!" 3 - : # " )*+, # 1 图酶切鉴定 $%& ), $/$ + $(,(/ - $ $(,, )$% - $(, - : )*+, )*+, 2 6 图酶切位点鉴定 $%& ), $/$ + $(,(/ 0 - $ $(,, -$ -$, - # " )*+, 2 #$ % $ )*+, ) ( 图 " 酶切鉴定 $%& ), $/$ + $(,(/ " - $ $(,, )$% - $(, - : ) *+, # # " )*+, # 1 的功能验证 )*+, # 1 和 )*+, # 1 分别转染 / # 细胞对 )*+, 中两个表达盒的表达功能进行验证同时设 )*+, 阴性对照和 )*+,# 1 阳性对照荧光显微镜下转染 )*+, # 1 和 )*+, # 1 质粒的细胞均有大量的绿色荧光图 % 图 & 结果证明新添加的表达盒能够成功表达外源基因且不影响原表达盒的表达功能另外从荧光图 & 中亦

两种重组质粒转染细胞 #1 产物与阳性产物大小相符提示 1 基因在 / 细胞中得到有效转录图 9 基因 :!" # 产物 $%&9!0!" # () (/ : #1 ).

. 讨论图在 234" 细胞中的表达 $%& 0 -$(,(/ $,234" *-. ;. ;)*+, # 1. ; / # 2. ;. ;)*+, # 1. ; / #. ;. ;)*+,# 1.

表达分支杆菌属抗原 0+ #' 4+ 疫苗免疫小鼠可激发 3 混合型免疫应答反应表达晶体蛋白和超氧化物歧化酶 + 的 4+ 疫苗可诱导小鼠分泌高水平的 6 4#

- * 的特异性中和抗体和 : 杀伤效应对于 - * 感染具有保护能力 ' 以 ) 4+ 7 为载体在小鼠体内表达胰岛素样生长因子结合蛋白 %6 1%

5 & 中国生物工程杂志 * 7 47! 可以看出新表达盒表达的 1 蛋白可以提呈到细胞表面箭头所示提示新添加的表达盒具有蛋白分泌与靶向锚定作用制备成 4+ 以此为模板扩增 1 基因图! 两种重组质粒转染细胞 #1 产物与阳性产物大小相符提示 1 基因在 / 细胞中得到有效转录图 9 基因 :!" # 产物 $%&9!0!" # () (/ : #1 ). )*+, # 1?. ; / # #1 ). )*+, # 1?. ; / # 1). " )*+,. $ 4. - : 讨论图在 234" 细胞中的表达 $%& 0 -$(,(/ $,234" *-. ;. ;)*+, # 1. ; / # 2. ;. ;)*+, # 1. ; / #. ;. ;)*+,# 1. ; / # 4. 图 5 绿色荧光蛋白展示在细胞表面 66 7 $%&58$-*+ (/%,/* ( -, ( $,(, 234" *- / ;. ;)*+, # 1. ; / # 2. ;. ;)*+, # 1. ; / #!" # 鉴定基因在 234" 细胞中的转录提取转染重组质粒细胞的总 4+ 经逆转录反应 4+ 疫苗即基因本身在体内表达目的抗原诱发机体的细胞和体液免疫应答研究表明表达分支杆菌属抗原 0+ #' 4+ 疫苗免疫小鼠可激发 3 混合型免疫应答反应表达晶体蛋白和超氧化物歧化酶 + 的 4+ 疫苗可诱导小鼠分泌高水平的 6 4# 上述两种疫苗免疫土拔鼠之后可有效抵抗结核菌 / % 的感染 $ 以 )*+, 为载体构建的含 6:#& 的 - * 4+ 疫苗 )*6 #1 +6:& 免疫小鼠和猪可刺激机体产生针对 - * 的特异性中和抗体和 : 杀伤效应对于 - * 感染具有保护能力 ' 以 ) 4+ 7 为载体在小鼠体内表达胰岛素样生长因子结合蛋白 %6 1% 通过促进细胞凋亡和降低血管内皮细胞生长因子 * 的表达量而抑制黑色素瘤的生长 % 目前已有多种 4+ 疫苗进入临床试验研究阶段如疫苗 * #0 0 4+$ # *1 & 流感 4+ 疫苗 *:#"%' *:#"%&$ 等! /6* 4+ 疫苗 1#/6*#! 等在期临床试验中显示出较好的免疫或治疗效果 4+ 疫苗能发挥其作用载体是必可或缺的然而目前常用的载体普遍存在外源基因插入限制性安全性低等弊端因此为了适应多价 4+ 疫苗的构建及增强其免疫效果多构建双启动子的表达载体然而启动子之间的相互干扰可能影响所携带的不同基因的转录表达研究中构建的真核表达载体

6 ! 杜寿文等新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证! 含有两个相互独立的表达框各自具有其独有的启动子可插入不同的抗原基因或基因佐剂也避免了原质粒载体限制性酶切位点的限制实现了不同的抗原基因和基因佐剂在同一个质粒上在细胞内表达而互不影响从而保证了不同表达蛋白构象的正确性且可将抗原展示在细胞表面图中显示新构建的表达盒由 & 种组分构成 -* 增强 3 启动子来自于人巨细胞病毒的启动子是一种安全性较高的真核启动子使目的蛋白得到高水平有效表达 % 启动子序列有利于基因体外定向转录 -0 上游融合有鼠 6 链前导序列指引靶向蛋白进入分泌途径另外 -0 上下游还分别插入了血凝素 + 附加表位 /+ 和原癌基因表位 # ( 与目的蛋白构成融合蛋白便于通过免疫印迹和免疫荧光技术用 +$ 单克隆抗体和抗 ( 抗体检测目的蛋白 "#$ 血小板来源的生长因子受体 1 跨膜区将表达蛋白锚定在细胞膜上展示在细胞外侧 ' 末端为牛生长激素 / 多腺苷酸化信号有利于基因的转录终止 % 图 % 以 1 作为报告基因对两个表达盒的功能进行了验证均具有高效的蛋白表达能力图 & 显示出新设计的表达盒具有蛋白分泌及靶向锚定于细胞膜的作用研究成功构建了双基因表达盒的真核表达载体 )*+, 且具有蛋白展示和锚定于细胞表面的功能目前正在利用该载体进行多价艾滋病治疗性疫苗及流感通用核酸疫苗的相关研究参考文献 - - /. 6(( ; ) 4+ (.. /*.. * ' " ""& #""&!.(0 ) ; (( ;( /6*# 0 1 ( 4+..#2 ;.. ( ;. * % $ "#" " 奥斯伯 - 布伦特金斯顿等精编分子生物学实验指南第 $ 版北京科学出版社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

7 中国生物工程杂志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

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽