( ) 表达载体 于外源 DNA 的表达 1 原核表达载体: 在原核细胞表达外源基因 (1) 启动 : 转录 mrna 必需元件 (2)SD 序列 : 提供核糖体结合位点 (3) 转录终 序列 : 有助于 效表达外源基因 2 真核表达载体: 在真核细胞表达外源基因 (1) 真核表达载体特点 : 1

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1 二 重组 DNA 技术中常用的载体 ( ) 克隆载体 于外源 DNA 的克隆 1 克隆载体应具备的主要特点 2 常 克隆载体 (1) 质粒 (plasmid): 最常 的克隆载体 (2)λ 噬菌体克隆载体 (3) 其他克隆载体 : 增加载体容量 ( ) 表达载体 于外源 DNA 的表达 基本特性 : 克隆必需元件 : 复制 ; 多克隆酶切位点 ; 选择性标志转录必需元件 : 启动 和终 翻译必需元件 : 核糖体结合位点

2 ( ) 表达载体 于外源 DNA 的表达 1 原核表达载体: 在原核细胞表达外源基因 (1) 启动 : 转录 mrna 必需元件 (2)SD 序列 : 提供核糖体结合位点 (3) 转录终 序列 : 有助于 效表达外源基因 2 真核表达载体: 在真核细胞表达外源基因 (1) 真核表达载体特点 : 1 原核载体部分 : 复制原点, 筛选标志,MCS 2 真核载体部分 : 复制原点, 筛选标志, 调控元件 (2) 真核表达载体种类

3 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 一 ) 目的 DNA 的分离获取 ( 分 ); ( 二 ) 载体的选择与构建 ( 选 ); ( 三 ) 目的 DNA 与载体连接 ( 接 ); ( 四 ) 重组 DNA 转入受体细胞 ( 转 ); ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 )

4 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 一 ) 目的 DNA 的分离获取 ( 分 ); 1 化学合成法 : 直接合成 的 DNA 2 基因组 库和 cdna 库 : 获取 的 DNA 3 PCR 法 : 最常 的 法 ( 二 ) 载体的选择与构建 ( 选 ); 1 根据 的选择载体 2 根据 DNA 及受体细胞的种类选择载体 3 载体内应含有合适的 MCS

5 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 三 ) 的 DNA 与载体连接 ( 接 ) 1 黏端连接: 最适连接 (1) 单 酶切点的粘性末端连接 (2) 不同末端连接可实现定向克隆 (3) 通过其他措施产 黏端进 连接 1 接头法 2 加同聚物尾法 3PCR 法 2 平端连接: 效率较低 3 黏 - 平末端连接

6 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 一 ) 目的 DNA 的分离获取 ( 分 ); ( 二 ) 载体的选择与构建 ( 选 ); ( 三 ) 目的 DNA 与载体连接 ( 接 ); ( 四 ) 重组 DNA 转入受体细胞 ( 转 ); ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 )

7 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 四 ) 重组 DNA 转 受体细胞 程细胞 : ( 转具有较强的接纳外源 ) DNA 能 保证外源 DNA 期稳定遗传或表达

8 ( 1 转 转化 ) : 质粒 细菌质粒 酵 感受态细胞 : 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 四 ) 重组 DNA 转 受体细胞 细胞膜通透性增加, 容易接受外源 DNA 的细菌 2 转染 : 外源 DNA 真核细胞 噬菌体 DNA 细菌 3 感染 : 噬菌体颗粒 细菌 病毒颗粒 真核细胞

9 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 一 ) 目的 DNA 的分离获取 ( 分 ); ( 二 ) 载体的选择与构建 ( 选 ); ( 三 ) 目的 DNA 与载体连接 ( 接 ); ( 四 ) 重组 DNA 转入受体细胞 ( 转 ); ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 )

10 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 一 ) 目的 DNA 的分离获取 ( 分 ); ( 二 ) 载体的选择与构建 ( 选 ); ( 三 ) 目的 DNA 与载体连接 ( 接 ); ( 四 ) 重组 DNA 转入受体细胞 ( 转 ); ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 )

11 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 (1) 抗 素抗性标志筛选载体 不含有载体的细菌 含有载体的细菌

12 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 (1) 抗 素抗性标志筛选载体 (2) 插 失活 / 插 表达筛选重组载体

13 (2) 插 失活 / 插 表达筛选重组载体

14 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 (1) 抗 素抗性标志筛选载体 (2) 插 失活 / 插 表达筛选重组载体 (3) 标志补救筛选载体载体上的标志基因表达, 补救宿主细胞的缺陷基因, 使细胞在选择性培养基上存活

15 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 (3) 标志补救筛选载体

16 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 (3) 标志补救筛选载体蓝 筛选

17 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 (3) 标志补救筛选载体 : 乳糖操纵

18 (3) 标志补救筛选载体 :α- 互补

19 (3) 标志补救筛选载体 :α- 互补

20 (3) 标志补救筛选载体 : 蓝 筛选

21 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 (1) 抗 素抗性标志筛选载体 (2) 插 失活 / 插 表达筛选重组载体 (3) 标志补救筛选载体 (4) 噬菌体包装特性筛选载体 cos 12bp Long (le:) arm 48500bp Nonessen1al por1on for replica1on Short (right) arm 12bp cos

22 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 (4) 噬菌体包装特性筛选载体 重组 λdna 的 度为其野 型 度的 75%~ 105% 时, 才能包装形成有活性的噬菌体颗粒 cos 12bp Long (le:) arm 48500bp Nonessen1al por1on for replica1on Short (right) arm 12bp cos

23 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 2 序列特异性筛选载体 (1)RE 酶切法 :

24 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) NcoI HindIII 1 遗传标志筛选载体 2 序列特异性筛选载体 (1)RE 酶切法 : 提取阳性克隆的重组 DNA RE 消化 电泳 有 DNA 段的插 ; 插 段的 Marker 300bp 2700bp recombinant non-recombinant insert

25 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) NcoI HindIII 1 遗传标志筛选载体 2 序列特异性筛选载体 (1)RE 酶切法 : (2)PCR 法 : 直接鉴定 的 DNA 的存在 300bp 2700bp

26 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 2 序列特异性筛选载体 (1)RE 酶切法 : (2)PCR 法 : 直接鉴定 的 DNA 的存在 (3) 核酸杂交法 : 从 库中筛选 的 DNA

27 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 2 序列特异性筛选重组 DNA (1) 限制性内切酶法 : (2)PCR 法 : 直接鉴定 的 DNA 的存在 (3) 核酸杂交法 : 从 库中筛选 的 DNA (4)DNA 测序 : 最准确的鉴定 法 Ø DNA sequencing The sequence of bases A, C, G, T in the recombinant DNA. Blast the sequence: DNA sequencing result sequence of the target DNA Confirm

28 ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ) 1 遗传标志筛选载体 (1) 抗 素抗性标志筛选载体 (2) 插 失活 / 插 表达筛选重组载体 (3) 标志补救筛选载体 (4) 噬菌体包装特性筛选载体 2 序列特异性筛选重组 DNA (1) 限制性内切酶法 : (2)PCR 法 : 直接鉴定 的 DNA 的存在 (3) 核酸杂交法 : 从 库中筛选 的 DNA (4)DNA 测序 : 最准确的鉴定 法 3 亲和筛选法筛选阳性克隆 前提 : 重组 DNA 进 受体细胞后能表达其编码产物 原理 : 抗原 - 抗体反应或配体 - 受体反应

29 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 一 ) 目的 DNA 的分离获取 ( 分 ); ( 二 ) 载体的选择与构建 ( 选 ); ( 三 ) 目的 DNA 与载体连接 ( 接 ); ( 四 ) 重组 DNA 转入受体细胞 ( 转 ); ( 五 ) 重组体的筛选与鉴定 ( 筛 ); ( 六 ) 克隆基因的表达

30 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 六 ) 克隆基因的表达基因转录 mrna 翻译转录后加 翻译后加 Recombinant Protein

31 promoter Target gene 转化宿主细胞 Transforma1on/ Transfec1on Recombinant vector Proteins 原核表达系统 Prokaryo1c expression system 真核表达系统 Eukaryo1c expression system 大肠杆菌枯草芽胞杆菌链霉菌 酵母昆虫细胞哺乳动物细胞

32 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 六 ) 克隆基因的表达 1 原核表达体系 第二节重组 DNA 技术 (1) 原核表达载体 : 1 选择标志 2 强启动 3 核糖体识别位点 4 合理的 MCS MCS 大肠杆菌表达载体的基本组成 R: 调节序列 ; P: 启动子 ; SD:SD 序列 ;TT: 转录终止序列

33 (1) 原核表达载体 : 2 启动 (promoter) 是启动外源基因表达的必需元件 能被原核细胞 RNA 聚合酶所识别的强启动 前原核表达载体常使 的启动 有以下 种 : l Lac 启动 ( 乳糖启动 ) IPTG 诱导 l Trp 启动 ( 氨酸启动 ) l Tac 启动 ( 乳糖和 氨酸的杂合启动 ) l PL 和 PR 启动 (λ 噬菌体的左向和右向启动 ) l T7 启动 转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤, 因此, 选择强的 可调控启动 是组建 个 效表达载体 先要考虑的问题

34 (1) 原核表达载体 : 3 SD 序列 (Shine-Dalgarno sequence): l 位于转录起始位点下游 8~13bp 处, 5 -UAAGGAGG-3 l 保证翻译起始复合物的形成, 决定 mrna 翻译效率 SD 序列与 16SrRNA 的互补性, 当 5 -GGAGG-3 时, 翻译效率最 ; SD 与起始密码 之间的距离, SD 序列位于 AUG 之前 约七个碱基处

35 (1) 原核表达载体 : 3 SD 序列 (Shine-Dalgarno sequence): 例如 : Start point Start point promoter SD 15 bases promoter SD XXXXXXXX 7 bases XXXXXXX AUG AUG IL-2 gene IL-2 gene Transcription Transcription 因此,SD 序列的位置在基因表达调控中起重要作 Translation Translation IL-2 表达最 IL-2 表达 平降低 500 倍

36 (1) 原核表达载体 : 4 转录终 序列 : 聚体终 串联 启动子 终止子 SD mrna 转录过度的危害 : l 影响 的基因的转录和翻译效率 l 干扰基因载体的复制等 物学功能 l 增加受体细胞的 效能量消耗

37 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 六 ) 克隆基因的表达 1 原核表达体系 (1) 原核表达载体 : (2) 的基因 : 第二节重组 DNA 技术 l 来 真核细胞的基因, 只能选择 cdna; l cdna 起始密码 上游的 编码序列必须删除 ; l 起始密码 与 SD 之间的最佳距离 l 尽量将密码 改变成 E.coli 的偏爱密码

38 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 六 ) 克隆基因的表达 1 原核表达体系 (2) 的基因 : l 尽量将密码 改变成 E.coli 的偏爱密码 遗传密码有简并性, 即 种氨基酸有数个同义密码 ; 例如, 亮氨酸共有 6 个同义密码 论真核基因还是原核基因, 种特定的氨基酸并不是以同等频率使 所有的同义密码, 主要使 其中的某 两种 这种遗传密码使 的 随机性现象 密码 使 的偏爱性 富含 肠杆菌稀有密码 的外源真核基因是很难在 肠杆菌细胞中得到有效的表达 反之, 则表达效率提

39 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 六 ) 克隆基因的表达 1 原核表达体系 (2) 的基因 : l 尽量将密码 改变成 E.coli 的偏爱密码

40 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 六 ) 克隆基因的表达 1 原核表达体系 (1) 原核表达载体 : (2) 的基因 : (3) 受体菌 : 肠杆菌 ( 程菌 ) 1 遗传稳定 操作 便 2 培养简单 繁殖迅速 3 表达 平 4 可通过发酵迅速获得 量基因表达产物

41 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 六 ) 克隆基因的表达 1 原核表达体系 (1) 原核表达载体 : (2) 的基因 : (3) 受体菌 : 肠杆菌 ( 程菌 ) (4) 的蛋 的表达形式 : 1 包涵体表达 : 不溶性的晶状结构物 表达量, 但没有活性, 需经折叠复性才有活性 ; 2 可溶性表达 : 蛋 有活性, 表达量低 ; 3 分泌表达 : 蛋 有活性, 表达量低

42 ( 六 ) 克隆基因的表达 1 原核表达体系 (1) 原核表达载体 : (2) 的基因 : (3) 受体菌 : 肠杆菌 ( 程菌 ) (4) 的蛋 的表达形式 : (5) 不 之处 : 1 缺乏转录后加 机制, 只能表达 cdna; 2 缺乏翻译后修饰机制 ( 蛋 折叠和糖基化修饰 ) 3 平表达常形成包涵体 4 可溶性蛋 表达量较低

43 ( 六 ) 克隆基因的表达 1 原核表达体系 2 真核表达体系 第二节重组 DNA 技术 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 (1) 真核表达体系优点 : 1 转录后加 机制 2 翻译后修饰机制 ( 蛋 折叠和糖基化修饰 ) 3 可以分泌表达 4 表达蛋 不易降解

44 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 六 ) 克隆基因的表达 1 原核表达体系 2 真核表达体系 第二节重组 DNA 技术 (2) 真核表达体系缺点 : 1 繁殖速度慢, 培养条件 2 蛋 表达 平低 3 操作过程复杂 4 成本

45 三 重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤 ( 六 ) 克隆基因的表达 2 真核表达体系 (3) 真核表达载体特点 : 1 原核选择标记, 原核复制序列,MCS 2 真核调控元件 :P, 增强,TT,polyA 加尾信号 3 真核复制序列 4 真核选择标记

46 (3) 真核表达载体 :

47 真核表达体系 Yeast Insect Mammalian 酵 细胞昆 细胞哺乳动物细胞 酵 表达系统昆 表达系统哺乳动物细胞表达系统 以获得 量的 有活性的蛋 为 的 研究基因或其蛋 质产物的功能为 的

48 真核表达体系 酵 表达系统 1 繁殖速度快, 培养条件简单 2 遗传背景清楚, 调控机制清楚 3 有转录后加 和翻译后加 4 不产 内毒素 昆 表达系统 1 可对蛋 质进 翻译后加 修饰 ; 2 操作相对简单 --- 已经商品化 ; 3 可 平表达外源基因产物 ; 4 蛋 准确定位 --- 如分泌到膜外

49 真核表达体系酵 表达系统昆 表达系统哺乳动物细胞表达系统

50 第二十一章 DNA 重组及重组 DNA 技术

材料 方法

材料 方法 生物技术通报 张发洲 杨慧兰 为了构建单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽 真核表达质粒 应用 技术从 株 的基因组中扩增 基因 并连接至真核表达载体 对阳性克隆进行菌落 酶切和测序鉴定后 成功构建了重 组质粒 用 转染试剂盒将重组质粒 转染至 细胞中 并用 及 检测其表达情况 结果显示 基因在 细胞中得到正确表达 真核表达质粒 的构建成功 为进 一步研究 对宿主细胞的影响奠定了基础 单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽

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