中国生物工程杂志 : :! 慢病毒包装体系的建立并观察 -./- 基因调控表达材料与方法材料慢病毒表达载体,01# # #. #, 及其包装质粒,01# 23# 2,01# 23#/. 和 # 购自 8 公司 8# #-./- 质粒大肠埃希菌感受态细胞 01 由广西壮族自治区肿瘤防治研究保

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坤宜湛
5 years ago
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1 中国生物工程杂志! " 重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定钟艳平林若芸黎丹戎胡晓霞 % 王琪李力广西医科大学医学科学实验中心南宁广西壮族自治区妇幼保健院生殖中心南宁广西医科大学附属肿瘤医院南宁 % 广西区人民医院南宁摘要目的构建携带人端粒酶逆转录酶 )( ( * + * *,* -./- 基因的慢病毒表达载体及探索高滴度第三代慢病毒包装体系的建立并观察 -./- 基因在细胞中的表达调控方法将 -./- 基因片段插入慢病毒载体,01# # #. #, 中构建慢病毒表达质粒,01#-./- 通过酶切 0 2 测序验证 -./- 片段的准确性后将,01#-./-,01# 23# 2,01# 23#/. 和 # 共转染包装细胞! - 浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒并通过 / 及! - 中 -./- 蛋白的表达鉴定重组慢病毒将重组慢病毒感染靶细胞通过检测标记蛋白 & 绿色荧光蛋白 4 ) *, -./- 蛋白表达和端粒酶活性进一步验证,01#-./- 在细胞中表达结果,01#-./- 携带正确 -./- 基因将其与包装质粒共转染! - 细胞能产生重组病毒病毒基因组 / 证实 -./- 基因插入感染! - 后可检测到 -./- 蛋白的表达目的基因 -./- 能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞并稳定表达荧光显微镜下可直接观察 /-# /5 * 6 及 -/2 # /#.78 2 法检测感染后的细胞发现 -./-(/ 2-./- 蛋白的表达及端粒酶活性明显增强结论成功构建了第三代慢病毒表达载体,01#-./- 并获得高效的重组慢病毒能将外源 -./- 基因导入靶细胞重建端粒酶活性为构建永生化细胞系奠定基础关键词人端粒酶逆转录酶慢病毒载体病毒包装绿色荧光蛋白中图分类号 9"'$ 体细胞克隆动物普遍存在着早期胚胎发育阻滞胚胎死亡流产早衰等现象严重影响了克隆效率研究发现克隆羊多利的染色体上有一个基本缺陷其染色体末端的端粒序列长度小于正常的同龄羊由此可能带来和早衰相关的一些疾病端粒偏短是克隆技术不可避免的天然缺陷由于端粒充当了细胞分裂的分子钟作用在胚胎发育过程中端粒长度的建立可能决定新生动物的端粒长度在衰老过程中端粒酶端粒结合蛋白和端粒三者相互作用共同完成对细收稿日期 # # 修回日期 #$#% 广西自然科学基金桂科合!! & 桂科自 ' 广西研究生科研创新项目!!' ' 资助项目共同第一作者通讯作者电子信箱 $ ( 胞基本生命活动的调节端粒酶对随细胞分裂而缩短的端粒起着补足长度的作用它能以自身 / 2 组分为模板合成端粒 0 2 序列维持端粒于一定长度因而避免因端粒丢失而引起的细胞凋亡使细胞维持永生性人端粒酶逆转录酶 )( ( * + * *,* -./- 基因的表达水平对端粒酶活性起关键作用外源性表达 -./- 可以提高细胞端粒酶活性使其增殖能力增强并赋予抗衰老或永生化能力慢病毒载体具有感染效率高可稳定整合于靶细胞的基因组理化性质较稳定外源基因的容纳量大等诸多优点 %# 因此实验拟构建携带人端粒酶逆转录酶 -./- 基因的慢病毒表达载体及探索高滴度第三代

2 中国生物工程杂志 : :! 慢病毒包装体系的建立并观察 -./- 基因调控表达材料与方法材料慢病毒表达载体,01# # #. #, 及其包装质粒,01# 23# 2,01# 23#/. 和 # 购自 8 公司 8# #-./- 质粒大肠埃希菌感受态细胞 01 由广西壮族自治区肿瘤防治研究保存人胚肾上皮细胞系! - 卵巢癌细胞系 3; 卵巢癌淋巴结高转移细胞系 3; # % 课题组自行构建和人脐静脉血管内皮细胞 1. 由广西壮族自治区肿瘤防治研究保存限制性内切酶 -% 0 2 连接酶购自 -3/ 公司 0 2 凝胶回收试剂盒无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化公司 7,4 ( - 逆转录试剂盒购自 8+ 公司兔抗人多克隆抗体 -./- 1# 购自 ) 公司 8/0 ' 标记人抗兔的荧光二抗购自 7# 生物技术公司端粒酶活性检测试剂盒购自罗氏公司 / 引物由上海生工合成测序由宝生物公司完成方法 : : 人 -./- 基因重组慢病毒表达载体,01# -./- 的构建用 / 和分别对,01# # #. #, 和,8# #-./- 进行双酶切 0 2 回收试剂盒回收纯化 :% 6 的 -./- 目的基因片段和 ": 6 的,01# # #. #, 载体片段 -% 0 2 连接酶对这两个片段进行定向连接后转化 01 感受态细胞挑取阳性克隆并提取质粒经 / 和双酶切鉴定正确后测序鉴定 : : 人 -./- 基因重组慢病毒的包装与浓缩将! - 细胞接种于六孔板中用含胎牛血清的高糖 0. 培养基在 " ; 条件下培养至细胞 '! 汇合时转染转染前将培养基更换为无血清培养基按照 7,4 ( 试剂 / + * - *4 转染方法将质粒,01#-./-,01# 23# 2 :%,01# 23#/. : 和 # :% 转染至! - 中对照组加入与实验组等量的 7,4 (,01# # #. #, 载体及包装质粒观察 " 以上细胞有绿色荧光蛋白表达后更换培养基培养至 %' " 收集病毒上清 <( 离心 ( 去除细胞碎片经 :% ( 滤器过滤再 <(% 离心浓缩病毒上清然后以重悬病毒分装冻存于 &' 备用 : : / 及 5 * 6 检测重组慢病毒 -./- 基因的表达取冻存病毒上清煮沸 ( 冰浴 ( 用 / 方法检测重组慢病毒 -./- 基因的表达情况 -./- 上游引物 =# #= -./- 下游引物 =# #= 扩增片段为 % 6, /8 2 提取转染重组慢病毒后! - 细胞蛋白取样品加上样缓冲液煮沸 ( 0 # 2. 后半干转至 0 膜脱脂奶粉封闭 : 加入兔抗人多克隆抗体 -./- 抗体 > % 过夜充分洗涤后加入 8/0 ' 标记的人抗兔荧光二抗 > 室温孵育充分洗涤后使用 ; * 红外荧光扫描仪 # 公司扫描以 2 01 为内参照 : :% 人 -./- 基因重组慢病毒的滴度测定第天将! - 细胞按? *<( 的浓度接种于 % 孔板 " ; 条件下培养过夜第天将保存于 &' 的病毒液 " 水浴融解用含的 0. 培养基进行倍梯度稀释 $ 孔为组从 & 稀释到 &$ 取细胞已长至 $ " 汇合的孔板进行感染去掉孔板中的培养基轻轻颠倒混匀每管慢病毒稀释液各取加入每孔细胞中加入聚酰胺 6 至终浓度 ' ( <7 轻摇混匀 " 过夜培养第天去除含慢病毒的培养基加入 ( 完全培养基第 % 天时在荧光显微镜下观察各孔中有表达细胞计算病毒滴度 - <( $#' : : 重组慢病毒感染不同的细胞用浓缩的重组 $#" 慢病毒按文献方法分别感染 3; 3; # % 1. 和! - 细胞系观察有表达的细胞比例判断不同细胞系间感染率的差别 : :$/-# / 及 5 * 6 检测感染前后 1. 中 -./- 基因的表达将 -./- 基因重组慢病毒感染端粒酶低表达的 1. 细胞! 实验分为三组 -./- 重组慢病毒组 1.#-./- 空质粒慢病毒组 1.# ) 和未感染组 1. 用 - 试剂提取组细胞感染后的总 / 2 各取 / 2 逆转录成 0 2 用 / 方法检测 -./- 基因的表达情况以 2 01 为内参照测定 -./- 与内参 2 01 条带灰度比值确定感染前后 1. 细胞 -./- 基因的表达情况 /8 2 提取感染后 1. 细胞蛋白后 5 * 6 检测三组细胞中 -./- 的表达情况方法同前

! 钟艳平等 -./- 重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定 : :" 端粒酶的活性检测 -/2 # /#.78 2 法检测上述三组 1.

/- 重组质粒经双酶切酶切产物发现,01# # #. #, ": 6 片段和 -./- 基因目的片段 :% 6 图表明该目的片段已正确插入,01# # #. #, 表达载体,01#-./- 表达质粒构建成功图重组慢病毒表达载体及包装质粒转染 *+ 细胞后./ 的荧光表达情况 011 ) " &"#&" & & ( ' " %*+&" $ '# %"&$"!

/- 0 2( 转染质粒后 *+ 细胞,- 的表达将,01#-./- 质粒和包装质粒共同转染! - 细胞 ' 后在荧光显微镜下观察在细胞中的表达可以看到的表达呈阳性随着培养时间增加荧光表达增强在 %' 时达到最强通过观察表达细胞比例判断转染效率达 ' 以上图 + 重组慢病毒滴度的测定及基因的表达,01#-./- 质粒和包装质粒等四质粒共转染!

3 ! 钟艳平等 -./- 重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定 : :" 端粒酶的活性检测 -/2 # /#.78 2 法检测上述三组 1. 细胞同时间段的端粒酶活性按罗氏公司端粒酶活性检测试剂盒说明操作检测各样品在 % ($ ( 空白参考波长吸光度 2 值差值 % &2 $ A 为端粒酶活性阳性结果成功构建人基因重组慢病毒表达载体将构建的,01#-./- 重组质粒测序测序结果与中的人端粒酶催化亚单位基因序列比对相似性达!! 同时,01#-./- 重组质粒经双酶切酶切产物发现,01# # #. #, ": 6 片段和 -./- 基因目的片段 :% 6 图表明该目的片段已正确插入,01# # #. #, 表达载体,01#-./- 表达质粒构建成功图重组慢病毒表达载体及包装质粒转染 *+ 细胞后./ 的荧光表达情况 011 ) " &"#&" & & ( ' " %*+&" $ '# %"&$"! $ '#!$"'& ' # '! -,, - '#!, 011 粒的! - 细胞 -./- 蛋白表达明显增加图 % 收集浓缩重组慢病毒后按逐孔稀释滴度测定法测定其滴度为? - <( 图质粒的双酶切产物!"#$%&'$ # % "& #'#$ '! ( ) # " $ &$ #"#! #)& "' " '#!,01#-./- / 8 8 ( * 4,01#-./- 0 2( 转染质粒后 *+ 细胞,- 的表达将,01#-./- 质粒和包装质粒共同转染! - 细胞 ' 后在荧光显微镜下观察在细胞中的表达可以看到的表达呈阳性随着培养时间增加荧光表达增强在 %' 时达到最强通过观察表达细胞比例判断转染效率达 ' 以上图 + 重组慢病毒滴度的测定及基因的表达,01#-./- 质粒和包装质粒等四质粒共转染! - 细胞后成功包装表达具有 -./- 基因和基因的慢病毒病毒基因组 / 证实重组慢病毒含有 -./- 基因片段图 5 * 6 证实转染,01#-./- 质图 +- 鉴定重组慢病毒基因组基因表达 +- '#' ( %"2 " # % "& #'#$3 ) "# " / (6+ )**),, ) 6! - * *4 B,01#-./-B* 4 ( 4 B * 0 2( 图.4" $" # $ 检测蛋白在 *+ 细胞中的表达.4" $" # $'#' ( %$""2 " # % $"##*+&" $ '# %"&$"! $ *4! - ),.(, + *4! - ),,01#-./- *4! - ),

% 中国生物工程杂志 : :!. 基因重组慢病毒感染不同细胞后,- 的表达与感染效率用 -./- 基因重组慢病毒分别感染 3; 3; # %! - 和 1.

细胞感染效率最低图图 8 基因重组慢病毒感染 6 后 7 的表达 8 7 "2 " # %6 #%"&$"! $ "& #'#$ "#$3 ) 0 2(.# ) ),.

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4 % 中国生物工程杂志 : :!. 基因重组慢病毒感染不同细胞后,- 的表达与感染效率用 -./- 基因重组慢病毒分别感染 3; 3; # %! - 和 1. 细胞后在荧光显微镜下可观察到的表达在时绿色荧光达到最强说明包装出的慢病毒能成功感染靶细胞其中以! - 细胞感染效率最高 3; 3; # % 其次 1. 细胞感染效率最低图图 8 基因重组慢病毒感染 6 后 7 的表达 8 7 "2 " # %6 #%"&$"! $ "& #'#$ "#$3 ) 0 2(.# ) ),.#-./- ),. ), 图 5 基因重组慢病毒感染四种细胞后的荧光表达情况 ) " &"#&" & & ( ' " %% )!%" "#$&" #%"&$"! $ "#" "& #'#$ "#$3 ) 011 3; # % 6 3; # %! 基因重组慢病毒感染 6 细胞后 7 的表达组细胞感染重组慢病毒后分别提取各组细胞总 / 2 各取 / 2 逆转录成 0 2 / 扩增 -./- 基因及内参 2 01 各组均见 -./- 的 % 6, 及 2 01 的 % 6, 条带图 $ 三组. 细胞目的基因与 2 01 基因条带灰度比值结果表明.#-./- 组 -./- 基因表达强于. 组及.# ) 组图 " 8 4" $" # $ 检测重组病毒感染 6 后蛋白的表达 5 * 6 结果表明.#-./- 组 -./- 图 9 基因重组慢病毒感染 6 后 7 的相对表达量 9" " '$3""2 " # "3" % 7 #6 #%"&$"! $ "#" "& #'#$ "#$3 ) 蛋白的表达强于. 组及.# ) 组再次证实 -./- 能被重组的病毒介导进入靶细胞并能增强目的蛋白的表达图 ' 图 / 蛋白在感染重组慢病毒的 6 中的表达 /""2 " # % $"##6 #%"&$"! $ "#" "& #'#$ "#$3 ). ),.# ) ), %.# -./- ),

5 ! 钟艳平等 -./- 重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定 9 端粒酶活性检测采用 -/2 # /#.78 2 法检测组. 细胞的端粒酶活性结果发现.#-./- 组.# ) 组和. 组端粒酶活性均为阳性但.#-./- 组活性最高明显高于.# ) 组和. 组 C: 图! 图 * - - : 方法检测端粒酶活性 + 讨论 * "$"&$ # %$" " ' "'&$3$( ( - - : ' '( 端粒酶是一种由 / 2 和蛋白质组成的逆转录酶由三个亚单位组成其 / 2 成分 -/ 催化亚单位 -./- 和端粒酶相关蛋白 -. -./- 为端粒酶活性所必须的是 / 2 依赖的 0 2 聚合酶其自身携带模板的主要特征使其区别于一般的蛋白逆转录 0 2 聚合酶负责在染色体末端添加端粒重复序列在维持细胞永生化中起重要作用 # 细胞永生化是指细胞在体外培养的过程中经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离获得无限增殖能力从而达到无限增殖的过程!'! 年首先转入人细胞的研究在永生化细胞 1 # 细胞中发现了端粒酶的活性随后端粒酶活性在肿瘤细胞和永生化细胞被测出呈阳性以及人端粒酶 / 2 序列被克隆出来!! 年 1 等又提出端粒酶的活化作用是细胞获得永生化的必需步骤因此端粒酶的活性其翻译后调控机制及建立永生化细胞系成为了研究热点目前研究永生化最常用的方法就是通过构建含端粒酶催化亚基 -./- 的真核表达载体通过各种方法转染目的细胞最近研究表明单纯引入 -./- 不会对细胞正常的接触抑制黏附性生长因子需求等生物学特性产生不良影响 %#$ 说明将外源 -./- 基因导入人类细胞可提高端粒酶活性进而延长细胞体外培养寿命甚至可发展成为永生化细胞现阶段将目的基因导入靶细胞和组织的方法主要包括真核表达质粒的转染和病毒载体介导的基因转移方法其中真核表达质粒的转染存在靶向困难转染效率低有效表达时间短等问题与真核表达质粒相比病毒载体介导的基因转移可以整合宿主的基因组中具有更好的稳定性实验所用第代慢病毒 % 质粒系统由慢病毒质粒系统发展而来删除了野生型病毒的大部分基因只保留 18 # 的和等个基因包装结构构建在个质粒上一个编码和, 蛋白第二个质粒编码 + 蛋白第三个质粒编码 # 蛋白减少了 18 # 包装结构的序列同源性进一步减少重组成 / 的可能性应用 # 包膜的假构型慢病毒载体扩大了慢病毒的宿主范围使得重组病毒能够侵染几乎所有的细胞和组织而且载体颗粒的稳定性增加能够通过超速离心被浓缩成高滴度病毒 "#' 利用第三代慢病毒载体成功构建了携带人端粒酶逆转录酶基因的,01#-./- 质粒并通过优化质粒 0 2 的纯化优化! - 细胞的状态以及探索不同转染试剂等条件包装出能在人类多种细胞表达的重组慢病毒成功地利用重组慢病毒介导外源 -./- 基因转导入靶细胞重建端粒酶活性为进一步构建永生化细胞系及建立慢病毒转基因动物研发平台奠定良好工作基础将可能使克隆技术中端粒偏短的缺陷问题得到解决即利用重组慢病毒在进行核细胞移植前使细胞端粒酶激活并培养一段时间则有可能把端粒长度恢复到正常水平从而克服克隆动物因为早衰带来的一系列问题! 参考文献 *0 1 ) 0 D - ( ** * 4*, /, 0 + " %%$#%" (,4 / E*B 1)(, (( **, ** 7 *!%!!# ' 5/ 02) (( * 4,, *6 *4 B 4 )( *)6)4 ( * + * *,* -./- D) 41, %% #!

6 $ 中国生物工程杂志 : :! % 7 ( + *6 * ) 4 + *6 + +!!$ "! $ # $" 郭淑君万艳李丽玲等 / 重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞 7$ 中的表达中国生物工程杂志 #" ) D 5 E 777 #" $ 34 D / 26 ( 7,, 4 ),* * ) * (, 4 18 # ( / 2 (, ' "! #$ " B /D 8(, + ( * ( *4 ) + )* *( *4 ( -80, ) * * D *!$ "# $ ' )DD ) 82 ; 6* 18 * B ) $ %%$$$% #$$%$! 林若芸黎丹戎钟艳平等过表达人端粒酶逆转录酶促进人脐静脉血管内皮细胞增殖中国生物化学与分子生物学报 " '%#'! 7 / E 70 / E * D) 4 (* ) " '%#'! 3( 5 * 2 B* 3 /, 4 * 4)( ( * + B (( *!!% $$! # (,4 / E*B 1)(, (( * *, ** 7!%!!# ' - )( ( ( *4 * ( * 6), * * *--2, *!'!! #! 1 2 B*5 ) - ( ** ) 4)( 46 6 ** )!! % $ "% % '#%$ % D *, * 4 )( ( * * 4 *, 4 ( )( 46 6 ** ( */ *(() "! #!' /(6 7 ) ( / 0 4, 4 ( * (( )( /. * 8+ *;, ( * % $ #$ $ /( / * #1 6 )+ ( #, ( *(*4, + 4 ) B * 0 + %!'#% " *0 2 4 * * 4 +,* ), + * ) ;, % "#%% ' 张磊刘庆友胡天等第三代慢病毒高效率包装系统的建立基因组学与应用生物学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

7 ! 钟艳平等 -./- 重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定 " *), B* 4+ )*B* * - *) (6 + )* *B -./-B )* 4 * -./-(/ 2 ( *, *! -.B 6 4 ) * ( *, /-# /5 * 6 -/2 # /#.78 2 / *) *(,01#-./- -./- - (6 + )* *,01#-./-B -./- ) 6, ) 6 # *4 4,01#-./-,, *( *! - - (6 + )* *B -./- ) /-! -. -./-(/ 2,, * B ( 6 * 4 * )* - *) *) *4) * ) (6, *(,01#-./- (6 + )* * + -./ * -./- * ) ( * * 6**4 *6 * (( 46 6 *4 * "(! -./ )*, * * ( 姜老师信箱蛋白质研讨班学员问姜老师您好非常感谢您上次的建议我们用您说的方法重新尝试了种不同的胞内表达蛋白电泳后发现渗透冲击法能有效的把蛋白释放到上清中虽然目前效率还没有达到目测可能有 &$ 左右的目的蛋白释放到上清中但相对之前始终没有蛋白的情况已经好了很多现在我还有个细节问题想请教一下这种方法的效率能达到! 以上么如果可以我们实验的效率能否通过增加低渗液水的体积来进一步提高由于要用镍柱来纯化除去.0-2 用什么方法比较合适能否在高渗处理之后用不含.0-2 的高渗洗涤一遍然后再用水再次感谢您的指导姜老师答学员你好很高兴看到你的的调整结果这就是积极采用先进技术的重要性要想提高回收率可以用低渗液再抽提一次但要做定量分析和评估基因工程的工艺到处都要权衡这里主要是防止释放过多的杂蛋白如果你要接 8 2 那就必须去除.0-2 针对进行了渗透冲击的提取方法单用纯水洗是不够的这种情况下去除.0-2 要采用以下方法之一脱盐柱或超滤小分子阴离子交换祝实验顺利

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽