66 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.2009 DH0B 293FT 细胞均由湖州师范学院细胞研究所实验室提供..2 试剂限制性内切酶 EcoRⅠ BamHⅠ DNA marker T4DNALigase Taq 酶质粒小量提取试剂盒胶回收试剂盒均为 T

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后昧燕
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29():65~69 檪檪研究简报檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 EGFP LacZ 双报告基因真核表达载体的构建及体外表达刘莉周政采克俊张易祥何 2 湃曹访 ( 湖州师范学院生命科学学院湖州苏州大学生命科学学院苏州 25006) 摘要构建 (β 半乳糖苷酶与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 双报告基因的真核表达载体, 并在真核细胞中表达采用 PCR 方法从质粒 plenti6/v5 GW/LacZ 中获取 LacZ 全基因, 与 pegfp C 重组后构建真核表达载体 pegfp C LacZ 该重组质粒经 PCR 和酶切方法鉴定后, 在脂质体介导下转染 293FT 细胞株及鸡胚成纤维细胞, 通过荧光观察和组织化学方法检测 Egfp 和 LacZ 基因的表达结果表明,LacZ 基因被克隆到 pegfp C, 成功构建了双报告基因真核表达载体该重组质粒转染后的细胞呈现绿色荧光, 组织化学方法检测到呈蓝色的细胞, 表明两个报告基因均能在细胞内正确表达关键词 β 半乳糖苷酶绿荧光蛋白双报告基因真核表达中图分类号 Q786 β 半乳糖苷酶 (LacZ) 基因和绿色荧光蛋白 (green fluorescentprotein,gfp) 基因是分子生物学及基因工程中广泛应用的两个报告基因 LacZ 基因是来自大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因, 其最大优势是易于用组织化学法检测其原位表达, 而且其表达产物对细胞的存活和生长基本无毒性作用 [~2], 是最常用的报告基因之一但其不足之处在于, 检测后的细胞不适宜继续培养或是进行其他方法的检测 GFP 来源于海洋生物水母 [3~4], 通过自催化氧化反应产生荧光团, 即由 Ser Tyr Gly 形成的环状结构, 在长波紫外或蓝光波长照射下发出绿色荧光由于其基因可以在异源组织中表达并产生荧光, 检测时不需抗体辅因子酶底物等其它成分, 不影响宿主细胞, 因而可以鉴定跟踪分选表达 GFP 的活细胞,GFP 近年来成为细胞生物学和分子生物学中广泛应用的报告蛋白绿色荧光蛋白报告基因收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 浙江省科技计划重点项目 (2005C22052) 资助项目电子信箱 :liuli@hute.zj.cn 同样也存在不足之处, 如在生物体内易受诸多因素的影响, 荧光观察受到干扰, 影响结果判断 Timmons [5] 等用 LacZ 和 gfp 作为报告研究果蝇基因表达时, 发现两个报告基因在果蝇不同组织的表达不同, 同时指出可视化的 GFP 荧光有利于识别活细胞中的蛋白表达, 而 LacZ 组织化学染色对于监测蛋白的原位表达更灵敏为避免单一报告基因给实验结果分析带来误差, 利用 gfp 作为报告基因常需要做 GFP 或目的基因的免疫组织化学进一步鉴定, 或分别用 LacZ 报告基因和 gfp 报告基因的进行研究, 以达到相互验证的目的 [6~7] 鉴于单一报告基因应用的局限性和不足, 构建同时含有 LacZ 和 gfp 两个报告基因的真核载体, 对于准确监测体内外细胞转染效果具有重要的意义材料与方法. 材料.. 质粒与菌株质粒 plenti6/v5 LacZ 购自 InvitrogenBiotechnology 公司, 质粒 pegfp C 大肠杆菌

2 66 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.2009 DH0B 293FT 细胞均由湖州师范学院细胞研究所实验室提供..2 试剂限制性内切酶 EcoRⅠ BamHⅠ DNA marker T4DNALigase Taq 酶质粒小量提取试剂盒胶回收试剂盒均为 TaKaRa 公司产品,X GAL 试剂盒为杰美基因医药科技有限公司产品脂质体转染试剂 Lipofectin 购自 InvitrogenBiotechnology 公司..3 引物设计与合成根据 LacZ 开放阅读序列和 pegfp C 载体多克隆酶切位点设计引物, 用于扩增 LacZ 全基因并连接至载体上下游引物分别添加 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 限制性内切酶识别序列及保护性碱基, 其上游引物为 :5 CCGGAATTCCGGCCCCTTCACCA TGATAGAT 3, 下游引物为 :5 CGGGATGGCGAACCGC GGGCCCTCTAGACT 3 引物由 InvitrogenBiotechnology 公司合成.2 方法.2. 感受态细胞的制备挑取大肠杆菌 DH0B 单菌落接种于 5ml 的 LB 液体培养基中,37 振荡培养过夜, 再取 ml 培养液接种于 00ml 的 LB 液体培养基中,37 振荡培养 2.5h 左右, 使 OD 600 值达 0.4 左右, 采用 CaCl 2 法制备感受态细胞, 分装, 并于 -80 保存备用.2.2 质粒的提取将含有目的基因 PLenti6/V5 LacZ 质粒的 DH0B 菌种接种在含氨苄青霉素的 LB 平板上, 于 37 培养扩增后, 提取质粒, 方法参照质粒小量提取试剂盒说明书进行同时将含有表达载体 pegfp C 质粒的 DH0B 菌种接种在含卡那霉素的 LB 平板上,37 培养扩增, 提取质粒方法同上.2.3 LacZ 目的基因的 PCR 扩增纯化酶切及回收以 PLenti6/V5 LacZ 质粒为模板,PCR 反应体系按常规进行, 反应条件为 94 预变性 5min 后, 进入 30 个循环 :94 变性 30s,64 退火 30s,72 延伸 80s; 最后 72 延伸 20min PCR 扩增产物经 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 双酶切后, 割胶回收 LacZ 目的基因片段.2.4 重组质粒的构建转化及鉴定采用 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 双酶切质粒 pegfp C, 并用胶回收试剂盒回收 pegfp C 载体片段, 然后利用 T4DNALigase 与上述回收的 LacZ 目的基因片段连接, 连接产物转化至 DH0B 感受态细胞转化子经 PCR 筛选后, 提取质粒, 酶切鉴定重组质粒.2.5 转染细胞的制备鸡胚成纤维细胞 (chicken embryofibroblast,cef) 取自 9~0 日龄的鸡胚将其除去头部翅膀及内脏 ; 用 EDTA 胰酶消化后, 细胞悬液经 300 目网筛过滤, 离心去上清, 重悬细胞沉淀并计数以个 /ml 的密度接种到培养瓶中, 于 %CO 2 饱和湿度条件下培养, 待细胞铺满培养瓶底部时, 进行常规消化传代, 以个 /ml 的密度接种于 24 孔培养板中, 于 %CO 2 浓度饱和湿度条件下培养待汇片至 80% 时用于细胞转染 293FT 细胞从液氮中取出复苏后, 传代转染前一天, 胰酶消化细胞并计数, 将细胞铺到 24 孔板, 使其汇片至 80% 时用于细胞转染.2.6 重组质粒的制备及体外转染真核细胞将小量提取并纯化的重组质粒 pegfp C LacZ 和对照质粒 pegfp C 的 DNA 调整浓度为 μg/μl 备用采用脂质体转染试剂 Lipofectin 进行转染, 方法参照说明书进行.2.7 荧光显微镜观察 EGFP 在细胞内的表达和分布将上述鸡胚成纤维细胞和鸡睾丸组织细胞转染 48h 后, 在荧光倒置显微镜下观察自发绿色荧光的被转染细胞, 照相记录.2.8 β 半乳糖苷酶组织化学染色将上述荧光观察后的细胞进行 β 半乳糖苷酶组织化学染色鉴定, 具体方法参照说明书进行染色后在光学显微镜下观察, 并照相记录 2 结果 2. pegfp C 载体鉴定与 LacZ 目的基因的获取 pegfp C 质粒经过 EcoRⅠ 单酶切 BamH I 单酶切后, 电泳显示有一条单一的 4.7kb 的条带, 说明 EcoR Ⅰ 和 BamHI 这两个酶均为 pegfp C 质粒的单酶切位点以 PLenti6/V5 LacZ 为模板对目的基因 LacZ 的 PCR 鉴定, 电泳显示有 3.kb 的条带, 符合 LacZ 全基因片段的长度 ( 图 ) 上述结果表明,EcoRⅠ 和 BamHI 这两个酶均为 pegfp C 质粒的单酶切位点 ; 以 PLenti6/V5 LacZ 为模板经过 PCR 后可以得到 3.kb 的目的基因片段 2.2 PCR 筛选及重组质粒酶切鉴定 LacZ 目的基因与载体片段体外连接转化后, 取卡那霉素抗性菌落作为模板进行 PCR, 筛选重组转化菌的阳性克隆得到的阳性克隆经扩增后提取质粒该重组质粒命名为 pegfp C LacZ, 同时进行酶切鉴定结果表明, 重组质粒经过 EcoRⅠ 单酶切获得 7.8kb 的

2009,29() 刘莉等 :EGFP LacZ 双报告基因真核表达载体的构建及体外表达 67 图 pegfp C 载体的酶切鉴定及 LacZ 基因的获取 Fig.

LacZplasmidastemplate 单一条带, 质粒大小与预期相符 ; 经 EcoRⅠ 和 BamH I 双酶切后, 显示有两条分别为 4.7kb 和 3.kb 的条带 ( 图 2), 符合 pegfp C 载体和 LacZ 全基因的长度, 进一步验证了重组质粒 pegfp C LacZ 已构建成功图 3 EGFP LacZ 双报告基因在 CEF 细胞中的表达 (200 ) Fig.

galactosidaseactivityofceftransfected bypegfp C(d):Histochemistryforbeta galactosidaseactivity ofceftransfectedbypegfp C LacZbar=20μm 图 2 重组质粒的酶切鉴定 Fig.

3 重组质粒在 CEF,293FT 细胞中的表达用脂质体转染法将重组质粒 pegfp C LacZ 导入 CEF,293FT 细胞中转染 48h 后, 用荧光倒置显微镜观察, 转染对照质粒 pegfp C 和重组质粒 pegfp C LacZ 的细胞均很容易观察到绿色荧光 ; 对转染细胞进行 β 半乳糖苷酶组织化学染色, 其中 pegfp C LacZ 重组质粒转染的细胞呈蓝色, 而对照质粒

3 2009,29() 刘莉等 :EGFP LacZ 双报告基因真核表达载体的构建及体外表达 67 图 pegfp C 载体的酶切鉴定及 LacZ 基因的获取 Fig. IdentificationofpEGFP Cbyrestriction analysisandamplificationoflaczgenebypcr M:λ HindⅢ digestdnamarker;:pegfp CdigestedbyEcoRⅠ; 2:pEGFP CdigestedbyBamHI;3:LacZgeneamplifiedby PCRwithpLenti6/V5 LacZplasmidastemplate 单一条带, 质粒大小与预期相符 ; 经 EcoRⅠ 和 BamH I 双酶切后, 显示有两条分别为 4.7kb 和 3.kb 的条带 ( 图 2), 符合 pegfp C 载体和 LacZ 全基因的长度, 进一步验证了重组质粒 pegfp C LacZ 已构建成功图 3 EGFP LacZ 双报告基因在 CEF 细胞中的表达 (200 ) Fig.3 TheexpresionofEGFP LacZdouble reporterinchickenembryofibroblast (a):greenfluorescenceofceftransfectedbypegfp C;(b): GreenfluorescenceofCEFtransfectedbypEGFP C LacZ(c): Histochemistryforbeta galactosidaseactivityofceftransfected bypegfp C(d):Histochemistryforbeta galactosidaseactivity ofceftransfectedbypegfp C LacZbar=20μm 图 2 重组质粒的酶切鉴定 Fig.2 Identificationofrecombinantplasmid pegfp C LacZbyrestrictionanalysis M:λ HindⅢ digestdnamarker;:pegfp CdigestedbyEcoRⅠ; 2.pEGFP C LacZdigestedbyEcoRⅠ;3:pEGFP C LacZ digestedbyecorⅠandbamhi 2.3 重组质粒在 CEF,293FT 细胞中的表达用脂质体转染法将重组质粒 pegfp C LacZ 导入 CEF,293FT 细胞中转染 48h 后, 用荧光倒置显微镜观察, 转染对照质粒 pegfp C 和重组质粒 pegfp C LacZ 的细胞均很容易观察到绿色荧光 ; 对转染细胞进行 β 半乳糖苷酶组织化学染色, 其中 pegfp C LacZ 重组质粒转染的细胞呈蓝色, 而对照质粒 pegfp C 转染的细胞呈阴性 ( 图 3, 图 4) 结果表明 pegfp C LacZ 质粒转染细胞后中既能表达 EGFP, 又能表达 LacZ, 进一步证实 LacZ 基因已经插入 pegfp C 载体, 并且能正确表达图 4 EGFP LacZ 双报告基因在 293FT 细胞中的表达 (200 ) Fig.4 TheexpresionofEGFP LacZdouble reporterin293ftcelline (a):greenfluorescenceof293fttransfectedbypegfp C;(b): Greenfluorescenceof293FTtransfectedbypEGFP C LacZ(c): Histochemistryforbeta galactosidaseactivityof293fttransfected bypegfp C(d):Histochemistryforbeta galactosidaseactivity of293fttransfectedbypegfp C LacZbar=20μm

4 68 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 讨论 GFP 是从一种能自体发光的水母 Aequoreavictoria 中分离出来的蛋白质, 它能够在紫外线的激发下发出明亮的绿色荧光 EGFP 是一种优化的突变型 GFP, 其所产生的荧光要比野生型 GFP 强 35 倍, 大大增强了该报告分子的灵敏度 [4] 而与其它常用的报告基因相比,GFP 具有性质稳定无细胞毒性灵敏性检测便捷等优点, 在荧光显微镜下, 可直接观察到活细胞中的 GFP 绿色荧光, 因此可作为研究与之融合的其他蛋白表达的报告基因近年来 gfp 基因作为一种报告基因越来越受到人们的关注, 目前也存在着许多问题如荧光强度的非线性性质使其定量非常困难 ; 紫外激发对某些 GFP 有光漂白和破坏作用, 导致荧光快速消失 ( 对组织或细胞进行绿色荧光蛋白观察时, 在紫外光下长时间照射会导致细胞的绿色荧光减弱现象 ); 多数生物具有微弱的自发荧光现象, 并有类似的激发和发射波长, 影响了某些 GFP 的检测 [8] 笔者在实验过程中, 将 egfp 基因导入鸡体内表达, 检测时发现除了因 egfp 基因表达呈现的绿色荧光外还有部分细胞出现了黄绿色荧光现象, 对于准确判断 egfp 基因的表达产生了干扰为了克服该报告基因的局限性, 保证对实验结果的准确判断, 我们在 egfp 基因的基础上再引入 β 半乳糖苷酶报告基因并构建成 EGFP LacZ 双报告基因真核表达载体 β 半乳糖苷酶在分子生物学和基因工程中是一种理想的组化标记分子 [9], 与底物反应着色后可以长时间放置并在普通显微镜下观察, 克服了 EGFP 因其在紫外光下长时间照射而导致细胞的绿色荧光减弱现象它在哺乳动物细胞酵母果蝇等细胞中的表达不表现出对宿主细胞有害性用于检测 β 半乳糖苷酶生色测定方法非常灵敏, 可以产生非扩散的颜色很亮的产物而且不易受到背景染色的干扰目前由于 β 半乳糖苷酶基因来源方便稳定产物易于检测等优点, 已被广泛用于基因研究的各个方面本研究构建的 EGFP LacZ 双报告基因为融合基因, 在真核细胞中都能表达, 更能有效指示外源基因的表达例如, 在一般情况下可利用 EGFP 方便直观地示踪外源基因的表达, 尤其是活细胞或活体观察具有很大的优势 ; 但如果观察 EGFP 时有干扰, 难以确定时, 可利用 LacZ 组织化学法指示外源基因的表达, 使结果更为准确可靠, 而且也较其他方法如表达产物的免疫组织化学法更简便 [0] McGrew 等在转基因鸡技术的研究中, 将 egfp 和 LacZ 基因构建在同一慢病毒载体上, 对转基因鸡的制作效率进行研究, 双报告基因的作用得到了很好的发 [] 挥最近,Elghazi 等利用 LacZ 和 gfp 双报告基因的小鼠模型, 较好地评估了体内丝 / 苏氨酸蛋白激酶 Akt 在发育阶段不同组织中的活性, 也显示了两个报告基因的互补性本研究将携带 egfp 基因的质粒 pegfp C,pEGFP C LacZ 通过脂质体法分别转染至 CEF,293FT 细胞中, 在荧光显微镜下对报告基因表达的蛋白进行定位观察从图 3 和图 4 的 (a) 图我们发现单一的 egfp 基因表达的绿色荧光蛋白分布于整个细胞, 其中核内的荧光亮度要高于细胞质而在图 3 和图 4 的 (b) 图, 我们发现无论是在 CEF 还是 293FT 细胞中转染 EGFP LacZ 双报告基因后, 在其细胞质中都呈现颗粒状绿色荧光现象, 而细胞核则并未出现荧光这一现象与 β 半乳糖苷酶是一种细胞质酶有关, 而颗粒状的绿色荧光则是由于该蛋白是在球形的核糖体上合成所致 [9] 重组载体中 EGFP LacZ 为融合基因, 表达的产物为融合蛋白 EGFP 本身无特定的胞质定位序列, 但在核中的分布略强, 我们推测与 EGFP 中含弱化的核定位序列有关 [2], 但由于 β 半乳糖苷酶是一种细胞质酶, 且分子量较 EGFP 大, 因而 EGFP LacZ 融合蛋白就主要在胞质中分布了, 这也赋予了该载体一个新的特征不过,β 半乳糖苷酶在细胞质中定位是相对的, 在 LacZ 基因 3 末端接入一个编码猴病毒 40(SV40) 大 T 抗原信号肽的核定位序列后, 该基因就可以在细胞核中定位表达 [9] 本研究用构建好的重组质粒分别对 CEF 和 293FT 细胞转染但不论从绿色荧光还是组织化学染色结果来看,293FT 细胞的转染效率要远高于 CEF 细胞, 表明细胞的类型和特性与转染效率密切相关, 因为实验所用两种细胞的来源和性质完全不同,CEF 是来自于鸡胚的天然成纤维细胞, 而 293FT 则是一种改造过的人胚肾细胞双报告基因在两种细胞中均能正确表达, 也揭示了该载体具有较为广泛的适用性本研究构建的双报告基因真核表达载体将为分析外源基因在体内外的表达示踪提供更为准确的分子工具参考文献 []GoringDR,RosantJ,ClapofS,etal.Insitudetectionof beta galactosidaseinlensesoftransgenicmicewithagamma

5 2009,29() 刘莉等 :EGFP LacZ 双报告基因真核表达载体的构建及体外表达 69 crystalin\laczgene.science,987,235(4787):456~ 458. [2]SanesJR,RubensteinJL,NicolasJF.Useofarecombinant retrouvirustostudypost implantationlineageinmouseembryos. EMBO.986,5(2):333~342 [3]PmsherD C,EckenrodeV I,WardW W,etal.Primary StructureoftheAequoreaVictoriagreenfluorescentprotein. Gene,992,(2):229~233 [4]Cormack B P,ValdiviaR H, Falkow S. FACS optimized mutantsofthegreenfluorescentprotein(gfp).gene.996, 73(SpecNo):33~38 [5]TimmonsL,BeckerJ,BarthmaierP,etal.Greenfluorescent protein/beta galactosidase double reporters for visualizing Drosophilageneexpresionpaterns.DevGenet,997,20(4): 338~347 [6] CastroPH,OppermannM,WeisY,etal.Reportergene recombinationinjuxtaglomerulargranularandcolectingduct celsby human renin promoter Cre recombinase transgene. PhysiolGenomics,2006,25(2):277~285 [7]LeporeD A,ThomasGP,KnightK R,etal.Survivaland diferentiationofpituitarycolony formingcelsinvivo.stem Cels,2007,25(7):730~736 [8] 唐孝青, 李斌, 伍小兵, 等. 绿色荧光蛋白及其应用的研究进展. 陕西农业科学,2007,:23~25 TangX Q, LiB, Wu X B, etal. ShaanxiJournalof AgriculturalSciences,2007,:23~25 [9]J 萨姆布鲁克,DW 拉塞尔. 分子克隆实验指南. 第三版, 北京 : 科学出版社, ~46 SambrookJ,RuselD W.MolecularCloning:A Laboratory Manunal.3 rd ed,beijing:sciencepres, ~46 [0]McGrew M J, Sherman A, Elard F M, etal. Eficient production ofgermline transgenic chickens using lentiviral vectors.embo.2004,5(7):728~733 []ElghaziL,WeisA J,GouldA P,etal.Generationofa reportermouse line expresing Aktand EGF Pupon Cre mediatedrecombination.genesis,2008,46(5):256~264 [2] 刘莉, 采克俊, 张易祥, 等. 抗病毒基因 MxA 真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达. 细胞生物学杂志,2008,30 (2):20~205 LiuL,CaiKJ,ZhangYX,etal.ChineseJournalofCel Biology,2008,30(2):20~205 ConstructionoftheExpresionVectorwithDoubleReportGeneof EGFP LacZandItsExpresioninVitro LIULi ZHOUZheng CAIKe jun ZHANGYi xiang HEPai CAOFang 2 (SchoolofLifeSciences,HuzhouTeachersColege,Huzhou 33000,China) (2ColegeofLifeSciences,SuzhouUniversity,Suzhou 25006,China) Abstract TheaimofthestudywastoconstructtherecombinantvectorwithdoublereportgeneofEGFP LacZwhichwasexpresedineukaryoticcels.LacZgenewasamplifiedbyPCRwithpLenti6/V5 LacZplasmid astemplate.thepcrproductsoflaczgeneweredigestedbyrestrictionenzymesofecorⅠ andbamhⅠ,and linkagedwitheukaryoticexpresionvectorpegfp C.Therecombinantplasmid,namedpEGFP C LacZ,was identifiedbypcrandrestrictionanalysis.pegfp C LacZwasthansfectedintotheeukaryoticcelsof293FT andchickenembryofibroblast(cef)bylipofectin.theexpresionofegfp LacZdoublereportgenewas detectedbyobservingthegreenfluorescenceandstainingforbeta galactosidaseactivity.greenfluorescencewas detectedby fluorescence microscope in transfected cels. Moreover, the positive celwas observed by histochemistryofbeta galactosidaseactivity.thedataindicatedthatpegfp C LacZcontainingEGFP LacZ doublereportgenehasbeenconstructedandexpresedineukaryoticcelssuccesfuly.theresultswould contributetoovercomethelimitationsanduncertaintycausedbyusingofsinglereportgeneasmolecularmarker. Keywords LacZ Greenfluorescentprotein Doublereportgene Eukaryoticexpresion

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

66 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.2009 DH0B 293FT 细胞均由湖州师范学院细胞研究所实验室提供..2 试剂限制性内切酶 EcoRⅠ BamHⅠ DNA marker T4DNALigase Taq 酶 质粒小量提取试剂盒 胶回收试剂盒均为 T

66 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.2009 DH0B 293FT 细胞均由湖州师范学院细胞研究所实验室提供..2 试剂限制性内切酶 EcoRⅠ BamHⅠ DNA marker T4DNALigase Taq 酶质粒小量提取试剂盒胶回收试剂盒均为 T